Tài liệu Nghiên cứu, phát triển chế phẩm sinh học từ nấm chaetomium nhằm phòng trừ nấm gây bệnh trên cây chè

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- Nguyễn Thị Kim Oanh NGHIÊN CỨU, PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM CHAETOMIUM NHẰM PHÒNG TRỪ NẤM GÂY BỆNH CHO CÂY CHÈ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI- 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- Nguyễn Thị Kim Oanh NGHIÊN CỨU, PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM CHAETOMIUM NHẰM PHÒNG TRỪ NẤM GÂY BỆNH CHO CÂY CHÈ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ THANH HUYỀN HÀ NỘI- 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới TS.Trần Thị Thanh Huyền người đã giúp đỡ tận tình và hướng dẫn trực tiếp tôi trong cả quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy giáo trong khoa sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và cung cấp những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt hai năm học vừa qua và giúp tôi rất nhiều trong việc nắm bắt kiến thức khoa học cũng như động viên tôi về mặt tinh thần. Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Phòng công tác chính trị học sinh và sinh viên, Phòng sau đại học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ này! Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Văn Thiệp cùng các cộng sự của Bộ môn Công nghệ sinh học và bảo vệ thực vật của Viện miền núi phía Bắc đã luôn tạo điều kiện về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này. Cho phép tôi giửi lời cảm ơn tới GS. Kasem Soytong đã hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi về mặt chuyên môn cũng như những kinh nghiệm thực tế giúp tôi hoàn thành bài luận văn này. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình thân yêu và bạn bè đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Hà Nội, ngày... tháng 1 năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Kim Oanh MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 4 1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM CHAETOMIUM .................................................. 4 1.1.1. Giới thiệu chung về nấm Chaetomium .................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái của nấm Chaetomium .............................................. 4 1.1.3. Đặc điểm phân bố của nấm Chaetomium ................................................ 5 1.1.4. Yếu tố dinh dưỡng, sinh trưởng và phát triển của nấm Chaetomium ..... 5 1.1.5. Hoạt tính cơ bản của nấm Chaetomium .................................................. 7 1.1.6. Đặc điểm phân loại của nấm Chaetomium .............................................. 8 1.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ CHẾ PHẨM SINH HỌC ......................... 13 1.2.1. Những nghiên cứu ngoài nước .............................................................. 13 1.2.2. Những nghiên cứu trong nước .............................................................. 16 1.3. ĐẠI CƢƠNG VỀ CÂY CHÈ ..................................................................... 18 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 21 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ................................................................................. 21 2.1.1. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 21 2.1.2. Môi trường nuôi cấy. ............................................................................. 21 2.2.3. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 21 2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ........................................................................ 21 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 21 2.3.1. Phương pháp phân lập nấm Chaetomium ............................................. 21 2.3.2. Phương pháp phân lập nấm gây bệnh ................................................... 22 2.3.3. Phương pháp xác định ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng của các chủng nấm phân lập ................................................................ 24 2.3.4. Đánh giá hoạt tính phân giải cellulose của chủng Chaetomium ........... 25 2.3.5. Phương pháp đánh giá tính đối kháng ................................................... 28 2.3.6. Định danh nấm Chaetomium bằng phương pháp sinh học phân tử ..... 29 2.4. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM NẤM CHAETOMIUM .. 32 2.4.1. Nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ nấm gây bệnh ..... 32 2.4.2. Đánh giá hiệu lực phòng trừ nấm của chế phẩm trên chè ..................... 33 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 36 3.1. PHÂN LẬP NẤM ĐỐI KHÁNG VÀ NẤM GÂY BỆNH ....................... 36 3.1.1. Phân lập nấm đối kháng (Chaetomium) ................................................ 36 3.1.2. Phân lập nấm gây bệnh trên cây chè .................................................... 39 3.2. ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM ....................................................... 41 3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của nấm ....... 42 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................................ 45 3.2.3. Ảnh hưởng của ánh sáng tới sự sinh trưởng và phát triển bào tử của nấm Chaetomium ............................................................................................ 49 3.2.4. Ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của tản nấm và sản lượng bào tử của nấm Chaetomium. ..................................................................................... 50 3.3. Đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh của của nấm Cheatomium ........... 54 3.4. Xác định hoạt tính cellulase của chủng Chae 1........................................ 56 3.5. ĐỊNH DANH NẤM CHAETOMIUM ..................................................... 56 3.6. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM CHAETOMIUM ............. 58 3.6.1. Nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ nấm gây bệnh ..... 58 3.6.2. Đánh giá hiệu lực phòng trừ nấm của chế phẩm trên cây chè .............. 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 63 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ/cụm từ viết đầy đủ Bp Base pair (cặp nuclêôtit) CMA Cormeal Agar CMC Cacboxyl methyl cellulose DNA Deoxyribonucleic Acid ITS Internal transcribed spacer PCR Polymerase chain rection PDA Potato dextrose agar RFLP Restriction fragment length polymorphism rDNA Rebosonal Deoxyribonucleic Acid OTU Operational Taxonomic Unit DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Nồng độ pha loãng dung dịch D-glucose .................................................26 Bảng 2.2. Các công thức phối trộn ............................................................................33 Bảng 3.1: Kết quả phân lập nấm từ các mẫu đất khác nhau ....................................36 Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái các chủng Chae phân lập ..........................................38 Bảng 3.3: Một số đặc điểm hình thái của các chủng nấm gây bệnh phân lập ..........40 Bảng 3.4. Kết quả lây bệnh hại rễ do nấm Fusarium. sp ..........................................41 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến đường kính tản nấm và số lượng bào tử của Chae 1 ......................................................................................................42 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến đường kính tản nấm và số lượng bào tử của Chae 2 ......................................................................................................43 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của tản nấm bệnh Fusarium. sp ..............................................................................................................44 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng của nấm Chae1 ...................46 Bảng 3.9. Sinh trưởng của nấm Chae 2 ở môt số ngưỡng nhiệt độ khác nhau .........47 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của nấm Fusarium.sp ............48 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của ánh sáng nuôi cấy đến đường kính tản nấm của nấm đối kháng và nấm gây bệnh sau 7 ngày sau khi cấy........................................................50 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH đến đường kính tản nấm Chae1 ..............................51 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của pH đến đường kính tản nấm Chae 2 .............................52 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của nấm bệnh Fusarium sp. ..........53 Bảng 3.15. Hoạt tính đối kháng của Chae 1 và Chae 2 đối với nấm hại rễ chè sau cấy 15 ngày ...............................................................................................................55 Bảng 3.16. Kết quả tính hoạt tính cellulase của chủng Chae 1 .................................56 Bảng 3.18. Hiệu lực của chế phẩm trong nhà lưới....................................................60 Bảng 3.19. Hiệu lực của chế phẩm trên nương chè ..................................................61 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc của Chaetoglobosin C do C. globosum sản sinh ra ......................8 Hình 1.2. Sơ đồ cấu trúc gen mã hóa RNA ở vi nấm................................................10 Hình 1.3. Hình ảnh cây chè bị bệnh thối rễ...............................................................20 Hình 2.1. Đồ thị biểu diễn độ hấp phụ của đường D-glucose ở bước sóng 500 nm ....27 Hình 3.2. Quả thể nấm Chaetomium trên giấy lọc nhìn dưới kính hiển vi soi nổi sau 3 tuần bẫy nấm ..........................................................................................................37 Hình 3.3. Hình ảnh 2 chủng phân lập được chủng....................................................39 Hình 3.4: Khuẩn lạc và bào tử nấm Fusarium.sp ......................................................40 Hình 3.5. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo cho cây chè 1 tuổi.....................................40 Hình 3.6: Hình ảnh rễ của cây chè sau khi lây bệnh hại rễ của Fusarium.sp............41 Hình 3.7. Ảnh hưởng của môi trường đến đường kính tản nấm Chae 1 ...................42 Hình 3.8. Ảnh hưởng của môi trường tới đường kính tản nấm Chae 2. ...................44 Hình 3.9. Ảnh hưởng của 4 loại môi trường tới sự phát triển tản nấm Fusarium. sp phân lập .....................................................................................................................45 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới đường kính tản nấm Chae 1 ......................46 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới đường kính tản nấm Chae 2. ......................48 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới đường kính tản nấm bệnh Fusarium.sp .....49 Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH tới đường kính tản nấm Chae 1 ...............................51 Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH tới đường kính tản nấm Chae 2 ...............................52 Hình 3.15. Ảnh hưởng pH tới sự phát triển tản nấm bệnh Fusarium.sp...................54 Hình 3.16. Kết quả cấy đối kháng: ............................................................................55 Hình 3. 17. Cây phát sinh chủng loại của nấm Chae 1 .............................................58 Hình 3.18. Cây chè 1 tuổi xử lý nấm đối kháng sau 4 tháng ...................................60 1 MỞ ĐẦU Như chúng ta đã biết cây chè là một trong những cây công nghiệp chủ lực của vùng trung du miền núi phía Bắc. Theo số liệu của tổng cục thống kê diện tích chè cả nước chiếm khoảng 130 nghìn ha thì trong đó vùng miền núi phía Bắc chiếm khoảng gần 2/3. Cây chè đã góp phần tạo việc làm và là nguồn thu nhập chính cho hàng triệu lao động. Tuy nhiên, việc tăng năng xuất chè thường gắn liền với việc lạm dụng phân bón hóa học, thuốc trừ bệnh hóa học khiến bệnh hại chè cũng phức tạp hơn đồng thời gây ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái, ảnh hưởng tới sức khỏe con người. Hướng đi được quan tâm hiện nay là sự phát triển bền vững ở các khu vực trồng chè như áp dụng các biện pháp phòng trừ sinh học, đặc biệt là những chế phẩm sinh học vừa có tác dụng kháng bệnh hại lại vừa có khả năng làm tăng độ phì nhiêu trong đất, thân thiện với môi trường. Công nghệ vi sinh nói chung và chế phẩm sinh học nói riêng đã đóng góp cho nền nông nghiệp thế giới những thành tựu to lớn, nó tham gia giải quyết nhiều vấn đề như bảo vệ môi trường, nâng cao độ phì nhiêu của đất, tăng năng suất cây trồng. Trong ngành chè, chế phẩm Kaetomium của Thái Lan là chế phẩm thương mại được nghiên cứu sản xuất từ các chủng nấm Chaetomium phân lập tại Thái, có khả năng phòng trừ được nhiều loại nấm bệnh trên cây chè. Nhưng nấm đối kháng nói chung hay nấm Chae nói riêng ở những vùng sinh thái khác nhau có những đặc điểm thích nghi riêng cho từng vùng sinh thái và chỉ phát huy hiệu quả đối kháng của chúng ở những vùng sinh thái đặc trưng. Ở Việt Nam, một vài loài Chae cũng đã được phân lập và sản xuất thử thành công chế phẩm sinh học có khả năng kháng lại một số nấm bệnh trên cây trồng như: khoai tây, cam canh, hoa cúc nhật, cà chua. Nhưng chưa có nghiên cứu nào đề cập đến việc phân lập chủng Chae từ chính đất trồng chè dùng làm chế phẩm sinh học cho cây chè. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu, phát triển chế phẩm sinh học từ nấm Chaetomium nhằm phòng trừ nấm gây bệnh trên cây chè”. Để xây dựng vùng sản xuất chè an toàn, thân thiện với môi trường. 2 Nội dung chính của khóa luận bao gồm: - Thu thập, phân lập chủng Chaetomium từ đất trồng chè và xác định một số đặc điểm sinh học, sinh thái của chúng. - Phân lập nấm gây bệnh trên vùng rễ chè và xác định một số đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm gây bệnh. - Xác định ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy của nấm đối kháng và nấm gây bệnh - Đánh giá một số hoạt tính của nấm Chaetomium phân lập được như hoạt tính kháng nấm và hoạt tính phân giải cellulose. - Nghiên cứu công thức tạo chế phẩm. - Thử hoạt tính chế phẩm trên qui mô phòng thí nghiệm, nhà lưới và ở ngoài đồng ruộng. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM CHAETOMIUM 1.1.1. Giới thiệu chung về nấm Chaetomium Chi Chae thuộc Giới nấm; Nghành: Ascomycota; Lớp: Sordariomycetes; Bộ: Sordariales; Họ: Chaetomiumceae; Chi: Chaetomium. Bộ Sordariales có 120 chi và 700 loài khác nhau. Riêng chi Chae có khoảng 300 loài khác nhau [49] [38]. Các loài Chae có đặc trưng riêng là có các lông bao, còn gọi là “sợi tóc”; cellulose là vật chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát sinh bào tử. Nấm Chaetomium được tìm thấy trên nhiều loại bề mặt vật chất khác nhau ở điều kiện ấm áp và khô như: phân, rơm, giấy, hạt, mảnh vụn thực vật, lông chim….Nhưng môi trường sống chủ yếu vẫn là ở trong đất. Theo K. Soytong and Quimio các loài Chaetomium có thể được phân lập bằng phương pháp bẫy nấm bằng mảnh giấy lọc đặt trên bề mặt đất ẩm trong đĩa petri (vì nấm Chae có enzyme phân huỷ cellulose nên ta dễ dàng chọn lọc được Chaetomium). 1.1.2. Đặc điểm hình thái của nấm Chaetomium - Khuẩn lạc: phát triển nhanh trên môi trường thạch khoai tây, kích thước 69cm sau 9-10 ngày nuôi cấy. Khuẩn lạc ban đầu có màu trắng như bông, sau chuyển sang màu xám nhạt, rồi dần chuyển sang màu nâu đen do sự hình thành các thể quả ascoma. Các quả thể này có dạng hình gần cầu hoặc hình quả lê, kích thước lớn, hình thành rải rác khắp bề mặt khuẩn lạc, tạo thành đám màu nâu đen khi về già. - Sợi nấm: Sợi nấm có vách ngăn, có màu xám hoặc nâu nhạt, mọc từ môi trường và từ sợi khí sinh. - Cơ quan sinh sản: Quả thể hình quả lê phình ra ở giữa, có màu tối (đen hoặc nâu đen), có mở lỗ; có nhiều lông bao mọc xung quanh bên ngoài, kích thước 100-500 x 100 -400 µm, với các kiểu dáng và độ dày mỏng khác nhau tuỳ loài; có loại thẳng hay uốn nếp kiểu gợn sóng, loại ngoằn ngoèo kiểu ruột già, loại chỉ ngoằn ngoèo trên đỉnh sợi, loại xoăn lọn, loại đơn giản, loại phân nhánh. Quả thể lúc còn non có hình cavat đến hình gậy chứa đựng từ 4-8 bào tử màu nâu. Khi quả thể chín các nang nấm giống như cột trụ hoặc hình chùy nhú lên 4 từ đầu của quả thể, chứa các nang bào tử thẳng hoặc không thẳng hàng. Kích thước của nang nấm là 68-84 x 5-7µm. Các nang bào tử có màu, thành tế bào nhẵn, có nhiều hình dạng khác nhau (chủ yếu là hình quả chanh) với 1 lỗ mầm, kích thước 10-12 x 2.8-4 µm [30]. Bào tử bọc sinh ra từ túi bào tử hình trụ hoặc sợi nấm, kích thước bào tử 7-8 x 5-6 µm. 1.1.3. Đặc điểm phân bố của nấm Chaetomium Nấm Chae là một trong những nhóm nấm lớn nhất trong hệ vi sinh vật đất. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, và sự phân bố của chúng cũng tuân theo quy luật như các loài vi sinh vật khác. Số lượng của nấm Chaetomium chủ yếu nằm trong các tầng đất dưới. Đặc biệt ở tầng đất sâu 25-30 cm thì số lượng Chae có nhiều nhất [38]. 1.1.4. Yếu tố dinh dƣỡng, sinh trƣởng và phát triển của nấm Chaetomium  Nguồn carbon: Khả năng hấp thụ nguồn carbon khác nhau của các chủng nấm Chaetomium được ứng dụng trong việc sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng [40]. Các chủng nấm này hấp thụ tốt một số loại đường: Sacarose, glucose, fructose, xenlubioza, D- lactoza, D-maltosa, tinh bột, rỉ đường, axit malic, Larabinosa để tổng hợp năng lượng. Chúng hấp thụ kém đối với rượu, N-amylic, axit citric... [4]. Theo Bainier [14] Chaetomium sử dụng rất tốt với các loại đường fructose, sacaroza, galactoza, riboza, xenlobioza. Riêng rượu mannit, dextri và arabinoza thì ức chế sinh trưởng của nấm Chae . Nhưng cũng có những nghiên cứu cho thấy rằng, trong môi trường không cần đường thì Chaetomium vẫn phát triển tốt [51].  Nguồn nitơ (đạm): Theo K. Soytong [37], thì các loài Chaetomium hấp thụ cả hợp chất vô cơ và hữu cơ có chứa nitơ, nhưng ưa môi trường có chứa L-triptophan và L-glutamic. Prolin nhanh chóng bị phân giải bởi Chaetomium globosum và nó sử dụng các sản phẩm của quá trình phân giải đó. Các loài C. cupreum, C. globosum, C. 5 lucknowense thích hợp sử dụng đạm nitrat natri, nitrat amon chúng sử dụng kém hơn. Cũng theo K. Soytong thì có những loài hấp thụ tốt muối amon đó là C mollicellum, C. funicolum. Trên môi trường có chứa casein ức chế sinh trưởng của nhiều loài Chaetomium.  Độ ẩm: Độ ẩm tương đối là ảnh hưởng đến sự nảy mầm của bào tử và phát triển các cơ quan dinh dưỡng của nấm Chaetomium. Bào tử nấm Chae có thể nảy nầm trong một phổ độ ẩm tương đối rộng 30-100% [ 33;31;42], nhưng phù hợp nhất là 70100%. Bào tử nấm Chaetomium có thể nảy mầm cả khi ở các vùng đất khô hạn vì bản thân nó tiết ra ergosterol [33].  Nhiệt độ: Nấm Chae phát triển trong một phổ nhiệt độ rộng từ 3-520C [19] [49]. Mỗi loài Chae lại có khoảng nhiệt độ thích nghi riêng như: C. globosum, C. cupreum là 4-420C, C. lucknowense là 3-500C. Nguồn gốc xuất xứ có ảnh hưởng lớn đến khoảng nhiệt độ sinh trưởng thích hợp của nấm Chaetomium. Nếu cùng C. globosum, nhưng khi phân lập ở Trung Quốc trong vùng khí hậu ôn đới thì nhiệt độ thích hợp là 12 – 150C và phát triển tối ưu cả ở Nga, nhưng cũng loài đó khi phân lập ở Thái Lan thì nhiệt độ thích hợp là 25-300C. Khi nhiệt độ lên cao quá thì nấm Chae chậm sinh trưởng, bề mặt của chúng mấp mô, không bằng phẳng [47] [42]. Tuy nhiên nhiệt độ không ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính đối kháng của nấm Chaetomium [17;14;50].  Ánh sáng: Theo một số nhà nghiên cứu [48] [23] [21] ánh sáng có ảnh hưởng đến hoạt động và quá trình sinh trưởng của nấm Chaetomium: + Trong điều kiện tối, quá trình sinh bào tử chậm hơn trong điều kiện chiếu sáng, nhưng số lượng bào tử điềụ kiện chiếu sáng liên tục sẽ ít hơn so với điều kiện tối. + Trong điều kiện sáng xen tối thì lượng bào tử và lượng nấm sinh khối thu được là cao nhất. 6 + Trong điều kiện chiếu sáng liên tục sẽ ức chế sự tạo thành sinh khối, sự hình thành bào tử và sự tăng trưởng phát triển của sợi nấm. Nhưng thì ánh sáng không có ảnh hưởng rõ rệt đến một số chủng nấm Chaetomium [23].  pH: Là một yếu tố quan trọng liên quan đến sự sinh tồn của nấm Chaetomium. Mặc dù các loài Chaetomium khác nhau có thể phát triển ở các mức pH khác nhau, những loài cụ thể có độ pH tối ưu khác nhau, C. globosum và C. cupreum (pH 5-6), nhưng C. lucknowense (pH 3-8) [42]. 1.1.5. Hoạt tính cơ bản của nấm Chaetomium Một trong những hoạt tính cơ bản và quan trọng của loài Chaetomium là khả năng sinh enzyme ngoại bào mạnh như cellulase. Cellulase là enzyme phổ biến ở nhiều loài Chaetomium. Đây là enzyme khá quan trọng trong quá trình sống của loài nấm này. Chúng không chỉ giúp phân giải các xác thực vật tạo nguồn dinh dưỡng cho sinh trưởng và phát triển của nấm mà chúng còn tạo cơ chế để xâm nhập và phá hủy một số loại nấm gây bệnh khác bằng cách ức chế sự tổng hợp thành tế bào nấm như ức chế hình thành thành tế bào |3 - D - glucan của nấm. Đây là một trong những cơ chế cơ bản để ký sinh trên nấm bệnh của Chaetomium. Vì vậy, trong bài luận văn này xác định hoạt tính cellulase của nấm Chaetomium để đánh giá được một trong những cơ chế đối kháng của nấm Chaetomium với một số nấm gây bệnh khác. Ngoài ra, Chaetomium còn kích thích sinh trưởng của cây bằng cách tiết ergosterol làm tăng độ mùn trong đất, từ đó kích thích cây sinh trưởng làm tăng sức đề kháng cho cây . Nấm Chaetomium có khả năng sản sinh ra bào tử trong vùng đất của rễ cây trồng, có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng mạnh hơn so với nấm bệnh, nhất là trong điều kiện đất có nhiều mùn hơn. Chaetomium còn có khả năng tổng hợp được các chất hoạt hóa sinh học nhóm Mycotoxin (Chaetoglobosin Q, R, T, U) [24] và nhóm Epipolythiodioxopiperazine (Chaetoglobosin A, B, C) [27]. Đây là nhóm chất có hoạt tính kháng nấm, có khả năng 7 tiêu diệt các tế bào nấm bệnh bằng cách phá hủy màng tế bào, làm cho nguyên sinh chất bị phá vỡ ra ngoài và mất đi độc tính của nấm bệnh, kết quả là làm giảm hiệu quả của tác nhân gây bệnh cũng như mức độ nhiễm bệnh [21]. Hình 1.1: Cấu trúc của Chaetoglobosin C do C. globosum sản sinh ra 1.1.6. Đặc điểm phân loại của nấm Chaetomium 1.1.6.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống Nấm Chaetomium được chia thành nhiều loại khác nhau dựa trên các đặc điểm sau: - Hình dáng quả thể, lông bề mặt và lông bên của quả thể, chi tiết quả bào tử. Trong thực tế Chaetomium rất đa dạng về hình dáng quả thể, đa dạng của lông bao. Khi nghiên cứu nhận dạng và phân loại Chaetomium cần phải dựa trên các mẫu điển hình vì rất nhiều kết quả mô tả bị sai lệch. Hầu hết các tác giả đều dựa trên sự phân nhánh và cách cuộn xoắn của lông bao bên ngoài quả thể làm tiêu chí chính cho phân loại dựa trên đặc điểm của nang bào tử và đặc điểm của lông mao, trong khi đó Von Arx và cs [49] phát biểu rằng để có thể thành công hơn trong việc nghiên cứu phân loại loài Chaetomium dựa trên đặc điểm của nang bào tử, quả bào tử và dựa vào bề mặt thành của nang bào tử. Trong khuôn khổ chi Chaetomium, có trên 300 loài đã được nghiên cứu và mô tả. Tuy nhiên trong đó có một số chủng đã được thay đổi sau khi phân loại lại hoặc có những ý kiến về sự giống nhau của chúng từ các nghiên cứu của các tác giả khác nhau. Hiện nay còn nhiều ý kiến trong mô tả, cấu tạo thành tế bào của quả thể, về quả bào tử và nang bào tử. 8 Trong các phân loại có phân loại của K. Soytong và T.H. Quimio là có những mô tả và hình ảnh rõ ràng nhất từ quả thể, lông bao quả thể (đặc điểm của lông, sự phân nhánh của lông), hình dạng quả bào tử, hình dạng nang bào tử. Kết quả phân loại hình thái một số nấm được thể hiện trong phần phụ lục. Tuy nhiên, đến nay có một số loài đã được thay đổi sau khi phân loại lại hoặc có những ý kiến về sự giống nhau của chúng từ các nghiên cứu của các tác giả khác nhau. Hiện nay còn nhiều ý kiến trong mô tả, cấu tạo thành tế bào của quả thể, về quả bào tử và nang bào tử. Nhiều tác giả khác nhau lại có những công bố khác nhau. [31] công nhận 150 loài. Von arx and cs công nhận 92 loài. Ở Philippin T.H.Quimio và K. Soytong phân lập được 19 loài hoàn chỉnh trong tổng số 88 isolate được phân lập. Ở Thái Lan K. Soytong đã phân lập được 15 loài hoàn chỉnh trong tổng số 190 isolate. Theo Seth cần phải có các phân loại mới về Chaetomium để giảm các loài đồng nghĩa. Theo Udagawa [47] thì việc kiểm kê lại tất cả các loài đã được định danh là cần thiết. Phương pháp phân loại hiện đại có thể khắc phục những hạn chế của phương pháp phân loại theo hình thái, xác định tên loài nhanh và chính xác hơn. 1.1.6.2. Phân loại theo phương pháp hiện đại Phương pháp hiện đại phân loại Chaetomium dựa vào trình tự rRNA, hoặc rDNA (trình tự mã hoá cho rRNA) vì rDNA là vật liệu dễ thu nhận, có tính bền cao hơn RNA và xây dựng cây phân loại. Giới thiệu về vùng rDNA Những gen mã hoá rRNA được tìm thấy trong vùng rDNA, sản phẩm của những gen này (rRNA) kết hợp với những phân tử protein hình thành những ribosom có chức năng tổng hợp protein. Do nhu cầu tổng hợp protein cao, có nhiều bản sao của gen này trong các gennom khác nhau (E.coli có 7 bản sao, người có khoảng 200 bản sao trong tế bào đơn bội). Ở Eukaryote, có hai tiểu đơn vị gồm một tiểu đơn vị nhỏ (small subunit – SSU tổng hợp từ gen 18S) và một tiểu đơn vị lớn (large subunit – LSU tổng hợp từ gen 28S; 5,8S và một gen 5S, nhưng thường chỉ có gen 28S được nhắc đến như là gen tổng hợp LSU). Ribosom DNA chứa vùng 18S, ITS1 (internal transcribed spacer); 5,8S (một tiểu đơn vị ribosom nhỏ hơn trở thành một phần của LSU), ITS2, 28S và vùng IGS 9 (intergenic spacer). Vùng phiên mã 18S kết thúc tiểu đơn vị nhỏ (SSU), trong khi 28S cộng với 5,8S và một gen 5S thêm vào từ những thành phần khác của gennom hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosom RNA. Những vùng ITS được phiên mã (tổng hợp từ RNA) nhưng bị cắt trước khi rRNA hoàn thiện được hình thành, mặc dù chúng có thể có một chức năng trong sự hình thành ribosom. Ở đầu 5’ của 18S và đầu 3’ của 28S, cũng có một vùng được biết đến là ETS (external transcribed spacer). Toàn bộ vùng này bao gồm ETS-18S-ITS1-5,8S-ITS2-28S-ETS dài khoảng 13000 bp ở người và lặp lại 200 lần trong mỗi genom đơn bội, và hình thành tiền rRNA 45S. Giữa mỗi cassette của gen có một vùng gọi là IGS (intergenic spacer). Vùng này kém bảo tồn nhất của rDNA. Vùng IGS là vùng quan trọng vì chứa trình tự kết thúc phiên mã của những gen rRNA. Những gen rRNA ở sinh vật có nhân điển hình (còn được gọi là ribosomal DNA hoặc RNA) được tìm thấy ở những phần đơn vị lặp lại được sắp xếp thành cặp, nằm tại vùng chromosom. Vùng này được biết đến như vùng tổ chức nhân (NORs). Mỗi đơn vị lặp lại chứa một vùng phiên mã (có những gen rRNAs như 18S; 5,8S; 26S và những vùng phiên mã bên ngoài như ETS1 và ETS2) và một vùng không phiên mã (NTS). Trong vùng phiên mã, ITS được tìm thấy trên gen 5,8S rRNA bao gồm ITS1 và ITS2. rDNA chứa những vùng bảo tồn (18S; 5,8S; 28S) cũng như những vùng ít bảo tồn (ITS) và những vùng biến động hơn (IGS). Những vùng này có thể được sử dụng để phân tích sự đa dạng về di truyền và sự phát sinh loài của sinh vật. Trình tự của vùng này cũng được sử dụng để tìm ra và xác định sự biến thiên số lượng của nhiều loài hoặc nhóm nấm [6]. Hình 1.2. Sơ đồ cấu trúc gen mã hóa RNA ở vi nấm 10 Vùng ITS1 và ITS2 được tìm thấy giữa gen của tiểu đơn vị ribosom nhỏ (18S) và tiểu đơn vị lớn (28S) chỉ ra sự biến thiên trong cùng loài. Khuyếch đại vùng ITS này sau đó phân tích bằng các enzyme cắt giới hạn, được sử dụng để phân tích sự khác nhau của các loại nấm. Vùng ITS2 khám phá sau vùng ITS1, và vùng ITS2 có tính bảo tồn cao hơn ở một vài vùng tương đồng của vùng 18S. Vùng IGS thậm chí cho thấy sự biến động lớn hơn và IGS-RFLP (giống với ITS-RFLP) đã được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền trong cùng loài. Gen rDNA 16S mã hóa một phân tử RNA hình thành tiểu đơn vị ribosom nhỏ của vi khuẩn điển hình (thành phần protein của tế bào). Trình tự của gen này thích hợp là một mô hình phổ biến để nghiên cứu sự tiến hóa và phân loại vi khuẩn. Gen rDNA được tìm thấy ở hầu hết các dạng sống (ngoại trừ virut và prion). Các thành phần của trình tự rDNA từ những vi sinh vật có quan hệ với nhau được đánh dấu giống nhau. Điều này có nghĩa trình tự của những sinh vật thân cận đã được sắp xếp, làm cho những khác biệt dễ dàng đánh giá. Điều đó cũng có nghĩa là chỉ một vài nhóm primer PCR là cần thiết để khuếch đại gen rDNA từ bất cứ loài nấm nào. Trình tự rDNA của 16S đã được xác định cho nhiều loài. Chiều dài và trình tự của những vùng ITS của rDNA được cho rằng là vùng tiến hóa nhanh nhất và vì vậy có thể rất biến đổi. Những universal primer được thiết kế từ những vùng bảo tồn nằm hai đầu vùng ITS và vùng ITS có kích thước nhỏ (600-700bp) dễ dàng được khuếch đại bởi vì số bản sao lớn, lên tới 30.000 bản sao trên một tế bào của vùng lặp lại trên rDNA. Điều này làm cho vùng ITS trở thành một đề tài được quan tâm cho việc nghiên cứu tiến hóa phát sinh loài [14] [13] [44] cũng như những nghiên cứu về địa lý sinh vật.  Phƣơng pháp giải trình tự:  Phương pháp đọc chuỗi mã Sanger Cơ sở: dựa trên sự tổng hợp sợi DNA bổ sung của sợi cần được xác định trình tự. Trong phản ứng tổng hợp sợi bổ sung, dideoxynucleotide được bổ sung vào thành phần phản ứng. Dideoxynucleotide (ddNTP) là các deoxynucleotide đã được khử nhóm OH ở đầu 3’, khi deoxynucleotide gia nhập vào chuỗi, sự kéo dài chuỗi sẽ ngưng lại. 11  Phương pháp sử dụng máy sequencer: Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động dựa trên cơ sở phương pháp dideoxy. Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Cả hai loại prime xuôi và ngược đều được sử dụng để đọc cả hai mạch đơn DNA [1] Giải trình tự theo phương pháp tự động không phải dùng chất phóng xạ mà sử dụng các chất huỳnh quang để đánh dấu DNA, máy sequencer có thể phát hiện cùng một lúc hiện tượng huỳnh quang ở bốn độ dài sóng khác nhau.  Đọc trình tự sản phẩm PCR Có hai phương pháp đọc trình tự sản phẩm PCR: - Một là tạo ra các dòng phụ (subclone) của sản phẩm PCR sau đó đọc trình tự các subclone này. - Hai là đọc trình tự sản phẩm PCR một cách trực tiếp, đây là cải tiến quan trọng trong phân tích gennom do nhanh chóng có được trình tự của đối tượng nghiên cứu mà không cần phải xây dựng một kho lưu trữ clone.  Phƣơng pháp xây dựng cây phả hệ: * Phương pháp Neighbors-joining: Đây là phương pháp xây dựng cây phả hệ trong gói phần mềm Phylip 3.61. Phương pháp này có thể làm giảm tối thiểu tổng chiều dài của cây, phương pháp bắt đầu từ một cây có hình sao, không có nhóm OTUs (Operational Taxonomic Unit – đơn vị tiến hoá – cá thể) và chỉ có một nhánh (node) Y. Tách những cặp OTUs giống nhau nhất ra khỏi node Y và các nhánh khác bằng cách thêm một node X và nhánh trung gian nối X và Y lại. Như vậy node Y chỉ còn là node chung cho những OTUs còn lại. * Phương pháp Maximum Parsimony: Đây là phương pháp nằm trong gói phần mềm Phylip 3.61, được phát triển đầu tiên cho các trình tự protein. Nguyên tắc của phương pháp: xác định kiểu hình nhánh của cây sao cho sự thay đổi về mặt tiến hoá (sự thay thế nucleotide hay protein) là nhỏ nhất để giải thích những khác biệt được quan sát giữa các OTUs. 12 Cây sử dụng những tập ký tự rời rạc và có con đường dẫn tới những tập ký tự đó ngắn nhất là cây tốt nhất. Phương pháp này không cho ta chiều dài nhánh mà chỉ cho cách sắp xếp và thứ tự nhánh. * Phương pháp Bootstrap: Dùng để đo lường độ tin cậy của một node nào đó trong cây phả hệ. Nhưng không phải thước đo sự tốt xấu cho cây phả hệ. Chương trình sử dụng: - Clustal X: Boostrap N-J Tree. - Phylip 3.61: sepboot (tạo dữ liệu Bootstrap từ đầu vào (input) là tập tin sắp gióng cột đa trình tự có định dạng là phylip [.phy], consense (tạo cây bảo tồn trong 100 cây được tạo ra từ dữ liệu Bootstrap). Quy luật như sau: - 70-100% là tốt - 30-70% khó kết luận - 0-30% là xấu 1.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ CHẾ PHẨM SINH HỌC 1.2.1. Những nghiên cứu ngoài nƣớc Hiện nay trên thế giới, chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại được thương mại hóa nhiều hơn so với chế phẩm phòng trừ nấm sinh học. Chế phẩm sinh học được sản suất nhiều nhất là chế phẩm Bt. Smith [35] đã sản xuất công nghiệp chế phẩm này ở Mỹ với môi trường chứa 6-10% chất dinh dưỡng Chế phẩm sinh học được sử dụng để phòng trừ một số loại nấm bệnh hại lan truyền qua đất, qua hạt, qua không khí ... Trong quá trình sản xuất người ta quan tâm đến khối lượng bào tử và các độc tố nấm đóng vai trò chính trong hoạt tính diệt nấm. Trong thực tế sản xuất hiện nay đã có một vài chế phẩm phòng trừ nấm hại đã được thương mại hóa, chế phẩm được dùng rộng rãi nhất là Trichoderma. Khi sản xuất chế phẩm sinh học cần phải lựa chọn môi trường thích hợp cung cấp nguồn carbon hữu cơ để tổng hợp năng lượng, nguồn nitơ để tổng hợp protein, vitamin 13