Tài liệu Nghiên cứu khả năng ứng dụng kit realtime pcr đa mồi septifast trong chẩn đoán nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại bệnh viện nhi trung ương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- Nguyễn Minh Hằng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KIT REALTIME PCR ĐA MỒI SEPTIFAST TRONG CHẨN ĐOÁN NHIỄM TRÙNG HUYẾT Ở TRẺ EM TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƢƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- Nguyễn Minh Hằng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KIT REALTIME PCR ĐA MỒI SEPTIFAST TRONG CHẨN ĐOÁN NHIỄM TRÙNG HUYẾT Ở TRẺ EM TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƢƠNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHÙNG THỊ BÍCH THỦY PGS.TS BÙI THỊ VIỆT HÀ Hà Nội - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng LỜI CẢM ƠN Trước hết, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới: TS. Phùng Thị Bích Thủy – Trưởng khoa Nghiên cứu Sinh học phân tử các bệnh Truyền nhiễm – Bệnh viện Nhi Trung Ương. PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà– Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội. Là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám đốc Bệnh viện Nhi Trung Ương, phòng Tổ chức cán bộ, tập thể khoa Vi sinh, các anh chị và các bạn đồng nghiệp Khoa Nghiên cứu Sinh học phân tử các bệnh Truyền nhiễm - những người đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban giám hiệu, phòng đào tạo Sau đại học, các thầy, cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội, đặc biệt là các thầy, cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập. Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã cho tôi những ý kiến quý báu, giúp đỡ để tôi có thể bảo vệ thành công đề tài này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã tạo cho tôi điều kiện tốt nhất để hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 01 tháng11 năm 2016 Học viên Nguyễn Minh Hằng Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. 1 MỤC LỤC ........................................................................................................ 2 DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................. 4 DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... 5 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ......................................... 6 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4 1.1. Tổng quan về nhiễm trùng huyết .................................................................4 1.2. Dịch tễ học bệnh nhiễm trùng huyết ...........................................................5 1.2.1 Trên thế giới................................................................................................5 1.2.2. Tình hình nhiễm trùng huyết tại Việt Nam..............................................7 1.3. Nguyên nhân gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em............................................8 1.4. Cơ chế gây bệnh nhiễm trùng huyết ............................................................9 1.5. Các tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết................................................10 1.5.1. Vi khuẩn Gram âm gây nhiễm trùng huyết ...........................................11 1.5.2. Vi khuẩn Gram dương gây nhiễm trùng huyết ......................................19 1.5.3. Nấm gây nhiễm trùng huyết ...................................................................29 1.6. Phƣơng pháp sinh học phân tử realtime PCR đa mồi Septifast trong chẩn đoán nhiễm trùng huyết ở trẻ em .............................................................34 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 42 2.1 Địa điểm nghiên cứu .....................................................................................42 2.2 Thời gian nghiên cứu ....................................................................................42 2.3 Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................................42 2.3.1 Tiêu chuẩn lựa chọn ................................................................................42 2.3.2. Tiêu chuẩn loại trừ ..................................................................................42 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................42 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu..................................................................................42 Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng 2.4.2 Phương pháp lấy mẫu ..............................................................................43 2.4.3 Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................43 2.5 Phƣơng pháp cấy máu truyền thống ...........................................................45 2.6 Phƣơng pháp realtime PCR đa mồi Septifast trong chẩn đoán nhiễm trùng huyết ở trẻ em ...........................................................................................47 2.6.1 Thiết bị, sinh phẩm và hóa chất...............................................................47 2.6.2 Bảo quản và lưu trữ .................................................................................47 2.6.3 Bệnh phẩm thu nhận................................................................................48 2.6.4 Quy trình thực hiện ..................................................................................48 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................. 57 3.1. Tỷ lệ dƣơng tính với nhiễm trùng huyết bằng kỹ thuật realtime PCR đa mồi Septifast ........................................................................................................57 3.2. Tỷ lệ các tác nhân gây nhiễm trùng huyết bằng kỹ thuật realtime PCR đa mồi Septifast ...................................................................................................58 3.3. So sánh tỷ lệ phát hiện các tác nhân nhiễm trùng huyếtbằng 2 phƣơng pháp cấy máu truyền thống và realtime PCR đa mồi Septifast .....................62 3.4. Tỷ lệ trẻ nhiễm trùng huyết theo giới tính ................................................67 3.5. Đặc điểm nhiễm trùng huyết theo mùa......................................................68 3.6. Phân bố nhiễm trùng huyết theo nhóm tuổi ..............................................70 3.7. Mối liên quan giữa nhiễm trùng huyết với các chỉ số huyết học .............72 KẾT LUẬN .................................................................................................... 75 KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 77 Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng1.1 Các vi sinh vật đƣợc nêu trong danh sách xét nghiệm SeptiFast .... 38 Bảng 1.2 Các loài đại diện cho Nhóm CoNS và Streptococcusspp. .............. 38 Bảng 2.1 Giá trị baseline của mỗi bƣớc sóng ................................................. 54 Bảng 2.2 Giá trị Tm bar của mỗi bƣớc sóng .................................................. 55 Bảng 3.1 Các tác nhân nhiễm trùng huyết đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật cấy máu .................................................................................................................. 63 Bảng 3.2 So sánh các tác nhân nhiễm trùng huyết phát hiện bằng 2 phƣơng pháp ................................................................................................................. 63 Bảng 3.3 Tác nhân nhiễm trùng huyết có kết quả âm tính với cấy máu đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật realtime PCR đa mồi Septifast ................................. 64 Bảng 3.4 Phân bố nhiễm trùng huyết theo nhóm tuổi với bệnh nhi đƣợc phát hiện dƣơng tính ............................................................................................... 70 Bảng 3.5Liên quan giữa nhiễm trùng huyết và các chỉ số huyết học ............. 72 Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mối quan hệ giữa SIRS, Nhiễm trùng huyết và nguồn gốc của nhiễm trùng huyết vật chủ (Bone et al.1992) .................................................... 4 Hình 1.2 Real-time PCR với các đầu dò lai ghép gen. A: Bƣớc biến tính, B: Bƣớc ủ (đo lƣờng huỳnh quang), C: Bƣớc kéo dài, D: Kết thúc .................... 35 Hình 1.3 Kênh bƣớc sóng của vi khuẩn Gram dƣơng .................................... 36 Hình 1.4 Kênh bƣớc sóng của vi khuẩn Gram âm ......................................... 36 Hình 1.5 Kênh bƣớc sóng của Nấm ............................................................... 37 Hình 1.6 Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR đa mồi Septifast .............. 39 Hình 2.1 SeptiFastLys kit Mgrade ..................................................................... 48 Hình 2.2 Hệ thống đồng nhất mẫu MagNa Lyser .......................................... 49 Hình 2.3 SeptiFastPrep kit Mgrade ................................................................... 49 Hình 2.4 Septifast Cooling block ................................................................... 51 Hình 2.5 Hệ thống LightCycler 2.0 ................................................................ 51 Hình 2.6 Tm bar đặt đúng ở đỉnh đƣợc xác định ........................................... 55 Hình 2.7 Dữ liệu kết quả của realtime PCR đa mồi Septifast ........................ 56 Hình 3.1 Tỷ lệ dƣơng tính nhiễm trùng huyết bằng kỹ thuật Septifast .......... 57 Hình 3.2 Tỷ lệ các tác nhân gây nhiễm trùng huyết bằng kỹ thuật Septifast . 59 Hình 3.3 Tỷ lệ phát hiện các tác nhân nhiễm trùng huyết bằng hai phƣơng pháp cấy máu truyền thống và Septifast ......................................................... 62 Hình 3.4 Tỷ lệ trẻ nhiễm trùng huyết theo giới tính....................................... 68 Hình 3.5 Đặc điểm nhiễm trùng huyết theo mùa ........................................... 69 Hình 3.6 Liên quan giữa nhiễm trùng huyết và các chỉ số huyết học ............ 72 Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT NTH: Nhiễm trùng huyết ADN: Axit Deoxyribonucleic ARN: Axit ribonucleic PCR: Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) ACCP: American College of Chest Physicians SCCM: Society of Critical Care Medicine SIRS: Systemic Inflammatory Response Syndrome (Hội chứng đáp ứng viêm hệ thống) LPS: Lypopolysaccarit ITS: Internal transcribed spacer (Vùng không gian phiên mã) IC: Internal control (Nội kiểm chứng) dsADN: double-strand ADN (ADN sợi kép) CFU/ml: Colony Forming Units/ml (Số đơn vị khuẩn lạc trên 1ml mẫu) EDTA: Ethylen Diamin Tetra Acetat (Chất chống đông) TM: Thạch máu CHO: Thạch chocolate KSĐ: Kháng sinh đồ BET: Blood Extraction Tubes A.baumannii: Acinetobacter baumannii E.coli: Escherichia coli K.pneumoniae: Klebsiella pneumoniae CoNS: Coagulase negative Staphylococci Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng MỞ ĐẦU Nhiễm trùng huyết, sốc nhiễm trùng huyết và hội chứng rối loạn chức năng đa cơ quan là những tập hợp bệnh lý rất thƣờng gặp trong lâm sàng và đặc biệt nhất là trong các đơn vị hồi sức. Nhiễm trùng huyết là nguyên nhân gây tử vong cao ở bệnh nhân, theo số liệu công bố tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng huyết là 5,9 trong tổng số 100.000 trẻ, trong số đó tỷ lệ tử vong ở trẻ từ 1-4 tuổi là 0,6/100.000 và 0,2/100.000 ở trẻ từ 5-14 tuổi [43]. Chỉ riêng ở Hoa Kỳ thì mỗi năm có khoảng 750.000 ca bệnh trong số đó 215.000 trƣờng hợp tử vong, chiếm 9,3% tổng số ca tử vong tại đất nƣớc này [15]. Nhƣ vậy, đứng về số lƣợng thì tử vong do nhiễm trùng huyết tƣơng đƣơng với tử vong do nhồi máu cơ tim và cao hơn nhiều so với AIDS và ung thƣ vú. Thời gian nằm viện trung bình là 19,6 ngày và chi phí điều trị cho mỗi trƣờng hợp là 22.100 USD tức là khoảng 16,7 tỷ USD nếu tính trên toàn Hoa Kỳ [15,42]. Mặc dù có nhiều tiến bộ vƣợt bậc trong hiểu biết cơ chế sinh lý bệnh của nhiễm trùng huyết cũng nhƣ sự phát triển của các phƣơng pháp chẩn đoán điều trị song tỷ lệ bệnh nhân mắc và tử vong vì nhiễm trùng huyết trên thế giới vẫn không ngừng gia tăng và chiếm tỷ lệ không nhỏ. Tại Việt Nam, nhiễm trùng huyết là tình trạng nhiễm khuẩn nặng và gây tử vong rất cao đặc biệt là ở trẻ sơ sinh. Nhiễm trùng huyết cũng là nguyên nhân gây bệnh cảnh lâm sàng nặng nề cho bệnh nhân, làm tăng chi phí điều trị, kéo dài thời gian nằm viện đồng thời làm xuất hiện những chủng vi khuẩn kháng kháng sinh trong bệnh viện. Nhiễm trùng huyết ở trẻ em trong giai đoạn sớm có triệu chứng không rõ ràng nhƣng bệnh tiến triển rất nhanh và có nhiều biến chứng nguy hiểm nhƣ sốc nhiễm trùng, rối loạn chức năng đa cơ quan để lại di chứng nặng nề và dẫn tới gây tử vong cho bệnh nhân [38]. Ở trẻ em, đặc biệt là ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ sức đề kháng yếu, trẻ không thể uống thuốc theo đƣờng miệng, khi điều trị trẻ phải chịu nhiều các thủ thuật xâm lấn nhƣ tiêm, truyền. Vì vậy việc xác định nhiễm trùng huyết sớm sẽ làm giảm tỷ lệ tử vong cho các bệnh nhân. Hiện tại phƣơng pháp chẩn đoán nhiễm trùng huyết tại hầu hết các bệnh viện trong nƣớc kể cả tại bệnh viện Nhi trung ƣơng chủ yếu dựa vào cấy máu truyền thống. Khóa 2014 - 2016 1 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng Cấy máu là phƣơng pháp phổ biến và đƣợc coi là tiêu chuẩn vàng “gold standard” trong chẩn đoán và xác định các căn nguyên gây bệnh nhiễm trùng huyết. Thông thƣờng cấy máu đƣợc thực hiện trƣớc khi bắt đầu điều trị kháng sinh. Tuy nhiên phƣơng pháp cấy máu thƣờng có độ nhạy thấp đối với các bệnh nhân trƣớc đó đã sử dụng thuốc kháng sinh hoặc đối với những loại vi khuẩn phát triển chậm hoặc có sự tạp nhiễm. Việc điều trị kháng sinh sớm cho thấy hiệu quả lớn tới kết quả điều trị đầu ra của bệnh nhân. Ngƣời ta tính rằng với mỗi 1 giờ chậm điều trị kháng sinh thì trung bình giảm 8% khả năng sống sót của các bệnh nhân [23]. Khi mà các vi sinh vật sinh trƣởng chậm đƣợc nghi ngờ, quá trình điều trị đƣợc tiến hành trƣớc khi có kết quả cấy máu, vì vậy việc phát hiện nhanh các tác nhân gây nhiễm trùng huyết sẽ cho phép điều trị kháng sinh đúng, nhanh dẫn tới làm giảm tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân [23]. Hiện nay, bên cạnh phƣơng pháp cấy máu truyền thống, một kỹ thuật mới đang đƣợc các nƣớc trên thế giới ứng dụng để sàng lọc các căn nguyên sớm bắt đầu đƣợc triển khai rộng rãi – kỹ thuật realtime PCR đa mồi (Septifast) để chẩn đoán các tác nhân gây nhiễm trùng huyết. Đây là xét nghiệm sinh học phân tử dựa trên việc phát hiện ADN của vi sinh vật trong máu bệnh nhân. Kỹ thuật realtime PCR đa mồi có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn và thời gian cho kết quả ngắn hơn (chỉ trong 5h), đồng thời có khả năng phát hiện cùng lúc 25 loại căn nguyên gây bệnh phổ biến trong nhiễm trùng huyết bao gồm vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli, Klebsiella (pneumonia/oxytoca), Serratia marcescens, Enterobacter (cloacae/aerogenes), Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia; vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus, CoNS (Coagulase negative Staphylococci(-S.epidermiils, S.haemolyticus), Streptococcus pneumonia, Streptococcus spp. (S.pyogenes, S.agalactiae, S.mitis), Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis) và các chủng nấm: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida glabrata, Aspergillus fumigates. Sử dụng kỹ thuật realtime PCR đa mồi đƣợc xem là phƣơng pháp ƣu việt Khóa 2014 - 2016 2 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng vì có thể chẩn đoán các vi sinh vật gây bệnh mà phƣơng pháp cấy máu cho kết quả âm tính do bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trƣớc khi cấy máu. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu khả năng ứng dụng kit realtime PCR đa mồi Septifast trong chẩn đoán nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại bệnh viện Nhi Trung Ƣơng” với mục tiêu nhƣ sau: - Xác định tỷ lệ và các căn nguyên gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em bằng phƣơng pháp realtime PCR đa mồi (Septifast) tại bệnh viện Nhi Trung ƣơng. - Tìm hiểu tính ƣu việt của kỹ thuật Septifast so với phƣơng pháp cấy máu truyền thống trong chẩn đoán căn nguyên nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại bệnh viện Nhi Trung Ƣơng. Khóa 2014 - 2016 3 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về nhiễm trùng huyết Thuật ngữ nhiễm trùng huyết đƣợc giới thiệu lần đầu tiên bởi Hippocrates vào năm 660-370 BC. Năm 1865 Ignaz Semmelweis là nhà nghiên cứu đầu tiên có một cái nhìn tổng thể về bệnh này. Đến năm 1895 nhà hóa học ngƣời Pháp Louis Pasteur đã khám phá ra các vi khuẩn trong máu là nguyên nhân gây nên bệnh nhiễm trùng huyết [6]. Năm 1914, định nghĩa hiện đại đầu tiên về nhiễm trùng huyết đƣợc phát biểu bởi nhà vi trùng học ngƣời Đức Hugo Schottmuller (1867-1936): “Nhiễm trùng huyết xuất hiện khi có một ổ nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra hình thành và phát triển trong cơ thể, sau đó các nhân tố vi khuẩn này xâm nhập vào máu và gây nên các triệu chứng của bệnh” [51]. Từ đó về sau, định nghĩa nhiễm trùng huyết đã trải qua một quá trình phát triển và hoàn thiện đáng kể. Các tiêu chí chẩn đoán nhiễm trùng huyết đƣợc sử dụng nhiều nhất đƣợc phát triển bởi Bone và cộng sự [16] Năm 1991, hiệp hội ACCP (American College of Chest Physicians) và hiệp hội SCCM (Society of Critical Care Medicine) đã triệu tập một “Hội nghị đồng thuận” với mục đích cung cấp, công bố các định nghĩa về nhiễm trùng huyết và các hội chứng liên quan. Định nghĩa này đƣợc trình bày sơ lƣợc nhƣ sau [16] Hình 1.1 Mối quan hệ giữa SIRS, Nhiễm trùng huyết và nguồn gốc của nhiễm trùng huyết vật chủ (Bone et al.1992) Khóa 2014 - 2016 4 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng Nhiễm trùng(Infection): Phản ứng viêm của tổ chức với sự hiện diện của vi sinh vật hoặc sự xâm nhập của vi sinh vật vào các tổ chức bình thƣờng vốn vô trùng. Vãng khuẩn huyết(Bacteremia): Có sự hiện diện của các vi khuẩn sống trong máu. Hội chứng đáp ứng viêm hệ thống(Systemic Inflammatory Response Syndrome – SIRS): Đáp ứng viêm hệ thống của cơ thể với các tác nhân lâm sàng nặng nề khác nhau, đặc trƣng bởi sự hiện diện của ít nhất 2 trong các tiêu chuẩn sau: - Nhiệt độ cơ thể >380C hoặc < 360C - Tần số tim > 90 lần/phút - Tần số thở > 20 lần/phút hoặc PaCO2 < 32 mmHg - Số lƣợng bạch cầu máu ngoại biên > 12000 BC/mm3 hoặc < 4000 BC/mm3 Nhiễm trùng huyết(Sepsis): Hội chứng đáp ứng viêm toàn thân đƣợc gây nên do nguyên nhân vi khuẩn, siêu vi hoặc nấm. Nhiễm trùng huyết nặng(Severe sepsis): Nhiễm trùng huyết kèm với rối loạn chức năng cơ quan, giảm tƣới máu. Giảm tƣới máu và bất thƣờng tƣới máu có thể bao gồm hạ huyết áp, rối loạn phân bố máu, hoặc thay đổi đột ngột tình trạng ý thức nhƣng không chỉ giới hạn ở các biểu hiện này. Sốc nhiễm trùng huyết (Septic shocks): Gây ra do nhiễm trùng huyết biểu hiện bằng hạ huyết áp, không đáp ứng với liệu trình bù dịch, đi kèm với những rối loạn về phân bố lƣu lƣợng máu hoặc biến đổi tình trạng thần kinh cấp tính. 1.2. Dịch tễ học bệnh nhiễm trùng huyết 1.2.1 Trên thế giới Nhiễm trùng huyết là một trong những căn nguyên chủ yếu gây bệnh nặng và tử vong cho ngƣời bệnh. Một khảo sát tiến cứu dựa theo mức độ của SIRS và nhiễm trùng huyết đã cho thấy rằng tỉ lệ tử vong tăng lên khi bệnh nhân có nhiều tiêu chuẩn của SIRS hoặc có nhiều biểu hiện của nhiễm trùng huyết. Tỉ lệ tử vong cao Khóa 2014 - 2016 5 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng 3% ở những bệnh nhân không có tiêu chuẩn chẩn đoán SIRS, 7% khi có hai tiêu chuẩn SIRS, 10% khi có 3 tiêu chuẩn SIRS, 17% khi có 4 tiêu chuẩn SIRS, 16% khi có biểu hiện nhiễm trùng huyết, 20% trong nhiễm trùng huyết nặng và 46% trong sốc nhiễm trùng huyết [52]. Theo thống kê cho thấy, chi phí phát sinh do nhiễm trùng huyết bệnh viện là 34508 đến 56000 USD ở Hoa Kỳ. Một nghiên cứu dịch tễ học khác cho thấy ở Bắc Mỹ tỉ lệ nhiễm trùng huyết là khoảng 3 trƣờng hợp trên 1000 dân. Tỉ lệ tử vong chung vào khoảng 30%, tăng đến 40% ở ngƣời già và lên đến 50% hoặc cao hơn ở bệnh nhân có hội chứng nhiễm trùng huyết nặng, mặc dù vậy những con số này chỉ mới phản ánh những bệnh nhân đƣợc nhập viện vào các đơn vị chăm sóc tích cực và có đầy đủ các phƣơng tiện hồi sức [53]. Tại Pháp, tỷ lệ nhiễm trùng huyết chiếm 13,7%, còn ở Ấn Độ các nhà nghiên cứu đã thống kê đƣợc tỷ lệ nhiễm trùng huyết nặng là 16,5%, tỷ lệ tử vong sau nhập viện và tử vong sau 28 ngày do nhiễm trùng huyết nặng tƣơng ứng là 65,2% và 64,6% [44]. Tại Anh, theo nghiên cứu của tác giả Harrison và cộng sự năm 2006 trên 92673 bệnh nhân nhập viện cho thấy tình trạng nhiễm trùng huyết nặng xuất hiện trong vòng 24 giờ đầu tăng từ 23,5% (1996) lên đến 28,7% (2004) và số ca tử vong tăng từ 9000 ca (48,3%) năm 1996 lên đến 14000 ca (44,7%) năm 2004 [24]. Theo nghiên cứu của Jason và cộng sự năm 2011 tại 150 khoa hồi sức tích cực của 16 quốc gia trong khu vực châu Á, tỷ lệ nhiễm trùng huyết dao động từ 5% đến 53% tùy theo từng quốc gia [25]. Ngoài ra, ở thị trấn Ile-Ife (Nigeria), nghiên cứu của 2 tác giả Komolate và Adegoke năm 2008, tỷ lệ nhiễm trùng huyết là 15 đến 20% [26]. Mặc dù có sự khác biệt về con số cụ thể của nhiễm trùng huyết theo các nghiên cứu khác nhau, nhƣng tất cả đều có một đặc điểm chung là tỉ lệ mắc ngày càng tăng rõ rệt. Tỉ lệ mắc mới (incidence) tăng khoảng 1,06 lần trên 1000 bệnh nhân/ngày đến 16 đến 260 lần trên 1000 bệnh nhân/ngày. Có nhiều yếu tố khác nhau chịu trách nhiệm cho việc tăng cao tỉ lệ mới mắc này. Yếu tố quan trọng nhất có lẽ là sự tăng cao tỉ lệ hiện mắc (prevalence) các bệnh lý liên quan đến tình trạng suy giảm miễn Khóa 2014 - 2016 6 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng dịch, các thuốc ức chế miễn dịch hay độc tế bào, suy dinh dƣỡng, nghiện rƣợu, bệnh lý ác tính, suy thận, đái tháo đƣờng, và tăng số lƣợng các trƣờng hợp bệnh nhân ghép tạng. Các yếu tố khác có thể là việc sử dụng các dụng cụ y khoa dài ngày vào cơ thể (catheter tĩnh mạch, các dụng cụ chỉnh hình…), và đặc biệt các vi sinh vật đề kháng xuất hiện ngày càng gia tăng. 1.2.2. Tình hình nhiễm trùng huyết tại Việt Nam Tại Việt Nam, theo báo cáo của tác giả Nguyễn Văn Kính và cộng sự năm 2008, khi phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh tại Việt Nam cho thấy tỷ lệ nhiễm trùng huyết nói chung là 8% [5]. Mới đây, nghiên cứu của Vũ Đình Phú và cộng sự năm 2013, ở các khoa hồi sức tích cực của 15 bệnh viện toàn quốc, nhiễm trùng huyết chiếm tỷ lệ 10,4% [8]. Một nghiên cứu khác tại bệnh viện Bạch Mai năm 2008 của tác giả Đoàn Mai Phƣơng và cộng sự đã phân lập các tác nhân gây nhiễm trùng huyết cho thấy tỷ lệ dƣơng tính là 8,1%, trong đó vi khuẩn Gram âm chiếm 71,9%, vi khuẩn Gram dƣơng chiếm 23,4% và nấm chiếm 4,7% [9]. Tại bệnh viện Trung ƣơng Huế, tỷ lệ nhiễm trùng huyết do E.coli chiếm 35,1%, K.pneumonie chiếm 14,9% [1]. Năm 2010, tác giả Phạm Thị Ngọc Thảo và cộng sự đã tổng hợp các tác nhân gây nhiễm trùng huyết thƣờng gặp nhất bệnh viện Chợ Rẫy là Acinerobacter baumanii và Pseudomonas aeruginosa, chiếm 40,5% các trƣờng hợp mắc bệnh [10]. Cũng theo một nghiên cứu cắt ngang tại đại học Y dƣợc thành phố Hồ Chí Minh phân tích 130 trẻ sơ sinh dƣới 1 tháng tuổi điều trị tại Bệnh viện Nhi Đồng 1 với chẩn đoán nhiễm trùng huyết sơ sinh dựa trên kết quả cấy máu dƣơng tính cho thấytác nhân gây bệnh nhiễm thƣờng gặp nhất là Klebsiella sp. (36,9%), tiếp đến là Staphylococcus sp.(26,9%) và Acinetobacter sp. (10,8%) [3]. Một nghiên cứu khác tại Bệnh Viện Nhi Trung ƣơng tiến hành trên 303 bệnh nhi đƣợc chẩn đoán nhiễm trùng huyết cho thấy các tác nhân chiếm tỷ lệ cao nhất làKlebsiellasp. (25,7%), Pseudomonas(14,3%) và Staphylococcus (14,3%) tiếp theo là E.coli (11,4%Acinetobacter (8,6%) [7]. Khóa 2014 - 2016 7 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng 1.3. Nguyên nhân gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em Nhiễm trùng huyết có thể tiến triển nhƣ một biến chứng của nhiễm trùng tại chỗ hoặc có thể sau cƣ trú và xâm nhập niêm mạc bởi các vi khuẩn gây độc. Các trƣờng hợp có nguy cơ nhiễm trùng toàn thân là trẻ có thƣơng tích nghiêm trọng, trẻ đang dùng liệu pháp kháng sinh dài ngày, trẻ suy dinh dƣỡng. Ngoài ra, trẻ suy giảm miễn dịch (dùng thuốc ức chế miễn dịch hoặc corticosteroid, trẻ suy giảm miễn dịch bẩm sinh hay mắc phải) cũng làm tăng nguy cơ nhiễm trùng, bao gồm nhiễm khuẩn toàn thân và sốc nhiễm khuẩn. Tác nhân nhiễm trùng liên quan đến nhiễm khuẩn toàn thân thay đổi theo tuổi và tình trạng miễn dịch của trẻ. Những trƣờng hợp nhiễm trùng huyết trƣớc khi sinh thƣờng là do trong thời gian mang thai, mẹ bầu mắc các tác nhân vi sinh vật nhƣ rubella, toxoplasmosis, cytomegalovirus, herpes simplex virus, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu… Những tác nhân gây bệnh này sẽ thông qua nhau thai và gây ảnh hƣởng đến hệ tuần hoàn máu của trẻ. Nhiễm trùng khi sinh: thời gian sinh nở kéo dài, màng thai vỡ sớm… vi khuẩn xâm nhập vào khoang màng ối qua đƣờng sản đạo, thai nhi có thể hít phải hoặc nuốt nƣớc ối bẩn vào trong bụng gây viêm phổi, viêm dạ dày và phát triển thành nhiễm trùng máu, cũng có thể do khử trùng không tốt, khiến vi khuẩn trực tiếp xâm nhập vào máu từ những chỗ bị thƣơng trên niêm mạc da. Trẻ thƣờng mắc bệnh khi ngƣời mẹ mang thai nhiễm trùng trƣớc khi sinh và lúc sắp sinh, sinh nở bất thƣờng, viêm rốn, tổn thƣơng niêm mạc da và từng bị nhiễm trùng. Nhiễm trùng sau khi sinh: vi khuẩn có thể xâm nhập vào tuần hoàn máu qua các con đƣờng nhƣ niêm mạc da, đƣờng hô hấp, đƣờng tiêu hóa, đƣờng tiết niệu, rốn cũng là nơi vi khuẩn dễ xâm nhập nhất. Khóa 2014 - 2016 8 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng Ở trẻ sơ sinh thƣờng do Streptococcus nhóm B, E.coli, Klebsiella, Enterococcus, Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Anaerobe clostridium, Staphylococcus aureus. Ở trẻ ngoài sơ sinh, hay gặp do Staphylococcus aureus, Streptococcus nhóm A và B, Streptococcus pneumoniae, Meningococcus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Hemophilus influenzae. Ngoài ra có thể do Candida albicans. Đối với trẻ suy giảm miễn dịch cũng có tác nhân gây bệnh giống nhƣ trẻ bình thƣờng, tuy nhiên tùy tình trạng chúng có thể nhiễm trùng huyết do các vi khuẩn thêm vào. Bệnh nhi giảm bạch cầu có nguy cơ nhiễm trùng do vi khuẩn Gram âm (Pseudomonas aeruginosa)và cytomegalovirus. Bệnh nhi suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) có nguy cơ cao của nhiễm trùng huyết do Streptococcus pneumoniae, P.aeruginosa, S.aureus và Hemophilusinfluenza type B. Bên cạnh đó, nhiễm trùng bệnh viện cũng là một nguy cơ cao với bệnh nhi suy giảm miễn dịch. Catheter động mạch và tĩnh mạch, catheter tiết niệu, và ống nội khí quản là những đƣờng vào gây nhiễm trùng bệnh viện. Nhiễm trùng vi khuẩn Gram âm (Pseudomonas, Acinetobacter, Klebsiella, Serratia, Enterobacter, E.coli..) và nấm (Candida, Aspegillus) thƣờng gặp ở bệnh nhi suy giảm miễn dịch và nằm viện dài ngày. Nhiễm khuẩn toàn thân đa chủng xảy ra ở những trƣờng hợp trẻ có nguy cơ cao và có liên quan đến catheter, bệnh tiêu hóa, giảm bạch cầu và bệnh ác tính. 1.4. Cơ chế gây bệnh nhiễm trùng huyết Nhiễm trùng huyết là một quá trình phức tạp. Quá trình này đƣợc bắt đầu bởi sự hiện diện của vi khuẩn trong máu, đáp ứng đầu tiên của cơ thể là huy động những tế bào viêm, đặc biệt là bạch cầu đa nhân trung tính và đại thực bào đến vị trí nhiễm khuẩn. Những tế bào viêm này phóng thích những chất gây viêm vào tuần hoàn, quan trọng nhất là các cytokines, kích hoạt những hóa chất trung gian khác gây nên đáp ứng toàn thân. Sự tổng hợp hóa chất trung gian ngày càng nhiều và nếu không Khóa 2014 - 2016 9 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng đƣợc kiểm soát, nhiễm trùng huyết sẽ xảy ra. Độc tố đƣợc phóng thích kéo dài, đáp ứng viêm cũng sẽ kéo dài cùng với sự hoạt hóa chất trung gian gây tổn thƣơng mô, sốc, suy đa cơ quan hoặc nguy hiểm hơn dẫn đến tử vong.. Nhiễm trùng huyết là quá trình diễn ra trong nội mạch. Khi mô bị tổn thƣơng hay bị viêm, các cytokines tiền viêm hay kháng viêm sẽ đƣợc phóng thích. Hậu quả quan trọng của phản ứng viêm là tổn thƣơng nội mạch, rối loạn chức năng vi tuần hoàn, giảm tình trạng cung cấp oxy cho mô và tổn thƣơng cơ quan. Hậu quả của quá trình kháng viêm là tình trạng giảm năng lƣợng và ức chế miễn dịch. Song song với đó, quá trình tiền viêm và kháng viêm cũng tƣơng tác với nhau tạo nên rối loạn miễn dịch. Những cytokines kích thích phản ứng viêm gọi là cytokines tiền viêm. Bao gồm: Interleukin-1 và TNF-α, interleukin-12 và IFN-gamma, đây là những cytokines có vai trò quan trọng trong nhiễm trùng huyết và sốc nhiễm khuẩn. Ức chế các cytokines này cũng là ức chế đƣợc nhiễm trùng huyết. Các cytokines kháng viêm: là các phân tử điều hòa hoạt động của cytokines tiền viêm, chúng hoạt động thông qua các thụ thể, bao gồm: IL-4, IL-6, IL-10, IL-11, IL-13. Các cytokines quan trọng nhất trong nhiễm trùng huyết bao gồm: TNF-α, IL-1, IL6, IL-8 và IL-10. 1.5. Các tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết Nguyên nhân gây nhiễm trùng huyết do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu hoặc từ các ổ nhiễm khuẩn ở các mô tế bào, những cơ quan nhƣ: da, mô mềm, cơ, xƣơng, khớp, hô hấp, tiêu hóa... Các loại vi khuẩn thƣờng gây nhiễm trùng huyết gồm vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dƣơng. Vi khuẩn Gram âm chủ yếu là vi khuẩn đƣờng ruột họ Enterobacteriacae nhƣ:Escherichia coli, Klebsiella, Serratia và các vi khuẩn Enterobacter...; ngoài ra còn có Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia Khóa 2014 - 2016 10 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng pseudomallei. Vi khuẩn Gram dƣơng thƣờng gặp là Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus suis... Ngoài ra một trong những tác nhân không thể thiếu là Nấm : Aspergillus fumigatus, Candidaalbicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida krusei. 1.5.1. Vi khuẩn Gram âm gây nhiễm trùng huyết Vi khuẩn Gram âm là một nhóm các loại vi khuẩn không giữ đƣợc tinh thể tím khi cho phản ứng với hoá chất thử nghiệm theo tiêu chuẩn nhuộm Gram.  Có màng ngoài  Có lớp peptidoglican mỏng,ít lớp  Không có axit teicoit  Có khoang chu chất  Ít mẫn cảm với lizôxôm  Không bắt màu với thuốc nhuộm gram  Có lớp Lipopolysaccarit Con đƣờng lây nhiễm: do ổ nhiễm trùng nội tạng nhƣ đƣờng mật, tiết niệu, ổ bụng, đƣờng ruột, tử cung, nhiễm trùng bệnh viện: sau mở khí quản, đặt nội khí quản, thở máy, catheter tĩnh mạch.  Klebsiella pneumonia - Giới thiệu: Klebsiealla pneumoniae thƣờng gây bệnh nhiễm đƣờng hô hấp, một loại vi khuẩn phát triển rất tốt trong đƣờng hô hấp của ngƣời, tác nhân tạo nên “bệnh cơ hội”. Hầu hết các cơ quan đều có thể bị nhiễm trùng do Klebsiella. Nó có khả năng gây nhiễm trùng huyết, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xoang, nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu, áp xe gan... - Đặc điểm sinh học: Khóa 2014 - 2016 11 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Minh Hằng + Hình thái: Trực khuẩn ngắn, gram âm, bắt màu đậm ở hai cực,vi khuẩn có nhiều hình thể, có khi nhƣ cầu khuẩn, có khi lại hình dài, có vỏ, không di động, không sinh nha bào. + Tính chất nuôi cấy: Dễ mọc trên môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng nhƣ thạch dinh dƣỡng hay thạch máu, khuẩn lạc lầy nhầy, màu xám. Trong canh thang, vi khuẩn mọc nhanh, đục đều hoặc lắng cặn ở đáy ống nghiệm. + Cấu trúc kháng nguyên: kháng nguyên O - 5 type; kháng nguyên vỏ K - bản chất là polysaccharide, mang tính chất đặc hiệu, có 72 type, trong đó type 1 và 2 phổ biến nhất.  Serratia marcescens - Giới thiệu: Trực khuẩn hình que Gram âm, kỵ khí tùy nghi, thuộc họ Enterobacteriaceae. Loài vi khuẩn này thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất, nƣớc, thực vật và động vật. Phƣơng thức lây truyền của vi khuẩn này bằng cách trực tiếp hoặc bằng ống thông. Serratia marcescens có thể gây nên bệnh viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm màng não và áp xe não, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, nhiễm trùng mắt. Chúng xâm nhập vào thức ăn từ môi trƣờng không khí, nƣớc. - Đặc điểm sinh học: + Hình thái: trực khuẩn Gram âm, di động, khuẩn lạc có sắc tố đỏ gạch,kỵ khí tùy tiện, sinh bào tử. + Tính chất nuôi cấy: phát triển ở nhiệt độ 5-40ºC,tối ƣu ở 37ºC, pH:5-9. +Yếu tố độc lực gồm các loại enzyme sau: enzyme Catalase, enzyme Gelatinease, enzyme DNase, enzyme Esculiase.  Pseudomonas aeruginosa - Giới thiệu: Pseudomonas aeruginosa (hay còn gọi là Trực khuẩn mủ xanh) là vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con ngƣời. Nó đƣợc tìm thấy trong đất, Khóa 2014 - 2016 12