Tài liệu nghiên cứu chuyển hóa chitin /chitosan bằng phương pháp thủy phân enzyme thành vật liệu hấp thụ trong xử lí ô nhiễm môi trường

NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA CHITIN/CHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN ENZYME THANH VẬT LIỆU HẤP THỤ TRONG XỬ LÝ Ô NHIỄM MÔI TRƯỜNG Nguyễn Ngọc Lương, Nguyễn Thạc Hòa, 1Trần Thị Quý Mai, 2 Nguyễn Thị Ninh, 3Nguyễn Văn Thiết Viện Chăn nuôi; ; 1Sở Y tế Bắc Giang; 2Sở Giáo dục và Đào tạo Hưng Yên; 3 Viện Công nghệ Sinh học TÓM TẮT Thủy phân chitin/chitosan bằng phương pháp enzyme có nhiều ưu điểm hơn các phương pháp hóa học. Trong nghiên cứu này, sử dụng enzyme bromelain thu nhận từ phụ phẩm chế biến dứa để thủy phân chitin/chitosan thành vật liệu hấp phụ sinh học kích thước nano rất có hiệu quả. Sau khi nghiên cứu động học của phản ứng thủy phân chitosan bằng enzyme bromelain, đã xác định được các điều kiện tối ưu cơ bản cho quá trình là: pH = 3,5; nhiệt độ = 60oC; tỉ lệ enzyme/cơ chất là 150 ml chế phẩm enzyme cho 7,5 ml dung dịch cơ chất 0,2%. Ngoài ra còn xác định được ảnh hưởng của nồng độ các muối NaCl và (NH4)2SO4 lên hoạt tính của bromelain. Dùng bromelain thủy phân chitosan từ kích thước trung bình ban đầu là 2800 nm đã tạo ra được sản phẩm kích thước 645 nm, đạt tiêu chuẩn kích thước nano. 1. Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển nhanh về kinh tế, Việt Nam đang phải đối mặt với vấn đề ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng. Riêng trong lĩnh vực chăn nuôi, tuy nhiều giải pháp xử lý chất thải (biogas, compost có bổ sung chế phẩm VSV, dung dịch anolit, EM…) đã được nghiên cứu ứng dụng nhưng kết quả vẫn còn hạn chế (Nguyễn Thạc Hòa và cs., 2009; Trịnh Quang Tuyên và cs., 2009). Thực tiễn đang đòi hỏi phải tìm ra những giải pháp, vật liệu xử lý mới, có hiệu quả hơn nhằm giảm thiểu những tác động bất lợi của ô nhiễm môi trường tới đời sống và sản xuất, trong số đó phương pháp hấp phụ các chất gây ô nhiễm bằng vật liệu sinh học có kích thước nano đang tỏ ra có ưu thế cao và được ứng dụng nhiều trên thế giới. Chitin/chitosan thu nhận từ vỏ các loài giáp xác, chủ yếu từ tôm, cua,… đã được ứng dụng rộng rãi trong dược học, y học, công nghiệp, nông nghiệp, công nghệ sinh học… Nhờ có nhiều nhóm chức –OH nên phân tử chitin/chitosan có độ thấm nước cao, khả năng bắt giữ và hấp phụ tốt (Dutta P.K và cs., 2004). Ngoài ra, do chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tử Oxygen và Nitrogen còn cặp electron chưa sử dụng nên chúng có khả năng tạo phức, phối kết với hầu hết các kim loại nặng và kim loại chuyển tiếp như: Hg2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+… (Vũ Công Phong., 2009). Sản xuất chitin, chitosan làm vật liệu hấp phụ có kích thước nano dùng trong xử lý ô nhiễm môi trường đã được nhiều tác giả nghiên cứu (Zielinska K và cs., 2010; Ramirez M A và cs., 2010; Lora M A và cs., 2008 Kim S H và cs., 2006; Schmuhl R và cs., 2001; Davila M G và cs., 1991;…). Do quá trình thủy phân để tạo kích thước nano hiện nay chủ yếu là sử dụng phương pháp hóa học (acid HCl đặc) và còn tồn tại một số nhược điểm như cắt mạch không định hướng, có nhiều sản phẩm phụ, khó tinh chế, chi phí tốn kém, hiệu suất thấp, gây ô nhiễm môi trường và sản phẩm có hoạt tính không cao nên nghiên cứu thủy phân chitin/chitosan bằng phương pháp enzyme là một hướng đi có nhiều triển vọng vì điều kiện phản ứng mềm, dễ dàng điều khiển được quá trình, sạch và thân thiện với môi trường. Dễ dàng thu nhận được từ phụ phẩm chế biến dứa, bromelain được coi là một nguồn enzyme sẵn có tại Việt Nam với giá thành rẻ hơn rất nhiều so với các enzyme đặc hiệu thủy phân chitosan khác như chitinase và chitosanase. Không dừng lại ở mục tiêu tạo được vật liệu có kích thước nano từ chitin/chitosan, các nghiên cứu của chúng tôi sẽ góp phần sử dụng hiệu quả/triệt để hơn nguồn phế phụ phẩm chế biến nông/ thủy hải sản (vỏ tôm, cua; ngọn vỏ, bã dứa,…), giảm thiểu ô nhiễm môi trường sinh thái do các hoạt động này gây ra. Báo cáo này trình bày kết quả “Nghiên cứu chuyển hóa chitin/chitosan bằng phương pháp thủy phân enzyme thành vật liệu hấp phụ trong xử lý ô nhiễm môi trường”. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu - Chitin/chitosan thành phẩm (từ vỏ tôm, cua,…) - Enzyme Bromelain (từ vỏ dứa) 2.2. Hóa chất và thiết bị Hóa chất: Acid acetic, NaCl, KOH, (NH4)2SO4 Trong tất cả các thí nghiệm mẫu chitosan được pha trong dung dịch acid acetic 1% hoặc trong các dung dịch đệm acetate có pH trong vùng từ 2 đến 6 được chuẩn bị từ dung dịch acid acetic 1% này. Thiết bị: Nhớt kế Otwan, nhiệt kế, máy đo pH, máy khuấy từ, máy ổn nhiệt, ống đong, pipet các loại,… 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp tách chiết chitin từ vỏ tôm, vỏ cua và chuyển hóa chitin thành chitosan Chitin được tách chiết từ vỏ tôm hay vỏ cua bằng phương pháp enzyme và phương pháp hóa học, sau đó được chuyển hóa thành chitosan bằng phương pháp xử lí với dung dịch kiềm đặc có đun sôi (Alves M. N. và cs., 2008). 2.3.2. Các phương pháp nghiên cứu động học thủy phân chitin/chitosan bằng bromelain Động học quá trình thủy phân chitin/chitosan do bromelain xúc tác được nghiên cứu chi tiết bằng phương pháp đo độ nhớt của dung dịch cơ chất (chitosan). Nguyên lí: chitosan là một biopolymer dài mạch thẳng không phân nhánh, do đó các dung dịch chitosan có độ nhớt rất cao. Ngoài các yếu tố như nhiệt độ, lực ion, áp suất…, độ nhớt các dung dịch của chitosan nói riêng, của các polymer mạch thẳng nói chung phụ thuộc rất lớn vào nồng độ của dung dịch, và đặc biệt là vào độ dài của mạch polymer. Vì vậy chỉ cần cắt một vài liên kết bên trong mạch polymer là độ nhớt của dung dịch đã giảm đi rất nhiều, đây chính là cơ sở để xác định kích thước hay khối lượng phân tử trung bình của các polymer đa phân tán. Do độ nhớt của các dung dịch polymer có thể đánh giá thông qua đo thời gian chảy một lượng nhất định các dung dịch này qua mao quản của nhớt kế nên việc xác định độ nhớt của các dung dịch polymer được quy về đo thời gian chảy các dung dịch của chúng qua nhớt kế và trong nghiên cứu này nhớt kế Otwan được lựa chọn sử dụng. Động học của phản ứng thủy phân chitosan bao gồm các bước sau: - Khảo sát thời gian chảy (t, s) hay biến đổi thời gian chảy (Dt, s) (tức là độ nhớt) của dung dịch cơ chất trong hỗn hợp phản ứng tại các thời điểm khác nhau dọc theo tọa độ của phản ứng (T, min), tương đương với động học P – t (tích lũy sản phẩm theo thời gian); - Nghiên cứu mối phụ thuộc tốc độ thủy phân (sự biến đổi của thời gian chảy t hay độ nhớt) vào nồng độ của cơ chất (ở đây là chitosan), tương đương với động học bão hòa enzyme bởi cơ chất (động học P – [S]); - Nghiên cứu mối phụ thuộc tốc độ quá trình thủy phân (hay thời gian chảy hoặc sự biến đổi độ nhớt) vào nồng độ của enzyme (động học P – [E]); - Nghiên cứu mối phụ thuộc của quá trình thủy phân vào pH (xác định giá trị pH tối ưu), nhiệt độ, lực ion… 2.3.3. Phương pháp đo độ nhớt và xác định kích thước phân tử của các polymer thẳng Việc đo độ nhớt của một dung dịch được quy về đo thời gian chảy của nó trong nhớt kế. Để đạt được mục đích này, cần chuẩn bị một seri dung dịch chitosan có nồng độ nhỏ hơn 0,1% (trong vùng từ 0,005 đến 0,1%) trong dung dịch acid acetic 1%, sau đó đo thời gian chảy của các dung dịch này (kí hiệu là t, s) và của dung môi (acid acetic 1%, kí hiệu là t0, s). Từ các kết quả xác định thời gian chảy của các dung dịch này sẽ tính được độ nhớt tương đối (htđ = t/t0), độ nhớt riêng (hr = (t – t0)/t0 = htđ – 1) và độ nhớt rút gọn (hrg = hr/C). Sau đó xây dựng đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc của độ nhớt rút gọn vào nồng độ của dung dịch chitosan, đồ thị này có dạng đường thẳng y = ax + b, cắt trục tung tại b, b chính là giá trị độ nhớt đặc trưng ([h]) của mẫu chitosan được nghiên cứu. Biết độ nhớt đặc trưng của mẫu chitosan sẽ xác định được khối lượng phân tử (Mr) của nó theo công thức Mark-Houwink-Sakurada: [η] = KMrα trong đó K và α là các hằng số phụ thuộc vào bản chất của dung môi và nhiệt độ, α có giá trị trong khoảng 0,5 – 0,8 (tham khảo tài liệu chúng tôi chọn α = 0,76; K = 7,4.104 ). Công thức tính chiều dài mạch polysaccharide của chitosan và các sản phẩm thủy phân của nó: L = 0,55n ở đây L: Chiều dài của mạch polymer (nm) n: Số lượng đơn phân (monomer) cấu tạo nên polymer 2.3.4. Tiến hành thí nghiệm - Xác định kích thước ban đầu của mẫu chitosan: Chuẩn bị seri dung dịch chitosan nồng độ từ 0,005 đến 0,1 %, sau đó đo thời gian chảy của các dung dịch này và của dung môi (acid acetic 1%) từ các số liệu này tính được độ nhớt đặc trưng của mẫu chitosan, áp dụng công thức Mark-Houwink-Sakurada xác định kích thước phân tử ban đầu của mẫu chitosan cơ chất; - Nghiên cứu mối phụ thuộc tốc độ thủy phân vào nồng độ cơ chất: Chuẩn bị các dung dịch chitosan nồng độ từ 0,1 đến 0,5 % sau đó cho thêm một lượng enzyme như nhau (100µl) vào 7,5ml dịch cơ chất, lắc đều và đo ngay thời gian chảy của hỗn hợp phản ứng, tiếp theo cứ cách 5 phút lại đo 1 lần thời gian chảy của hỗn hợp phản ứng; - Nghiên cứu mối phụ thuộc tốc độ thủy phân vào nồng độ enzyme: Phản ứng thủy phân được tiến hành với dung dịch cơ chất nồng độ 0,2% và các lượng enzyme khác nhau từ 25 đến 200 µl chế phẩm enzyme cho 7,5ml dịch cơ chất. Cách đo thời gian chảy của hỗn hợp phản ứng như trên; - Trong các trường hợp: a) nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến tốc độ thủy phân, chuẩn bị seri dịch chitosan 0,2% trong đệm acetate pH từ 2,0 đến 6,0; b) nghiên cứu ảnh hưởng của lực ion lên quá trình thủy phân - chuẩn bị seri dung dịch chitosan 0,2% trong acid acetic 1% chứa NaCl nồng độ từ 25 đến 150 mM hoặc (NH4)2SO4 từ 1,25 đến 20 mM, sau đó phản ứng thủy phân trong tất cả các trường hợp được tiến hành với một lượng enzyme như nhau cho mỗi 7,5ml dung dịch cơ chất, đo thời gian chảy của hỗn hợp phản ứng như trên; - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân: Tiến hành phản ứng thủy phân ở các nhiệt độ 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oC với lượng enzyme như nhau ở nồng độ chitosan 0,2%, sau 10 phút cho dừng phản ứng, để vào ngăn đá tủ lạnh. Trước khi đo thời gian chảy lấy ra cho cân bằng với nhiệt độ phòng; 2.3. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu trong báo cáo được xử lý bằng chương trình Microsoft Excel 2003. 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1. Kết quả nghiên cứu xác định kích thước phân tử của mẫu chitosan Bảng 1. Kết quả đo thời gian chảy và tính độ nhớt của mẫu cơ chất chitosan ban đầu C, % T, s htđ hr hrg 0.01 13,4 1,2762 0,2762 27,619 0.02 17,4 1,6571 0,6571 32,857 0.03 21,2 2,0190 1,0190 33,968 0.04 27,6 2,6254 1,6254 40,635 0.05 32,9 3,1333 2,1333 42,667 0.1 79,4 7,5651 6,5651 65,651 70 ĐNRG 60 50 40 30 y = 419.93x + 23.069 20 10 C, % 0 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Hình 1. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc của hrg của mẫu chitosan vào nồng độ dung dịch của nó Trong thí nghiệm xác định khối lượng phân tử nhớt trung bình của mẫu cơ chất chitosan ban đầu, từ các số liệu đo thời gian chảy của các dung dịch nồng độ từ 0,01 đến 0,1%, đã tính được htđ, hr, và hrg của nó (bảng 1). Từ đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc của hrg và nồng độ dung dịch chitosan (hình 1) đã xác định được độ nhớt đặc trưng [h] của mẫu chitosan cơ chất này là 23,069 (giá trị b của phương trình hồi quy trên hình 1), tương ứng với Mr nhớt khoảng 820 kDa và chiều dài trung bình mạch polysaccharide của mẫu cơ chất này là ~2800 nm. Theo Dutta và cs (2004), Mr của chitosan từ một đến vài triệu dalton. Mẫu chitosan chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu có khối lượng phân tử nhỏ hơn giá trị này, nhưng vẫn chưa đạt được kích thước nano, do đó cần phải có phương pháp chuyển hóa chúng thành dạng nhỏ hơn để dùng làm vật liệu hấp phụ thì mới có hiệu quả cao. 3.2. Kết quả nghiên cứu động học quá trình thủy phân chitosan bởi enzyme bromelain 3.2.1. Kết quả nghiên cứu mối phụ thuộc vào nồng độ cơ chất tới tốc độ thủy phân Cắt mạch polysaccharide của chitosan có thể thực hiện bằng các phương pháp hóa học (HCl, HNO2) (Allan và Peyrou, 1995), vật lý (siêu âm) (Tsaih và Cheu., 2003), sinh học (enzyme) (Muzzarelli và cs., 1999). Nhiều tác giả đã chứng minh chitosan có thể được thủy phân bởi các enzyme không đặc hiệu như papain (Kumar và cs., 2005), cellulase (Wu và cs., 2004), hemicellulase (Qin và cs., 2003)... Yalpani và cs (1994); Lee và cs (2005) cho rằng dùng bromelain để thủy phân chitosan, một cơ chất không đặc hiệu với bromelain, có thể đạt được kết quả tốt. Nhằm tìm ra điều kiện tối ưu để thủy phân chitin/chitosan thành kích thước nano bằng bromelain, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu động học của quá trình thủy phân chúng. Kết quả nghiên cứu mối phụ thuộc tốc độ thủy phân vào nồng độ cơ chất được thể hiện trên hình 2. 500 t, s 400 C = 0.5 C = 0.3 C = 0.1 300 C = 0.4 C = 0.2 200 100 0 0 5 10 15 20 25 30 T, min (a) Dt, s 500 C = 0.5 C = 0.2 400 C = 0.4 C = 0.1 C = 0.3 300 200 100 0 0 5 10 15 20 25 30 T, min (b) 500 Dt, s 400 300 1' 6' 26' 31' 11' 16' 21' 200 100 [S], % 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 (c) Hình 2. Các đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc của thời gian chảy (a) và sự biến đổi của thời gian chảy (b) vào nồng độ cơ chất chitosan trong quá trình thủy phân (c) Qua hình 2 ta thấy độ nhớt của dung dịch giảm mạnh trong phút phản ứng đầu tiên, điều này chứng tỏ rằng bromelain có khả năng thủy phân chitosan khá tốt (hình 2a). Mức độ giảm trung bình của thời gian chảy ở các nồng độ cơ chất khoảng 2,84 lần so với khi chưa xảy ra phản ứng thủy phân tương đương với kết quả của Lee và cs (2005) sử dụng bromelain của hãng Sigma công bố giảm 3 lần. Nồng độ cơ chất càng cao thì sự biến đổi thời gian chảy Dt càng lớn (hình 2b). Đặc biệt là giá trị này hầu như tỉ lệ tuyến tính với nồng độ của cơ chất trong vùng khảo sát từ 0,1 đến 0,5% (hình 2c). 3.2.2. Kết quả nghiên cứu mối phụ thuộc biến đổi thời gian chảy theo nồng độ enzyme Để đánh giá khả năng thủy phân chitosan bởi bromelain, phản ứng thủy phân đã được tiến hành với các lượng (nồng độ) enzyme khác nhau. Kết quả các thí nghiệm được trình bày trên hình 3 cho thấy sự biến đổi (giảm) thời gian chảy của dung dịch cơ chất trong hỗn hợp phản ứng tỉ lệ tuyến tính với nồng độ của enzyme trong vùng từ 25 đến 150 ml dung dịch enzyme/7,5 ml dung dịch cơ chất nồng độ 0,2%. Điều này có nghĩa là để thủy phân một cách hiệu quả chitosan bằng chế phẩm bromelain cần phải sử dụng không dưới 150 ml chế phẩm enzyme này cho 7,5 ml dung chitosan 0,2%. 100 t, s 80 0,025 ml 0,050 ml 0,150 ml 0,200 ml 0,100 ml 60 40 20 T, min 0 0 5 10 15 (a) 20 25 30 35 80 Dt, s 60 40 1' 6' 11' 21' 31' 20 [E], ml 0 0 50 100 150 200 250 (b) Hình 3 Đồ thị biểu diễn động thái của thời gian chảy của dung dịch cơ chất trong quá trình thủy phân khi phản ứng được xúc tác bởi các lượng bromelain khác nhau (a) và cực đại đường cong thể hiện mối phụ thuộc của sự biến đổi độ nhớt vào nồng độ của enzyme (b) 3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên phản ứng thủy phân Để nghiên cứu mối phụ thuộc của quá trình thủy phân chitosan vào pH và xác định giá trị pH tối ưu cho quá trình này, phản ứng thủy phân chitosan bởi bromelain đã được tiến hành trong đệm acetate với pH từ 2,0 đến 6,0. Các kết quả này được trình bày trên hình 4. Theo Lee và cs (2005) thì ở giá trị pH thấp sẽ không thuận lợi cho việc hòa tan chitosan và pH khác nhau cũng gây biến đổi độ nhớt ngay cả khi không có mặt của enzyme. Dung dịch đệm acetate có thể làm giảm độ nhớt của chitosan, khi không có mặt enzyme; giảm 40% ở pH 3,98 và 12% ở pH 5,5 (Muzzarelli và cs (1999). Hình 4 cho ta thấy pH tối ưu trong phản ứng của chúng tôi là 3,5. Như vậy, pH tối ưu của bromelain mà chúng tôi thu nhận được thấp hơn so với của Lee và cs (2005) (pH 5,0) và hãng Sigma (pH 6,5). Ở những giá trị pH >5 thì thời gian chảy hay độ nhớt thay đổi không nhiều. 80 t, s 60 40 20 pH 0 0 1 2 3 4 5 6 7 (a) 40 D t, s 30 20 10 pH 0 0 1 2 3 4 5 6 7 (b) Hình 4. Mối phụ thuộc của phản ứng thủy phân chitosan do bromelain xúc tác vào pH 3.2.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường, vận tốc phản ứng enzyme tăng khi tăng nhiệt độ, nhưng vì enzyme có bản chất là protein do đó đối với mỗi enzyme thường tồn tại một nhiệt độ tối thích nhất định. Hình 5 biểu diễn mối phụ thuộc quá trình thủy phân chitosan do bromelain xúc tác vào nhiệt độ. 100 t, s 80 60 40 20 o T, C 0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 (a) 160 Dt, s 140 120 100 80 o T, C 60 20 30 40 50 60 70 80 90 100 (b) Hình 5. Mối phụ thuộc của phản ứng thủy phân chitosan do bromelain xúc tác vào nhiệt độ Các đồ thị trên hình 5 cho thấy dung dịch cơ chất trong hỗn hợp phản ứng thủy phân chitosan chảy nhanh nhất khi phản ứng được tiến hành ở 60oC (hình 5a), tương ứng với nhiệt độ tối ưu của phản ứng do bromelain xúc tác là 60oC (hình 5b). Nhiệt độ tối ưu của phản ứng do chế phẩm bromelain của chúng tôi xúc tác cao hơn so với kết quả của Lee và cs (2005) (50oC) và hãng Sigma (55oC). 3.2.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của lực ion đến phản ứng thủy phân Ngoài những yếu tố quan trọng kể trên ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme, thì lực ion (nồng độ muối) cũng ảnh hưởng tới hoạt tính xúc tác của enzyme. Vì vậy chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl và (NH4)2SO4 đến phản ứng thủy phân chitosan do bromelain xúc tác. Kết quả các nghiên cứu này được trình bày trên hình 6 đã cho thấy lực ion không chỉ làm giảm độ nhớt của dung dịch chitosan, mà còn ảnh hưởng mạnh lên quá trình thủy phân của nó do bromelain xúc tác: Các đồ thị Dt – T khi không có mặt các muối NaCl (ở nồng độ 25 – 150 mM) và (NH4)2SO4 (ở nồng độ 1,25 – 20 mM) nằm cao hơn rất nhiều so với khi có mặt muối này trong hỗn hợp phản ứng (hình 6 a & c). Các đồ thị trên hình 6b và 6d cũng cho thấy thời gian chảy của dung dịch cơ chất trong hỗn hợp phản ứng (tương ứng với ts thủy phân) giảm rất mạnh ngay cả ở các nồng độ muối rất thấp (1,25 mM đối với ammonium sulfate và 25 mM đối với NaCl). Điều này có nghĩa là các muối này ức chế quá trình thủy phân chitosan do bromelain xúc tác, và tác động ức chế của (NH4)2SO4 mạnh hơn nhiều so với NaCl. Dt, s 100 80 0 mM 75 mM 60 25 mM 100 mM 50 mM 150 mM 40 20 T, min 0 0 2 4 6 (a) 8 10 12 100 Dt, s 80 1' 6' 11' 60 40 20 [NaCl], mM 0 0 50 100 150 200 (b) Dt, s 100 80 0 5 20 60 40 1.25 10 2.5 15 20 0 0 2 4 6 10 T, min 8 (c) Dt, s 100 1' 80 6' 11' 60 40 20 [(NH4 )2 SO4 ], mM 0 0 3 6 9 12 15 18 21 (d) Hình 6. Các đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của lực ion lên quá trình thủy phân chitosan do bromelain xúc tác 3.3. Kết quả nghiên cứu thủy phân để tạo vật liệu hấp phụ kích thước nano Từ các kết quả nghiên cứu động học trình bày trên, chúng tôi tìm được các thông số tối ưu cơ bản cho phản ứng thủy phân chitosan để tạo ra vật liệu hấp phụ nano chitosan như sau: Nồng độ cơ chất 0,2%; lượng enzyme 150 µl/7,5 ml cơ chất (1,36%); nhiệt độ phản ứng 60oC, pH 3,5. Kết quả xác định kích thước phân tử trung bình của sản phẩm thủy phân chitosan trong các điều kiện này được tóm tắt trong bảng 2. Bảng 2. Kết quả đo thời gian chảy và tính độ nhớt của mẫu sản phẩm thủy phân cơ chất chitosan ban đầu trong các điều kiện tối ưu do bromelain xúc tác C, % T, s htđ hr hrg 0.01 12,733 1,213 0,213 21,270 0.02 17,233 1,641 0,641 32,063 0.03 23,733 2,260 1,260 42,011 0.04 33,867 3,225 2,225 55,635 0.05 47,667 4,540 3,540 70,794 hrg 80 70 y = 1227.9x + 7.6073 60 50 40 30 20 10 [S], % 0 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 Hình 7. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc của hrg của mẫu sản phẩm thủy phân chitosan vào nồng độ dung dịch của nó Mẫu sản phẩm thủy phân chitosan này có độ nhớt đặc trưng [h] = 7,6073, tương ứng với khối lượng phân tử nhớt trung bình là ~190 kDa và chiều dài mạch polysaccharide là ~645 nm, đạt tiêu chuẩn kích thước nano. Trên đây là các kết quả thủy phân chitosan do bromelain xúc tác. Các kết quả tương tự cũng nhận được khi thủy phân chitin đã được gel hóa bởi enzyme này. 4. Kết luận và đề nghị 4.1. Kết luận - Đã xác định được chi tiết động học phản ứng thủy phân chitin/chitosan, xúc tác bằng bromelain thu nhận từ phụ phẩm dứa, làm cơ sở để tiến hành xác lập điều kiện thủy phân tối ưu. - Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân chitin/chitosan bằng bromelain là: pH = 3,5; T = 60oC; tỉ lệ enzyme/cơ chất là 150 ml chế phẩm enzyme cho 7,5 ml dung dịch cơ chất 0,2%. Ảnh hưởng của nồng độ các muối NaCl và (NH4)2SO4 lên hoạt tính của bromelain cũng đã được xác định. - Đã tạo được vật liệu hấp phụ kích thước nano từ chitin/chitosan bằng phương pháp thủy phân enzyme để ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường. 4.2. Đề nghị Cho tiến hành làm vật liệu hấp phụ thử nghiệm với một số chất gây ô nhiễm môi trường như kim loại nặng, dư lượng các chất độc sau biogas. Được tiếp tục triển khai nghiên cứu ở mức độ cao hơn để thử nghiệm khả năng hấp phụ của sản phẩm trên một số đối tượng vật nuôi để xem khả năng miễn dịch của chúng. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Thạc Hòa, Nguyễn Ngọc Lương, Bùi Huy Hiền và cs (2009). Kết quả đánh giá khả năng sử dụng chế phẩm vi sinh vật trong xử lý nhanh phế thải rắn và nước thải sau biogas tại cơ sở chăn nuôi lợn, gà quy mô tập trung. (Báo cáo nghiệm thu đề tài trọng điểm cấp Bộ: Nghiên cứu chế phẩm vi sinh vật xử lý nhanh phế thải chăn nuôi – 2010); 2. Vũ Công Phong (2009). Những đặc điểm của chitin, chitosan và dẫn xuất. www.hoahocvietnam.com; 3. Trịnh Quang Tuyên, Nguyễn Quế Côi và cs (2009). Kết quả sử dụng dung dịch anolit để giảm thiểu mùi hôi và cải thiện môi trường chuồng nuôi tại Trạm nghiên cứu nuôi giữ giống lợn hạt nhân Tam Điệp. Báo cáo khoa học năm 2008 - Viện Chăn nuôi 2009. 4. Allan G G, Peyron M (1995). Molecular weight manipulation of chitosan. I: Kinetics of depolymerization by nitrous acid. Carbohydr. Res., Vol 277 No 2, pp. 257-272; 5. Alves M N, Mano J F (2008). Chitosan derivatives obtained by chemical modification for bio medical and environmental applications. International Journal of biological macromolecules. Vol 43, pp. 401-414; 6. Davila M G, Pena J P, Casiano J M (1991). Lindane adsorption-desorption on chitin in seawater. Intern J Enviro Anal Chem. Vol 46, pp. 175-186; 7. Dutta P K, Dutta J and Tripathi V S (2004). Chitin and chitosan: chemistry, properties and applications. Journal of scientific & industrial research. Vol. 63, pp. 20-31; 8. Kim S H, Song H, Nisola M G, Ahn J, Galera M M, Lee C H, ChungW J (2006). Adsorption of lead(II) ions using surface-modified chitins. J. Ind. Eng. Chem., Vol 12 No3, pp. 469-475; 9. Kumar A B V, Varadaraj M C, Gowda L R, Tharanathan R N (2005). Characterization of chito-oligosaccharides prepared by chitosanolysis with the aid papain and pronase, and their bactericidal action against Baccillus cereus and Escherichia coli. Biochem. J. Vol 391, pp. 167-175; 10. Lee L F, Lee W K, Maskat M Y, Illias R M, Aziz K, Kamarulzaman K, Osman H (2005). Partial depolymerization of chitosan with the aid of bromelain. Pakistan Journal of biological science. Vol 8 No1, pp. 73-77; 11. Lora M A, Brennan R A (2008). The use of crab shell chitin for biological denitrification: Batch and culumn test. Bioresource technology. Vol 100, pp. 534541; 12. Muzzarelli R A A (1997). Some modified chitosans their niche applications. Chitin hanbook. Edited by R A A Muzzarelli and M G Peter; 13. Muzzarelli R A A, Stanic V, Ramos V (1999). Enzymatic depolymerization of chitins and chitosans. Carbohydrate biotechnology protocols. C. Bucke, Ed. Humana Press; 14. Qin C, Du Y, Zong L, Zeng F, Liu Y, Zhou B (2003). Effect of hemicellulase in the molecular weight and structure of chitosan. Polymer degradation and stability. Vol 80, pp. 435-441; 15. Ramirez M A, Rodriguez A T, Alfonso L, Peniche C (2010). Chitin and its derivatives as biopolymer with potential agricultural applications. Biological applications. Vol 27 No4, pp. 270-276; 16. Schmuhl R, Krieg H M and Kaizer K (2001). Adsorption of Cu(II) ions by chitosan: Kinetics and equilibrium studies. ISSN 0378-4738=water SA Vol 27 No1, pp. 1-7; 17. Tsaih M L, Chen R H (2003). Effect of degree of deacetylation of chitosan on the kinetics of ultrasonic degradation of chitosan. J. Appl. Polym. Sci. Vol 90, pp. 3526-3531; 18. Wu G J, Tsaih G J (2004). Cellulase degradation of shrimp chitosan for the preparation of a water-solube hydrolysate with immunoactivity. Fisheries Science. Vol 76 No 6, pp. 1113-1120; 19. Yalpani M, Pantaleone D (1994). An examination of the unusual susceptibilities of aminoglycan to enzymatic hydrolysis. Carbohydr. Res. Vol 256, pp. 159-175; 20. Zielinska K, Alexandre G. C, Stanislaw T (2010). Adsorption of cadimium ions on chitosan membranes kinetics and equilibrium studies. Progress on chemistry and application of chitin and its. Vol 15, pp. 73-78.