Tài liệu Nghiên cứu chế biến glucosamin từ vỏ tôm

Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………..3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................... 5 1.1. Nguồn gốc và sự tồn tại chitin - chitosan trong tự nhiên. ................................ 5 1.2. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitin........................................................... 6 1.2.1. Cấu trúc hoá học của chitin. .....................................................................................6 1.2.2. Tính chất lý hoá của chitin. .......................................................................................8 1.3. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá sinh và độc tính của chitosan............... 8 1.3.1. Cấu trúc hoá học của chitosan. ...............................................................................9 1.3.2. Tính chất lý hoá của chitosan................................................................................ 10 1.3.3. Tính chất sinh học của chitosan. ......................................................................... 11 1.3.4. Độc tính của chitosan. .............................................................................................. 11 1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của chitin và chitosan ở Việt Nam và trên thế giới. ................................................................................ 12 1.5. Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của glucosamin. ......................................... 15 1.6. Cấu trúc hóa học, tính chất vật lý một số muối của glucosamin. ............ 17 1.6.1. Glucosamin hydroclorua.......................................................................................... 17 1.6.2. Glucosamin sulfat. ....................................................................................................... 17 1.6.3. Acetyl glucosamin. ........................................................................................................ 18 1.7. Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó. ..................... 18 1.8. Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và ở tại Việt Nam........................................................................................................................................................... 21 1.8.1. Trên thế giới. .................................................................................................................... 21 1.8.2. Ở Việt Nam. ....................................................................................................................... 23 1.9. Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl). ................................. 25 1.9.1. Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến. ..................................... 25 1.9.2. Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng. ....................................... 26 Chương II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ...................................................................................................................................................................... 27 2.1. Đối tượng nghiên cứu.......................................................................................................... 27 2.2. Phương pháp nghiên cứu. .................................................................................................. 27 Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 1 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn CHƯƠNG III : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ...................................... 29 3.1.Quy trình điều chế chitin, chitosan và glucosamin hydroclorua. .............. 29 3.2. Điều chế chitin từ vỏ tôm. ................................................................................................ 30 3.3.Điều chế chitosan bằng cách deacetyl chitin. ........................................................ 31 3.4. Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl). ...................................................... 32 3.4.1.Điều chế glu.HCl từ chitin. ..................................................................................... 32 3.4.2.Điều chế glu.HCl từ chitosan.................................................................................. 33 3.4.3. Tinh chế glu.HCl. .......................................................................................................... 34 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin. ........................................................................................................................................................ 39 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin ......................................................................................................................................................... 39 3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin. .............................................................................................................................. 40 CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................. 41 4.1. Điều chế chitin từ vỏ tôm. ................................................................................................ 41 4.1.1.Quá trình khử khoáng.................................................................................................. 41 4.1.2. Quá trình loại bỏ protein.........................................................................................41 4.1.3. Quá trình tẩy màu (loại bỏ Astaxanthin). ...................................................... 42 4.2. Điều chế chitosan. .................................................................................................................. 43 4.3. Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl)........................................................ 43 4.3.1. Điều chế glu.HCl đi từ chitin. ............................................................................... 44 4.3.2. Điều chế glu.HCl từ chitosan. ............................................................................... 45 KẾT LUẬN ...................................................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 49 Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 2 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn ĐẶT VẤN ĐỀ Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 - 80% công suất chế biến. Hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70.000 tấn/năm [3]. Nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất chitin 1, chitosan 2, glucosamin 3 và các sản phẩm có giá trị khác. Do vậy việc nghiên cứu và phát triển sản xuất các sản phẩm từ vỏ tôm là rất quan trọng, để nâng cao giá trị sử dụng phế liệu này và làm sạch môi trường. Sản phẩm chitin - chitosan đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế. Chitin có ứng dụng làm da nhân tạo và là nguyên liệu trung gian cho các chất quan trọng như chitosan, glucosamin và các chất có giá trị khác. Chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược và bảo vệ môi trường như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, thuốc kem, vải, sơn, chất bảo vệ hoa quả, bảo vệ môi trường…Với khả năng ứng dụng rộng rãi của chitin – chitosan mà nhiều nước trên thế giới và cả Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất các sản phẩm này. Glucosamin là một hoạt chất quý được sản xuất từ vỏ tôm thông qua nguyên liệu trung gian là chitin hoặc chitosan. Glucosamin chủ yếu được sử dụng trong y học chữa bệnh thoái hoá khớp. Ở người già, chức năng cũng như cấu tạo của khớp có nhiều thay đổi, các tế bào của khớp thoái hoá, trở nên kém linh động. Gân và dây chằng phân đoạn, đóng vôi, khô cằn, trở nên kém bền bỉ, kém co dãn, không chịu được căng lực và dễ bị tổn thương. Sụn trở nên đục màu, xơ hóa, gai xương, khô nước, rạn nứt với nhiều tinh thể canxi làm khớp đau. Khớp co duỗi khó khăn vì màng hoạt dịch mỏng và khô dần [1]. Trước đây, trong điều trị các bệnh thoái hóa khớp người ta thường dùng các thuốc thuộc nhóm corticoid hoặc nhóm kháng viêm giảm đau không steroid NSAID (Non - Steroidal Anti - Inflammatory Drugs), nhưng các thuốc thuộc Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 3 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn nhóm này chỉ điều trị triệu chứng và có nhiều tác dụng phụ. Với các thuốc thuộc nhóm corticoid thường gây nên các tác dụng phụ: loãng xương, viêm loét dạ dày, giảm miễn dịch…. Đối với các NSAID thì gây viêm loét dạ dày…[12]. Từ thập kỷ 90 người ta đã phát hiện ra glucosamin phục hồi được các sụn khớp, tức là chữa được căn nguyên của bệnh viêm, thoái hoá khớp [2]. Đã có nhiều công trình nghiên cứu với nhiều thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh tác dụng điều trị tận gốc bệnh thoái hoá khớp của glucosamin, nhất là dạng phối hợp với dược liệu thiên nhiên. Trên thực tế glucosamin thường được sử dụng ở các dạng: glucosamin hydroclorua 4, glucosamin sulfat 5, N - Acetyl glucosamin 6. Hiện nay thuốc chứa glucosamin đã được lưu hành trên 70 quốc gia. Tại Việt Nam, glucosamin và các thành phẩm đi từ glucosamin vẫn chủ yếu là nhập khẩu và xu thế sử dụng ngày càng nhiều. Trong khi đó nguồn nguyên liệu (vỏ giáp xác) chủ yếu để điều chế ra glucosamin thì dồi dào. Để tận dụng nguồn nguyên liệu phế thải, tạo nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất thuốc chữa bệnh thoái hoá khớp và là nguyên liệu cho việc nghiên cứu các ứng dụng khác của glucosamin chúng tôi đặt vấn đề tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm”. Mục tiêu của đề tài nhằm giải quyết các vấn đề sau : 1. Phân lập chitin – chitosan từ vỏ tôm phế thải. 2. Điều chế glucosamin hydroclorua từ chitin và chitosan.. Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 4 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn Chương I: TỔNG QUAN 1.1. Nguồn gốc và sự tồn tại chitin - chitosan trong tự nhiên Chitin - chitosan là một polysacharit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ hai sau xellulose). Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật . Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo... [13]. Chitin - chitosan là polysacharit có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác. Hình 1 : Chitin và vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 5 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin - chitosan chiếm khá cao đao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô [5]. Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan. Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với xellulose. CH2OH O 1) O CH2OH O O OH NHCOCH3 CH2OH O 2) O NHCOCH3 CH2OH O O OH NH2 CH2OH O O CH2OH O O OH O OH NH2 3) O OH O OH OH OH H×nh 2 :1) Chitin; 2) Chitosan; 3) Xellulose 1.2. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitin 1.2.1. Cấu trúc hoá học của chitin Chitin 1 có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. Người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở ba dạng cấu hình :α, β, γ - chitin [15]. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch. Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 6 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γchitin được mô tả như sau: α - Chitin β - Chitin γ - Chitin α - chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng. Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên. β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β - chitin) và hai song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro. Dạng β - chitin cũng có thể chuyển sang dạng α - chitin nhờ quá trình axetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn. Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzym hay axit HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polyme được tạo thành từ các đơn vị N-Acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-(1-4) glucozit. Công thức cấu tạo của chitin: O OH NHCH2CH3 O O HO O O O HO OH O O HO NHCCH3 NHCH2CH3 OH O 1 Tên gọi : Poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose; Poly(1-4)-2acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose. Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 7 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn Công thức phân tử: [C8H13O5N]n Phân tử lượng : Mchitin = (203,09)n 1.2.2. Tính chất lý hoá của chitin [3] Chitin có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hoặc dạng bột, không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, axit loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu …Nhưng tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat liti (LiSCN) và thioxianat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo, tan được trong hệ dimetylacetamid - LiCl 8% [4], tan trong hexafluoroisopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafluoracetone sesquihydrate (CF3COCF3.H2O) [16]. Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng 884 - 890cm-1. Chitin ổn định với các chất oxy hoá mạnh như thuốc tím (KMnO4); oxy già (H2O2); nước javen (NaOCl - NaCl)…, lợi dụng tính chất này mà người ta sử dụng các chất oxy hoá trên để khử màu cho chitin. Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 - 50%), ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan: Chitn CH2OH NaOH 40-50% OH T0cao NHCOCH3 Chitosan CH2OH OH NH2 Khi đun nóng trong axit HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt mạch thu được glucosamin: CH2OH Chitn OH NHCOCH3 HCl 36% T0cao CH2OH Glucosamin OH NH2 Phản ứng este hóa : - Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat. - Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan và N,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat. 1.3. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá sinh và độc tính của chitosan Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 8 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn 1.3.1. Cấu trúc hoá học của chitosan [3] Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan 2 là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế. Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần dung môi, hóa chất độc hại, đắt tiền. Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổi nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2. Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% gọi là chitin [13]. Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-Dglucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit. Công thức cấu tạo của chitosan: OH OH NH2 O O HO O HO O O O HO NH2 NH2 OH 2 Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; poly(1-4)-2amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose. Công thức phân tử: [C6H11O4N]n Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n Qua cấu trúc của chitin - chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt động là -OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là -OH, -NH2, do đó chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin. Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp. Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 9 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn 1.3.2. Tính chất lý hoá của chitosan [3] Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng vảy, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 - 3110C. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hoà tan được trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axit lactic…, tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan hoà tan trong dung dịch axit acetic 1 - 1.5%. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit loãng liên quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polyme) [6]. Chitosan kết hợp với aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzym. Chitosan phản ứng với axit đậm đặc, tạo muối khó tan. Chitosan tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. Một số dẫn xuất chitosan [26]: OH OH O O HO O O HO + Chitosan salts NH3 O O Na+ -O O HO O HN O NH Crosslinked Chitosan OCH2CH2SO3O O O HO NH3+ Sulfoethylchitosan OCH2COOH O O O HO NHCH2COOH N,O-carboxymethylchitosan OCH2CH2CN O O O HO NHAc Cyanoethylchitin OCS2-Na+ O O O HO NHAc Chitin xanthogenate OH OH O O O HO O N=CHR Schiff base OH O O HO OH O O O HO NH2 Chitosan NHR N-alkylchitosan O OH O HO O O NHCH2COOH N-carboxymethylchitosan OH O HO OCH2CHOHR O O O HO NHAc Hydroxyalkylchitin O O NHAc Chitin O-Na+ O O NHAc Alkalichitin O RH2CO OCH2R O O NHAc OCH2COOH O O O HO NHAc Carboxmethylchitin Alkylchitin Hình 3 : Sơ đồ các dẫn xuất đi từ chitin, chitosan. Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 10 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn 1.3.3. Tính chất sinh học của chitosan [5] Chitosan không độc, dùng an toàn cho người [18]. Chúng có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể [19], có khả năng tự phân huỷ sinh học [20]. Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u [21]. Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, hạ huyết áp [22], điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết [23]. Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptit - insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan đã được dùng để điều trị bệnh tiểu đường. Nhiều công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển các tế bào u, ung thư, HIV/AIDS, chống tia tử ngoại, chống ngứa… của chitosan [24]. 1.3.4. Độc tính của chitosan [5] Vào năm 1968, K. Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không độc, chỉ số LD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực nghiệm và người, không gây độc tính trường diễn [25]. Nghiên cứu tiêm chitosan theo đường tĩnh mạch trên thỏ, các tác giả đã kết luận: chitosan là vật liệu hoà hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệ thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da, mà còn sử dụng an toàn trong ghép mô [25]. Dùng chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch, không thấy có tích luỹ ở gan. Loại chitosan có DD ≈ 50%, có khả năng phân huỷ sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và lá lách. Nhiều tác giả đã chỉ rõ những lợi điểm của chitosan: tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hòa hợp sinh học không những đối với động vật mà còn đối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm mau liền vết thương [27]. Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 11 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn 1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của chitin và chitosan ở Việt Nam và trên Thế giới [3] Trước đây người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu sản xuất. Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua. Trong một thời gian, các chất phế thải này không được thu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường. Năm 1977 Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp. Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phần chitin sẽ được dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp [16]. Việc nghiên cứu sản xuất chitin - chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất phuc vụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta. Vào những năm 1978 đến 1980 Trường đại học Thuỷ sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitin - chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất. Gần đây trước yêu cầu xử lý phế liệu thuỷ sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin - chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin - chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp. Hiện nay ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin - chitosan như: Trường Đại Học Nông Lâm - thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm nghiên cứu polyme - Viện Khoa Học Việt Nam; Viện Hoá thuộc phân Viện Khoa Học Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm công nghệ và sinh học Thuỷ sản - Viện nghiên cứu nuôi trồng Thuỷ sản 2. Ở miền Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với Xí nghiệp thuỷ sản Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ. Ở miền Nam, Trung tâm công nghệ và sinh học thuỷ sản phối hợp với một số cơ quan khác: Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, phân Viện Khoa Học Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 12 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn Việt Nam, Viện Khoa Học nông nghiệp miền nam,… đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin - chitosan trong lĩnh vực: nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm. Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để bảo vệ các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt [7]. Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục và hàm lượng nitơ; đồng thời hàm lượng các enzym như amylaza, catalaza hay peroxidaza cũng tăng lên. Ngày nay chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ xung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng. Những ứng dụng của chitin - chitosan và những dẫn xuất của chúng ngày càng phát triển. Một số đã đưa vào ứng dụng như là: chỉ khâu tự huỷ, da nhân tạo [4], thấu kính chiết xuất, và một số ứng dụng khác còn đang nghiên cứu như: tác động kích thích miễn dịch, chống sự phát triển của khối u, đặc tính làm giảm cholesterol máu [10], trị bỏng nhiệt [11]… Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin, nó giống như một tấm vải và được bọc ốp lên vết thương chỉ một lần đến khi khỏi. Da nhân tạo bị phân huỷ sinh học từ từ cho đến lúc hình thành lớp biểu bì mới. Nó có tác dụng giảm đau, giúp cho các vết sẹo bỏng phục hồi biểu bì nhanh chóng. Trường Đại Học Dược Hà Nội, Đại Học Y Hà Nội, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ Quốc gia cũng đã chế tạo thành công loại da nhân tạo này và bước đầu ứng dụng có hiệu quả. Chitin - chitosan và các oligome của nó có đặc tính miễn dịch do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh. Những nghiên cứu gần đây hướng vào các oligome, N-acetyl-glucosamin và glucosamin, các chất này có một số tính chất của các polyme tương ứng nhưng lại có ưu thế là tan tốt trong nước do đó dễ dàng được hấp thụ. Hiện nay trên thế giới đã thành công việc sử dụng chitosan làm chất mang để cố định enzym và tế bào. Enzym cố định đã cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi enzym trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích. Enzym cố định được Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 13 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn sử dụng lâu dài, không cần thay đổi chất xúc tác. Nhất là trong công nghệ làm sạch nước, làm trong nước hoa quả, sử dụng enzym cố định rất thuận lợi và đạt hiệu quả cao. Chitosan thoả mãn yêu cầu đối với một chất mang có phân tử lượng lớn, bền vững không tan và ổn định với các yếu tố hoá học. Do có cấu trúc tương tự như xellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy. Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn. Trong sản xuất giấy qua nghiên cứu người ta thấy nếu bổ sung 1% chitosan thì độ bền của giấy tăng lên khi bị ướt hay tăng độ nét khi in [5]. Có thể thay hồ tinh bột bằng chitosan để hồ vải, nó có tác dụng làm tơ sợi bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được axit và kiềm nhẹ. Chitosan kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm, sản xuất vải col… Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô da do tính chất của chitosan là có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm –NH+4. Các nhóm này liên kết với các tế bào sừng hóa của da, nhờ vậy mà các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da chống nắng. Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả năng kết dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg… do đó chitin được sử dụng để tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm. Chitosan sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh, làm đông thực phẩm. Do chitosan có tính chất diệt khuẩn, do đó nó được tạo thành màng mỏng để bao gói thực phẩm chống ẩm mốc, chống mất nước. Đặc tính diệt khuẩn của chitosan được thể hiện trên các mặt sau : • Khi tiếp xúc với thực phẩm chitin - chitosan sẽ lấy đi từ các vi sinh vật này các ion thiết yếu, ví dụ như ion Cu2+. Như vậy vi sinh vật sẽ bị chết do sự mất cân bằng liên quan đến các ion thiết yếu. • Ngăn chặn phá hoại chức năng màng tế bào. • Gây ra sự rò rỉ các phần bên trong tế bào. Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 14 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn Như vậy việc dùng chất chitosan bao bọc quanh bề mặt thực phẩm có thể kéo dài thời gian bảo quản, giảm sự hư hỏng do khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của nó. 1.5. Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của glucosamin Khi thủy phân chitin trong môi trường axit HCl đậm đặc, các mối nối amid và osid đều bị phá hủy do đó thu được glucosamin 3 (là monome của chitosan). Yếu tố nồng độ axit và nhiệt độ thủy phân rất quan trọng, nếu nồng độ của axit không thích hợp thì quá trình deacetyl hóa và deosid chỉ dừng lại giới hạn nhất định, nếu nhiệt độ không thích hợp thì sản phẩm cuối cùng là glucosamin có thể bị giáng hóa thành những phân tử đơn giản hơn. Công thúc cấu tạo của glucosamin: NH2 OH OHC OH OH OH CH2OH H C OH O H C NH2 HO C H 3 O OH OH OH H C OH H C NH2 OH CH2OH O HO HO OH NH2 Tên UIPAC: (3R,4R,5S,6R)-3-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol Tên gọi khác: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose; 2-amino-2-deoxy-β-D- glucopyranose; chitosamine; D-glucosamine; D-(+)- glucosamine. Công thức phân tử: C6H13O5N Phân tử lượng: Mglucosamin = 179,17 Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 15 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn Hình 4 : Cấu trúc không gian của glucosamin Glucosamin là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóng chảy 880C, điểm phân hủy 1100C, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơi tan trong methanol hoặc ethanol, không tan trong ether và chloroform. Một số phản ứng của glucosamin [14]: • Phản ứng tráng bạc: Giống như glucose, glucosamin cho phản ứng tráng bạc khá rõ ràng: C5H12O4NCHO + 2[Ag(NH3)]OH 500C C5H12O4NCOONH4 + 2Ag + 3NH3 + H2O • Phản ứng với Cu(OH)2. Sản phẩm có màu xanh nhạt. CHO CHO CHNH2 CHNH2 2 CHOH + Cu(OH)2 CHOH CHO CHO CHOH CHOH CH2OH CH2OH CHO CHNH2 H OHC Cu H OHC + 2 H2O CHOH CH2OH • Phản ứng với C6H5CH=O. Phản ứng xác nhận có mặt của NH2. Bazơ Shiff tạo ra dưới dạng keo sánh màu nâu: Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 16 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn CHO CHO CHO CHNH2 CHOH + CHOH H C CHN H2SO4d CHOH 500C CHOH + H2O CHOH CHOH CH2OH CH2OH 1.6. Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý một số muối của glucosamin Trong thực tế, một số dẫn xuất của glucosamin được sử dụng làm nguyên liệu làm thuốc. 1.6.1. Glucosamin hydroclorua. Công thức cấu tạo: NH2 OH OHC OH OH OH HCl 4 Tên gọi khoa học: 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose hydrochloride; Chitosamine hydrochloride; D-glucosamine hydrochloride; D-(+)-glucosamine hydrochloride. Công thức phân tử: C6H13O5N.HCl Phân tử lượng: Mglucosamin.HCl = 215.63 Glucosamin hydroclorua là chất rắn dạng tinh thể màu trắng, không mùi. Điểm nóng chảy 190-1940C hoặc 3000C Tan được trong nước 0,1g/ml 1.6.2. Glucosamin sulfat Công thức cấu tạo: NH2 OH OHC OH OH OH H2SO4 5 Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 17 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn Tên gọi khoa học: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose sulfate; D-glucosamine sulfate. Công thức phân tử: C6H13O5N.H2SO4 Phân tử lượng: Mglucosamin.H2SO4 = 277,24 1.6.3. Acetyl glucosamin Công thức cấu tạo: NHAc OH OHC OH OH OH 6 Tên gọi khoa học: 2-Acetoamido-2-deoxy-D-glucopyranose; N-acetyl-D(+)-glucosamine; N-acetyl-β-D-glucosaminide; N-acetylchitosamine. Công thức phân tử: C8H15O6N Phân tử lượng: Macetylglucosamin = 221,21 Điểm nóng chảy: 201 - 2100C Tan được trong nước, 0,1g/ml 1.7. Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó [9] Glucosamine là một aminomonosacharit được thấy trong tự nhiên, nguyên liệu để tổng hợp proteoglycan. Glucosamin kích thích tế bào sụn khớp tăng tổng hợp và trùng hợp nên cấu trúc proteoglycan bình thường. Kết quả của quá trình trùng hợp là tạo ra mucopolysaccharit, thành phần cơ bản tạo nên sụn khớp. Hình 5 : Đau xương cột sống Bình thường sụn khớp được cấu tạo chủ yếu bởi nước, collagen và proteoplycan. Glucosamin đồng thời ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2 và giảm các gốc tự do superoxid phá hủy các tế bào sụn. Glucosamin còn có tác dụng kích thích sinh sản Hình 6 : Khớp nối Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 18 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn mô liên kết của xương, giảm quá trình mất canxi của xương [ 9]. Khi thiếu glucosamin thì sụn đặc biệt là sụn khớp háng, đầu gối bị hỏng, cứng, tạo gai xương gây biến dạng khớp làm hạn chế vận động, dẫn đến bệnh viêm xương khớp phát triển. Do glucosamin làm tăng sản xuất chất nhầy dịch khớp nên tăng độ nhớt, khả năng bôi trơn của dịch khớp, vì thế không những làm giảm triệu chứng của thoái hóa khớp (đau, khó vận động) mà còn ngăn chặn quá trình thoái hóa khớp, ngăn chặn bệnh tiến triển [9]. Thuốc tác động vào cơ chế sinh bệnh của thoái hóa khớp, điều trị các bệnh thoái hóa xương khớp cả cấp và mãn tính, cải thiện chức năng khớp và ngăn chặn bệnh tiến triển, phục hồi cấu trúc sụn khớp. Hình 7 :Các vị trí khớp nối Từ tuổi 45 - 50 trở lên, bệnh có chiều hướng tăng (27% ở tuổi 60 - 70%, 45% ở tuổi 80). Đối tượng nguy cơ dễ mắc bệnh khớp nhất là người già, người béo phì, người bị chấn thương khớp, có dị tật bẩm sinh, bệnh về chuyển hoá, di truyền hoặc bị xáo trộn về kích tố [1]. Các muối của glucosamin có khả năng giải phóng và sản sinh mucopolysacharit khuếch tán tốt vào dịch khớp, phát huy tốt tác dụng chống viêm khớp. Các dẫn xuất glucosamin thông dụng được dùng phổ biến ngày nay là: • Glucosamin hydroclorua. • Glucosamin sulfat. • Acetyl glucosamin. Trong thực nghiệm trên thỏ con, người ta thấy glucosamin chỉ làm tăng thành phần các proteoglycan trong các vị trí mô sụn hư cần phải sửa chữa mà không có tác dụng tương tự trên phần sụn khớp bình thường. Những năm gần đây, glucosamin được dùng rộng rãi trong điều trị viêm khớp, thoái hóa khớp. Tuy nhiên, theo một nghiên cứu mới của tiến sĩ Ronald Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 19 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn Tallarida thuộc trường Đại Học Y khoa Temple, Philadelphia (Mỹ) cho thấy nếu sử dụng glucosamin đơn độc sẽ không có hiệu quả chống đau. Nhưng nếu kết hợp với một loại thuốc nhóm kháng viêm không steroid (NSAID) thì tác dụng chống đau, chống viêm tăng lên rất nhiều. Thực tế lâm sàng cho thấy nó mang lại nhiều ưu điểm trong điều trị hơn hẳn các thuốc NSAID. Nhược điểm của thuốc NSAID là có nhiều tác dụng phụ, còn khi sử dụng glucosamin thì lại rất ít tác dụng phụ. Một vài dị ứng không đáng kể đối với người có cơ địa quá mẫn cảm với thuốc. Trước đây glucosamin được xếp vào nhóm thuốc bảo vệ sụn (gồm có glucosamin, chondroitin và diacerin) hay thuốc tác dụng chậm với các bệnh viêm khớp. Hiện nay cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMEA) chấp nhận xếp glucosamin vào danh mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp. Các loại khác chưa được chấp nhận vì không đáp ứng được các yếu cầu trên lâm sàng. Ở Việt Nam hiện nay cũng đang sử dụng một số loại thuốc có chứa glucosamin như : Lubrex, Lubrex-F, Glucosamin, Glusivac,…[9]. Nhưng các thuốc này chủ yếu vẫn nhập khẩu từ nước ngoài. Đã có rất nhiều nghiên cứu thử nghiệm so sánh glucosamin với các loại thuốc NSAID, cho kết quả như sau [8]: 1. Cải thiện triệu chứng viêm khớp tương đương với NSAID trong thời gian ngắn và vượt trội hơn hẳn nếu uống thuốc thời Hình 8 : Một số thuốc glucosamin hiện đang lưu bày trên thị trường Việt Nam gian dài. Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 20