Tài liệu Nghiên cứu bacteriocin của vi khuẩn lactobacillus plantarum phân lập từ mẫu chao tại huế

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Lƣu Thị Thanh Huế NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus plantarum PHÂN LẬP TỪ MẪU CHAO TẠI HUẾ LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội – Năm 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Lƣu Thị Thanh Huế NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus plantarum PHÂN LẬP TỪ MẪU CHAO TẠI HUẾ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Quỳnh Uyển TS. Mai Thị Đàm Linh Hà Nội – Năm 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Quỳnh Uyển, cán bộViện Vi sinh học và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp tôi giải quyết các vấn đề nảy sinh trong quá trình làm luận văn và hoàn thành luận văn theo đúng định hướng ban đầu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới : TS. Mai Thị Đàm Linh, PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà, cán bộ tại Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện bước đầu cho tôi hoàn thành luận văn này. CN Hoàng Thu Hà, CN Lê Hồng Anh cùng toàn thể cán bộ, sinh viên tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành luận văn của mình. Đề tài “Đánh giá nguồn gen vi khuẩn lactic bản địa định hướng ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm và thức ăn chăn nuôi” - Bộ khoa học và Công nghệ đã hỗ trợ hóa chất, dụng cụ thí nghiệm trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè và các anh chị đồng học luôn ở bên giúp đỡ, động viên, khích lệ tôi vượt qua những khó khăn trong học tập suốt 2 năm vừa qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Lƣu Thị Thanh Huế MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................3 1.1. Vi khuẩn lactic (LAB) ....................................................................................3 1.1.1. Đặc điểm hình thái .....................................................................................3 1.1.2. Quá trình lên men lactic .............................................................................5 1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic. 6 1.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic ........................................................................8 1.2.1. Ứng dụng của vi khuẩn lactic nói chung ...................................................8 1.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn L. plantarum ........................................................9 1.3.Bacteriocin......................................................................................................10 1.3.1. Định nghĩa ...............................................................................................10 1.3.2. Phân loại ..................................................................................................10 1.3.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin ...........................................................11 1.3.4. Đặc điểm của bacteriocin ở các nhóm vi khuẩn ......................................12 1.3.5. Các đặc tính của bacteriocin ....................................................................13 1.3.6. Bacteriocin từ vi khuẩn lactic ..................................................................14 1.3.7. Phương pháp tinh sạch bacteriocin ..........................................................17 1.4. Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn lactic ................................ 19 1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới ....................................................................19 1.4.2. Các nghiên cứu trong nước ......................................................................21 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............24 2.1. Nguyên liệu ....................................................................................................24 2.1.1. Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum ................................................24 2.1.2. Chủng vi khuẩn kiểm định .......................................................................24 2.1.3. Môi trường, hóa chất và thiết bị ..............................................................24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................26 2.2.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin ...........................................................................................................................27 2.2.2. Một số tính chất của bacteriocin ..............................................................28 2.2.3. Tinh sạch bacteriocin bằng hệ thống AKTA ...........................................29 2.2.4. Điện di SDS PAGEvà kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn ...........................30 2.2.5. Khảo sát khả năng chịu muối mật và pH thấp .........................................32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................33 3.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarum UL485 ..........................................................33 3.1.1. Tối ưu hóa thời gian nuôi cấy ..................................................................33 3.1.2. Tối ưu hóa nhiệt độnuôi cấy ....................................................................34 3.2. Một số tính chất của bacteriocin từ chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL485 .................................................................................................36 3.2.1. Hoạt độ bacteriocin (AU/ml) ...................................................................36 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin ..................................37 3.2.3. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin ..........................................38 3.2.4. Ảnh hưởng của enzym trypsin đến hoạt tính bacteriocin ........................40 3.3. Sơ bộ tinh sạch bacteriocin sinh tổng hợp từ chủng Lactobacillus plantarum UL485 .................................................................................................41 3.3.1. Chương trình tinh sạch trên hệ thống AKTA ..........................................42 3.3.2. Kết quả của quá trình tinh sạch bacteriocintrên hệ thống AKTA ...........45 3.3.3. Kết quả điện di SDS PAGE và kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn .............46 3.4.Khảo sát khả năng chịu pH, muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL485 .................................................................................................47 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................51 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT LAB : Lactic Acid Bacteria CFU : Colony Formong Unit AU : Activity Unit kDa : Kilo Dalton SDS : Sodium dodecyl sulfate SDS PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Độ bền nhiệt, pH và enzym thủy phân của một số bacteriocin sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic ............................................................................13 Bảng 1.2: Các bacteriocin phổ biến được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic ...................14 Bảng 1.3: Một số bacteriocin sản xuất bởi L. plantarum được phân lập từ các mẫu thực phẩm khác nhau ...............................................................................15 Bảng 1.4: Tinh sạch một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum ..........................................................................18 Bảng 2.1: Các chủng vi khuẩn kiểm định .................................................................24 Bảng 2.2: Thành phần của gel sử dụng trong điện di Trixin - SDS PAGE ..............30 Bảng 2.3: Thành phần của gel sử dụng trong điện di Glyxin - SDS PAGE .............31 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarum UL485 .....................................................................34 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính bacteriocin của chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL485 ...................................................35 Bảng 3.3: Hoạt độ AU của L. plantarum UL485 với 5 chủng vi khuẩn kiểm định..36 Bảng 3.4: Tổng kết quá trình tinh sạch bacteriocin của chủng L. plantarum UL485 bằng cột sắc ký trao đổi cation ................................................................ 45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cơ chế hoạt động của bacteriocin ..........................................................12 Hình 2.1: Sơ đồ quy trình thí nghiệm.....................................................................27 Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu theo hệ số 2 ...........................................................28 Hình 3.1: Hoạt tính bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarum UL485 với KĐ28 tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau ..........................................33 Hình 3.2: Hoạt tính bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarumUL485 với KĐ28 tại các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau.............................................35 Hình 3.3: Hoạt tính bacteriocin từ chủng L. plantarum UL485 ở 60oC, 100oC, 121oC ......................................................................................................37 Hình 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin của chủng Lactobacillus plantarum UL485 ............................................................38 Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin của chủng Lactobacillus plantarumUL485 .............................................................39 Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin của L. plantarum UL485 ....................................................................................................39 Hình 3.7: Ảnh hưởng của enzym trypsin đến hoạt tính bacteriocin của chủng Lactobacillus plantarumUL485 .............................................................40 Hình 3.8: Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarumUL485 qua cột Hitrap SP FF 1 ml ......................................................................42 Hình 3.9: Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn sắc ký với KĐ28 ......................................................................................................43 Hình 3.10: Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarumUL485 qua cột Hitrap SP FF 1 ml ......................................................................44 Hình 3.11: Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn rửa giải với KĐ28 ......................................................................................................44 Hình 3.12: Điện di Glyxin – SDS PAGE 18%.........................................................47 Hình 3.13: Khả năng chịu pH thấp, muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL485 ............................................................48 MỞ ĐẦU Hiện nay, các loại chất phụ gia ngày càng được sử dụng phổ biến trong quá trình sản xuất, chế biến và bảo quản thực phẩm nhằm cải thiện hương vị, duy trì chất lượng dinh dưỡng cũng như độ tươi của sản phẩm. Tuy nhiên, hiện tượng lạm dụng quá mức các chất này đã làm gia tăng tình trạng ngộ độc thực phẩm và mang lại nhiều tác hại cho sức khỏe người tiêu dùng. Bởi vậy, việc nghiên cứu các chất kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm cần phải đi theo một hướng mới, hiệu quả hơn, an toàn hơn. Khác với những hóa chất phụ gia và kháng sinh, bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất peptit hoặc protein được tổng hợp theo con đường riboxom ở vi khuẩn, có hoạt tính kìm hãm, ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn. Bacteriocin đã được công nhận là an toàn, không gây dị ứng và không gây hại cho sức khỏe con người do nó bị phân hủy bởi proteinaza, lipaza ở đường ruột. Điển hình là nisin, một chất bảo quản được bổ sung trong các loại rau, sữa, pho mát, thịt…do nó có khả năng ức chế các vi sinh vật làm hỏng thực phẩm. Từ đó, có thể thấy rằng, việc ứng dụng các bacteriocin có nguồn gốc từ vi khuẩn và các bacteriocin có nguồn gốc tự nhiên sẽ mang lại những lợi ích vô cùng to lớn cho cuộc sống của con người. Những năm gần đây, vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) đã được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm và một số ngành chế biến khác vì chúng có khả năng sinh axit, tạo hương và ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn nhờ khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Trong đó, nhóm vi khuẩn Lactobacillus plantarum được đánh giá là ứng cử viên tiềm năng trong việc sinh tổng hợp bacteriocin có khả năng tiêu diệt các tác nhân gây bệnh như Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum và Staphylococcus aureus. Đã có nhiều công bố nghiên cứu sâu về bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum, bao gồm cả tinh sạch cũng như xácđịnhcác bacteriocin mới để ứng dụng trong công nghệ thực phẩm nhằm mục đích kéo dài thời gian bảo quản, chống lại sự phát triển của các tác nhân gây bệnh, điều trị một số bệnh và duy trì sức khỏe cho con người. Tuy nhiên để có thể sử dụng bacteriocin, cần thiết phải chọn lựa những chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp bacteriocin có phổ hoạt tính rộng hoặc có 1 hoạt độ cao để nghiên cứu sâu về bacteriocin đó nhằm tạo tiền đề cho việc thu nhận, ứng dụng trong thực tế. Xuất phát từ thực tiễn đó cùng với xu hướng chú trọng việc ứng dụng các bacteriocin trong đời sống, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus plantarum phân lập từ mẫu chao tại Huế” nhằm góp phần khai thác tiềm năng ứng dụng của các bacteriocin sinh tổng hợp từ vi khuẩn LAB được phân lập từ các mẫu thực phẩm ở Việt Nam. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vi khuẩn lactic (LAB) Vi khuẩn lactic đã được phát hiện và nghiên cứu từ rất lâu. Năm 1780, nhà hóa học Scheele (Thụy Điển) lần đầu tiên tách chiết được axit lactic từ sữa bò lên men chua. Sau đó, năm 1847, Blondeau đã công nhận axit lactic là sản phẩm cuối cùng của chuỗi phản ứng lên men. Đến năm 1857, Louis Pasteur chứng minh rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi khuẩn đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. Năm 1873, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactics (hiện nay gọi là Streptococcus lactis). Từ đó đến nay, nhiều loại vi khuẩn lactic khác nhau đã được phân lập, định danh và ngành công nghiệp lên men để sản xuất axit lactic (hình thành từ năm 1881) được phát triển, mở rộng[25,40,45]. Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic có mặt ở nhiều điều kiện môi trường khác nhau, chẳng hạn như trong phân, rác, niêm mạc ruột và đặc biệt là trong các sản phẩm lên men chua. Ngày nay, vi khuẩn lactic ngày càng được ứng dụng trên quy mô lớn, đặc biệt những chủng có hoạt tính sinh học cao thuộc chi Lactobacillus, Streptococcus,...[33]. 1.1.1. Đặc điểm hình thái 1.1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là tên gọi của một nhóm vi khuẩn thu nhận năng lượng nhờ quá trình phân giải cacbonhydrat kị khívà sinh ra axit lactic. Chúng được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Mặc dù nhóm vi khuẩn này không đồng nhất về mặt hình thái, bao gồm cả dạng que ngắn, que dài và hình cầu, song về mặt sinh lí chúng lại tương đối thống nhất với nhau ở các đặc điểm:  Đều là vi khuẩn Gram dương  Không hình thành bào tử  Hầu hết không di động  Là vi sinh kị khí tùy ý. Vi khuẩn lactic bao gồm các chi: Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacter, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetragenococcus, Streptococcus, Vagococcus và Bifìdobacterium. Trong đó, các vi 3 khuẩn thuộc chi Lactobacillus chiếm số lượng lớn nhất vàStreptococcus, Leuconostoc, Lactococcusđược ứng dụng nhiều nhất trong ngành công nghiệp thực phẩm [30].  Streptococcus Tế bào có hình cầu hay hình oval, đường kính nhỏ hơn 2 m, xếp thành dạng đôi, dạng chuỗi ngắn hoặc dài, ưa ấm, nhiệt độ sinh trưởng thích hợpkhoảng 37oC. Vi khuẩn thuộc chi này có khả năng phân giải nhiều loại đường khác nhau như glucozơ, mantozơ, lactozơ và đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hương vị cho sản phẩm, nhất là chất lượng của các sản phẩm làm từ sữa [53].  Leuconostoc Tế bào hình oval xếp thành từng đôi, chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài. Chúng có nhu cầu cao về mặt dinh dưỡng. Quá trình lên men dị hình của chúng tạo thành axit lactic và các sản phẩm phụ như axit axetic, etanol, CO2. Bên cạnh đó, vi khuẩn thuộc chi Leuconostoc còn có khả năng tạo hương thơm cho bơ, sữa chua do tạo thành các chất như axetyl metyl cacbinol hay axetonin [53].  Bifidiobacterium Là những trực khuẩn kị khí, lên men lactic dị hình; sản phẩm chính là axit lactic và axit axetic cùng với một lượng nhỏ axit formic, etanol, axit sucxinic. Không giống với các vi khuẩn lên men lactic dị hình khác, chi Bifidiobacterium không sinh CO2. Chúng thuộc loại ưa ấm và có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 31oC - 41oC [53].  Lactobacillus Tế bào không di động, có hình que dài hoặc ngắn, thường xếp thành hình chuỗi với kích thước dao động trong khoảng 0,5 – 1,2 x 1 - 10 m. Hầu hết vi khuẩn thuộc chi này là dạng kỵ khí không bắt buộc, một số ít chủng kỵ khí nghiêm ngặt, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 50oC – 53oC nhưng nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 30oC – 40oC. Ngoài ra, chúng có thể sống ở điều kiện pH < 5 [53]. Lactobacillus gồm 25 loài, được chia thành 3 nhóm: lên men lactic đồng hình bắt buộc, lên men lactic dị hình bắt buộc và lên men lactic dị hình tùy ý. Các nhóm vi khuẩn lactic này đều tạo ra axit lactic nhưng axit do từng nhóm tạo ra lại khác nhau về cấu hình đồng phân. Lactobacillus được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến và bảo quản sữa, phomat, thịt, các chế phẩm probiotic [53]. 4 1.1.1.2. Đặc điểm của Lactobacillus plantarum Nằm trong chi vi khuẩn lactic có số lượng lớn nhất này, L. plantarum là một trong những loài phổ biến nhất và đang được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghệ thực phẩm. L. plantarum có dạng hình que, thường kết đôi hoặc chuỗi và sinh trường tốt trong điều kiện vi hiếu khí. Tính chất đặc trưng của L. plantarum là khả năng dị hóa arginin và sinh ra nitric oxit. L. plantarum không có khả năng phân giải amino axit, ngoại trừ tyrosin và arginin. Chúng có đến 6 con đường chuyển hóa arginin khác nhau và đều sinh ra nitric oxit (NO). Việc sinh ra NO giúp chúng ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida abicans, Escherichia coli, Shigella, Helicobacter pylory, các amip và kí sinh trùng [36]. Loài vi khuẩn này có khả năng chịu axit thấp, được xếp vào nhóm vi sinh vật an toàn và có mối quan hệ gần gũi với loài Lactobacillus pentosus, Lactobacillus paraplantarum và gần đây nhất là Lactobacillus fabifermentans (mức độ tương đồng về trình tự rARN lên tới 99%) [28]. L. plantarum có thể được tìm thấy trong các loại thực phẩm giàu tinh bột, các loại ngũ cốc, thịt, sản phẩm từ sữa, rau, trái cây, đồ uống,…Nó tồn tại được trong dạ dày, đường ruột của con người và các động vật có vú khác. Một số nghiên cứu của Brinques và cộng sự (2010), Prins và cộng sự (2010), Todorov (2008) cho rằng, khả năng thích ứng với các điều kiện môi trường khác nhau của L. plantarum là nhờ quá trình lên men hỗn hợp hàng loạt cacbonhydrat[28]. L. plantarum sở hữu bộ gene lớn nhất trong số các vi khuẩn lactic với nhiễm sắc thể dạng vòng có chứa 3.308.274 cặp base, % GC của nhiễm sắc thể là 44,5% và các plasmid có % GC thấp hơn. L. plantarumWCFS1 có ba plasmid là pWCFS101, pWCFS102, và pWCFS103 với kích thước tương ứng là 1.917 bp, 2.365 bp và 36.069 bp. Trình tự gen trên nhiễm sắc thể có tính có tính đa dạng di truyền giúp vi khuẩn L. plantarum thích ứng với nhiều điều kiện môi trường khác nhau[39]. 1.1.2. Quá trình lên men lactic Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường trong điều kiện kị khí với sản phẩm là axit lactic tích lũy trong môi trường. Quá trình này có thể tóm tắt theo phương trình sau: 5 Các loài vi khuẩn lactic khác nhau về cơ chế chuyển hóa glucozơ. Một vài loài vi khuẩn lactic trải qua quá trình đường phân trong điều kiện kị khí tạo axit lactic và nhóm này được gọi là lên men đồng hình. Một số nhóm khác ngoài axit lactic còn tạo ra rượu, CO2 và nhóm này được gọi là lên men dị hình [19,21]. 1.1.2.1. Lên men lactic đồng hình Các vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP (Embden - Meyerhof – Parnas Pathway) và tạo ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic (hơn 85%). Phương trình tóm tắt của quá trình lên men đồng hình như sau: C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3CHOHCOOH + 2ATP GlucozơAxit lactic Một số vi khuẩn lactic lên men đồng hình thường gặp là Lactococus lactis, L.casei, L. delbrueckii,…[19,21]. 1.1.2.2. Lên men lactic dị hình Ngoài axit lactic (chiếm đến 50%), quá trình lên men lactic dị hình còn có các sản phẩm phụ khác như etanol, axetat, CO2,…. Phương trình tóm tắt của quá trình lên men dị hình như sau: C6H12O6CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + CO2 + xKcal GlucozơAxit lactic Etanol Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình thường gặp là L. amylovorus, L. reuteri, L. manihotivorans,... [19,21]. 1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic. 1.1.3.1. Cacbonhydrat Cacbonhydrat là nguồn cung cấp cacbon và năng lượng thiết yếu cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic. Ngoài ra, cacbon cũng có thể được lấy từ protein, axit aminvà glyxerol. Vi khuẩn lactic sử dụng được hầu hết các loại đường, song 6 glucozơ là nguồn cacbon thích hợp nhất và tùy từng loại LAB khác nhau mà nguồn cacbon phù hợp được lựa chọn. Chẳng hạn như L. acidophilus sinh trưởng mạnh hơn khi thay thế glucozơ bằng mantozơ, salicin, raffinozơ hoặc melibiozơ; L. fermentum sinh trưởng tốt nhất với nguồn cacbon là maltozơ; S. thermophilus phát triển mạnh trong môi trường có lactozơ,… [21]. 1.1.3.2. Axit amin và peptit Nitơ ở dạng axit amin hoặc peptit là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng cho quá trình phát triển sinh khối của vi khuẩn lactic. Axit amin và peptit có thể thu nhận qua các hoạt động của enzym proteaza hoặc sự phân giải protein. Theo đó, các peptit sẽ được chuyển hóa thành các axit amin tự do và một số hợp chất khác. Quá trình sinh trưởng của LAB phụ thuộc vào nguồn cung cấp nitơ hữu cơ do vi khuẩn này ít có khả năng sinh tổng hợp axit amin từ nguồn nitơ vô cơ. Nhu cầu axit amin của LAB khác nhau tùy theo chủng, loài. Ví dụ, chỉ có 3 axit amin cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn L. plantarum trong khi L. acidophilus cần tới 14 axit amin [21]. 1.1.3.3. Vitamin Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic có thể phân chia thành 3 nhóm: vitamin thiết yếu, vitamin kích thích và vitamin không thiết yếu. Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic có thể giảm từ 34 – 67% nếu không có các nhóm vitamin này trong môi trường dinh dưỡng. Trong đó, axit pantothenic (vitamin B5), axit riboflavin (vitamin B2) và axit nicotinic (vitamin B3 hay vitamin PP) là những loại vitamin rất cần thiết cho hầu hết các chủng LAB.Khi thiếu riboflavin, sự sinh trưởng L. plantarum bị ức chế hoàn toàn. Một số vitamin (chẳng hạn như vitamin H, vitamin C,…) có thể là yếu tố kích thích cho sự tăng trưởng của một số chủng LAB nhưng lại không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của một số chủng LAB khác [21]. 1.1.3.4. Khoáng chất Các khoáng chất cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic là hỗn hợp chứa các ion như kali, natri, magiê, mangan, sắt, clo và photphat. Trong đó, Mn2+ có tác động tích cực đến sự phát triển và quá trình sản sinh ra axit lactic. Ngoài ra, Mg2+ còn tham gia vào trung tâm hoạt động của một số enzym hoặc đóng vai trò hoạt hóa các enzym xúc tác trong quá trình lên men lactic, nhờ đó hỗ trợ vi khuẩn 7 sử dụng tốt hơn các loại đường. Mg2+ là khoáng chất thiết yếu cho sự phát triển của các vi khuẩn L. casei, L. lactis, L. delbrueckii, L. helveticus và L. acidophilus. Ngoài ra, nó đảm nhiệm chức năng là cofactor đối với nhiều enzym liên quan đến quá trình vận chuyển và trao đổi chất như fructokinaza, photphoketolaza và axetat kinaza [21]. 1.1.3.5. Nhiệt độ Khoảng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng, trải dài từ 15oC – 40oC. Trong đó, 24 – 30oC là khoảng nhiệt độ tối ưu nhất cho sự phát triển của LAB cũng như quá trình lên men để tạo ra axit lactic. Các loài có nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 40oC – 45oC được gọi là vi khuẩn ưa nhiệt; các loài có nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 20oC - 40oC được gọi là vi khuẩn ưa ấm. Những loài vi khuẩn lactic sống trong đường ruột của người và động vật hầu hết thuộc loại ưa ấm[50]. 1.1.3.6. pH Vi khuẩn lactic hoạt động trong dải pH rộng. Khả năng điều chỉnh pH trong tế bào chất là một trong những đặc điểm sinh lý quan trọng nhất giúp cho vi khuẩn này có khả năng chịu axit thấp hơn so với nhiều loài vi khuẩn khác. Đa số các vi khuẩn lactic có dải pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5 - 6,2 (Lactobacilus); 6 – 6,5 (L. plantarum); 5,5 - 6,5 (Pediococcus) và 6,3 - 6,5 (Leuconostoc)[50]. 1.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic 1.2.1. Ứng dụng của vi khuẩn lactic nói chung Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, chế biến bảo quản thực phẩm, y học,… để sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ đời sống. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, vi khuẩn này được sử dụng để lên men các sản phẩm từ sữa, từ thịt và tạo ra các phụ gia thực phẩm. Đáng kể nhất hiện nay là việc ứng dụng vi khuẩn lactic trong sản xuất các chế phẩm sinh học để phục vụ nông nghiệp, chống ô nhiễm và bảo vệ môi trường [36]. Trong quá trình lên men, ngoài axit lactic, vi khuẩn lactic còn sản sinh nhiều hoạt chất có giá trị như chất thơm, vitamin, bacteriocin,… Do đó, chúng được sử dụng trong ủ chua thức ăn gia súc nhằm tăng hàm lượng dinh dưỡng và năng suất 8 trong chăn nuôi. Một số chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều nhất là L. plantarum, Leuconostoc mesenteroides [36]. 1.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn L. plantarum Rất nhiều ứng dụng gắn liền với L. plantarum trong quá trình sản xuất các chế phẩm probiotic đã được công bốtrên các tạp chí khoa học uy tín. Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng, vi khuẩn lactic nói chung và L. plantarum nói riêng có vai trò bảo vệ, tăng cường chức năng đường ruột và cải thiện các triệu chứng ruột kích thích. Ngoài ra, L. plantarum còn tác động tích cực đến hệ vi sinh vật trong đường ruột, quá trình chuyển hóa lipit và làm giảm hội chứng viêm[36]. Vi khuẩn L. plantarum có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin hiện diện tự nhiên trong nhiều nguồn thực phẩm khác nhau, do vậy nó góp phần cải thiện đặc tính cảm quan và đóng một vai trò thiết yếu trong việc kéo dài thời hạn sử dụng thực phẩm. Nhờ đó, những phương pháp xử lý vật lý sử dụng trong quá trình bảo quản thực phẩm có khả năng được giảm thiểu. Do vậy, L. plantarum đáp ứng các yêu cầu của người tiêu dùng trong việc sử dụng thực phẩm tươi sống và thực phẩm đóng gói chứa ít hàm lượng chất bảo quản. Trong lĩnh vực y học, các ứng dụng của L. plantarum được các nhà khoa học quan tâm nhờ khả năng bảo vệ bề mặt da và điều trị nhiễm trùng vết thương gây ra do bỏng [36]. Một ứng dụng khác của L. plantarum liên quan đến việc xử lý mùi phân của heo, đặc biệt là ở các trang trại lớn. Bình thường, chế độ ăn uống có thể giảm bớt mùi hôi này nhưng lại tốn kém và hạn chế khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng. Trong khi đó, việc bổ sung vi khuẩn L. plantarum vào chế độ ăn của heo, có hoặc không bổ sung insulinlàm giảm đáng kể mùi phân của heo mà không ảnh hưởng đến quá trình tiêu hóa thức ăn [36]. Nhờ khả năng ngăn chặn sự bám dính của E.coli vào màng nhầy, L. plantarum làm giảm hoạt động của nội độc tố do E.coli tiết ra, đồng thời đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Ngoài ra, L. plantarum cũng hỗ trợ tiêu hóa các chất xơ có trong lúa mì, lúa mạch đen, men bia,… Do đó, những vấn đề tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng được cải thiện đáng kể. L. plantarum còn được chứng minh là có khả năng làm giảm cholesterol khi chúng hoạt động riêng lẻ hoặc kết hợp với Lactobacillus paracasei trong khẩu 9 phần ăn của chuột. Bên cạnh vai trò là giống khởi động trong quá trình lên men thực phẩm, vi khuẩn L. plantarum và bacteriocin của nó cũng được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm probiotic [18,36]. 1.3.Bacteriocin Công trình đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình của Gratia và cộng sự vào năm 1925. Họ đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của colicin V được sinh tổng hợp bởi E. coli. Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của colicin. Đó là một chất có khả năng gây chết nhiều vi sinh vật, có phổ hoạt động hẹp và phổ hoạt động này bị giới hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất. Các loài vi khuẩn Gram dương được nghiên cứu về khả năng sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp.; Listeria sp. và Staphylococcus sp. Số lượng công bố nghiên cứu về bacteriocin trong những năm 1980 đã có sự gia tăng đáng kể. Từ thời điểm này những nghiên cứu về bacteriocin với định hướng như một chất kháng khuẩn an toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm đã bắt đầu phát triển [15]. 1.3.1. Định nghĩa Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất peptit hoặc protein được tổng hợp theo con đường riboxom ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương để chống lại các vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng. Bacteriocin không gây dị ứng và không gây hại cho sức khỏe con người (do nó bị phân hủy bởi proteinaza, lipaza ở đường ruột) [10]. 1.3.2. Phân loại Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin đã được xác định. Các bacteriocin rất đa dạng về cấu trúc và chức năng. Tuy nhiên, việc phân loại bacteriocin hiện vẫn chưa được rõ ràng và đang còn tranh cãi. Các bacteriocin thường được phân loại dựa trên các tiêu chí khác nhau. Trong đó, phương pháp phân loại được chấp nhận và sử dụng phổ biến là dựa trên trọng lượng phân tử, cấu trúc và một số đặc tính của bacteriocin. Theo đó, bacteriocin được chia thành 4 lớp: lớp I, lớp II lớp III và lớp IV. Bacteriocin lớp I và lớp II là đối tượng được tìm hiểu và nghiên cứu nhiều hơn hơn hai lớp còn lại [31]. 10 1.3.2.1. Lớp I Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptit nhỏ (< 5 kDa), bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. Một bacteriocin tiêu biểu và được nghiên cứu sâu của nhóm này là nisin. Các lantibiotic được chia thành 2 phân lớp là Ia, Ib dựa trên cấu trúc hóa học và phương thức hoạt động [31,47]. 1.3.2.2. Lớp II Lớp II còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng lượng phân tử <10 kDa, bền nhiệt và không chứa lanthionine. Các bacteriocin lớp II có thể chia thành 3 phân lớp là IIa, IIb và IIc [31,47]. 1.3.2.3.Lớp III Lớp III bao gồm những peptit lớn, có trọng lượng phân tử > 30 kDa và không bền nhiệt. Hầu hết các bacteriocin lớp này được phân lập từ các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus. Đại diện cho lớp III là helveticin J được sản xuất bởi vi khuẩn L. helveticus 481, lactacin B được sản xuất bởi L. acidophilus [31,47]. 1.3.2.4. Lớp IV Hiện nay có rất ít nghiên cứu về lớp này. Một cách tổng quát, các bacteriocin lớp IV được định nghĩa là các bacteriocin phức tạp có chứa các nhóm chức lipit hoặc cacbonhydrat. Ví dụ về bacteriocin của lớp này là các glycoprotein (lactocin 27), lipoprotein (lacstrepcins),…[31,47]. 1.3.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin Bacteriocin đóng vai trò như một hệ thống miễn dịch tự nhiên của vi khuẩn. Theo đó, các vi khuẩn Gram dương và Gram âm có thể sinh tổng hợp nhiều loại bacteriocin nhằm kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn khác. 11 Hình 1.1: Cơ chế hoạt động của bacteriocin [51] Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein hay peptit được tổng hợp theo con đường riboxom. Khi được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn sản xuất, bacteriocin có thể kết hợp với các thụ thể tương ứng trên bề mặt tế bào của các vi khuẩn nhạy cảm để tiêu diệt vi khuẩn. Các bacteriocin có thể tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào; nó cũng có thể đóng vai trò như một loại nucleazavới chức năng phân giải ADN, ARN hoặc tấn công vào lớp peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào (Hình 1.1) [51]. 1.3.4. Đặc điểm của bacteriocin ở các nhóm vi khuẩn Bacteriocin được sinh tổng hợp ở cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương với những đặc điểm sau:  Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm: Gồm nhiều loại khác nhau về kích thước, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch. Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm có phổ kháng khuẩn hẹp hoặc có hoạt độ yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương [43].  Bacteirocin của vi khuẩn Gram dƣơng: Các bacteriocin này rất đa dạng. Tuy nhiên, quá trình sinh tổng hợp bacteriocin ở vi khuẩn Gram dương không gây chết vi sinh vật chủ và quá trình này cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm [43]. 12