Tài liệu Luận văn Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii

B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Đ I H C THÁI NGUYÊN NGUY N H U QUÂN NGHIÊN C U Đ C TÍNH C A CHITINASE T NHIÊN VÀ BI U HI N CHITINASE TÁI T T H P CH NG N M LECANICILLIUM LECANII LU N ÁN TI N Sƾ SINH H C T Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN , 2015 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Đ I H C THÁI NGUYÊN NGUY N H U QUÂN NGHIÊN C U Đ C TÍNH C A CHITINASE T NHIÊN VÀ BI U HI N CHITINASE TÁI T T H P CH NG N M LECANICILLIUM LECANII Chuyên ngành: Mã s : 62 42 01 16 LU N ÁN TI N Sƾ SINH H C : PGS.TS. Nguy n Vũ Thanh Thanh T Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN , 2015 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i L I CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan b n lu n án là công trình nghiên c u c a tôi dư i sự hư ng d n c a PGS.TS. Quyền Đình Thi, PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự giúp đỡ c a các cán b Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các s liệu lu n án là trung thực, m t phần k t qu đã đư c công b trên các t p chí chuyên ngành dư i sự cho phép c a các đồng tác gi , phần còn l i chưa đư c ai công b trong b t kỳ các công trình nào khác. M . Tác gi lu n án Nguy n H u Quân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii L IC M N Tôi xin bày t lòng bi t n t i PGS.TS. Quyền Đình Thi đã đ nh hư ng nghiên c u, t n tình hư ng d n, t o mọi điều kiện hóa ch t, thi t b kinh phí để tôi hoàn thành lu n án này. Tôi xin bày t lòng c m n sâu s c t i PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã ch b o, s a lu n án để tôi hoàn thành lu n án này. Phòng Công nghệ Tôi xin chân thành c m n sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ nghiệm chuyên môn cho tôi trong quá trình thực nghiệm chia sẻ kinh . Nghiên c u s n xu t và s d ng ch phẩm từ n m Lecanicillium thôn do PGS.TS. Quyền Đình Thi và TS. Vũ Văn H nh làm ch nhiệm, 2010-2013. Tôi xin c m n Khoa Khoa học Sự s ng, Phòng Đào t o Trư ng Đ i học Khoa học - Đ i học Thái Nguyên đã t o mọi điều kiện thu n l i trong quá trình . Tôi xin c m n Ban ch nhiệm Khoa Giáo d c T , Khoa Sinh , Phòng Khoa học Công nghệ và H p tác qu c t , Ban -K Giám hiệu Trư ng Đ i học Sư ph m - Đ i học Thái Nguyên và các b n đồng nghiệp đã ng h , t o mọi điều kiện thu n l i giúp tôi hoàn thành lu n án. L i c m n sau cùng tôi xin dành cho gia đình và nh ng ngư i thân, b n bè đã luôn đ ng viên giúp đỡ, t o mọi điều kiện cho tôi trong su t quá trình làm nghiên c u sinh. Tác gi lu n án Nguy n H u Quân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii M CL C Trang L I CAM ĐOAN........................................................................................ i L I C M N.............................................................................................. ii M C L C................................................................................................... iii DANH M C CÁC CH VI T T T.......................................................... vii DANH M C HÌNH..................................................................................... ix DANH M C B NG.................................................................................... xii M Đ U....................................................................................... ............. 1 1. Đặt v n đề....................................................................................... ........ 1 2. M c tiêu nghiên c u................................................................................ 2 3. N i dung nghiên c u................................................................................ 2 4. Nh ng đóng góp m i c a lu n án............................................................ 3 .................................... 3 .............................................. ......... 5 1.1. N m Lecanicillium lecanii .................................................................. 5 1.2. Chitinase .............................................................................................. 5 1.2.1. Nguồn g c c a chitinase..................................................................... 6 1.2.2. Phân lo i chitinase.............................................................................. 7 1.2.3. C u trúc và trung tâm ho t đ ng c a chitinase................................... 9 1.2.4. C ch ph n ng c a chitinase........................................................... 12 1.2.5. Các y u t nh hư ng t i ho t tính c a chitinase............................... 14 1.2.6. Các y u t nh hư ng t i quá trình sinh tổng h p chitinase.............. 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv 1.3. ng d ng c a n m L. lecanii và chitinase......................................... 19 1.3.1. Trong lĩnh vực nông nghiệp và b o vệ môi trư ng............................ 19 1.3.2. Trong lĩnh vực y học.......................................................................... 23 1.3.3. Trong lĩnh vực công nghệ sinh học.................................................... 24 1.4. Một số nghiên c u v gen và bi u hi n gen mã hóa chitinase......... 25 1.4.1. Trên th gi i....................................................................................... 25 Việt Nam......................................................................................... 29 1.4.2. Ch ng 2. V T LI U VÀ PH NG PHÁP.......................................... 33 2.1. V t li u và hóa ch t............................................................................. 33 2.1.1. Ch ng gi ng....................................................................................... 33 2.1.2. Thi t b ............................................................................................... 33 2.1.3. Hóa ch t............................................................................................. 33 2.1.4. Dung d ch và đệm.............................................................................. 34 2.1.5. Môi trư ng nuôi c y........................................................................... 34 2.1.6. Đ a điểm nghiên c u và hoàn thành lu n án ..................................... 2.2. Ph 33 ng pháp nghiên c u.................................................................... 33 2.2.1. Phư ng pháp nuôi c y........................................................................ 33 2.2.2. Phư ng pháp nghiên c u trên enzyme/protein…............................... 35 2.2.3. Các phư ng pháp sinh học phân t .................................................... 42 2.2.4. Các phư ng pháp th nghiệm............................................................. 47 2.2.7. X lý s liệu....................................................................................... 49 Ch 50 ng 3. K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N..................... 3.1. Sàng l c, ki m tra và kh o sát đi u ki n sinh t ng h p chitinase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v t n m L. lecanii......................................................................................... 50 3.1.1. Sàng lọc ch ng n m L. lecanii sinh tổng h p chitinase cao............... 50 3.1.2. Kiểm tra ch ng n m L. lecanii 43H dựa vào đo n gen 28S rRNA... 50 3.1.3. Kh o sát điều kiện sinh tổng h p chitinase........................................ 53 3.2. Tinh s ch và đánh giá đ c tính lý hóa c a chitinase t ch ng n m L. Lecanii 43H..................................................................................... 61 3.2.1. Tinh s ch chitinase............................................................................. 61 3.2.2. Đánh giá đặc tính lý hóa c a chitinase từ ch ng n m L. lecanii 43H............................................................................................................... 64 3.3. Nhân dòng gen mã hóa chitinase t ch ng n m L. lecanii 43H...... 67 3.4. Bi u hi n, tinh s ch và đánh giá tính ch t lý hóa c a rChit trong n m men P. pastoris X33............................................................................ 71 3.4.1. Thi t k plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong n m men............. 71 3.4.2. Biểu hiện chitinase tái tổ h p trong n m men P. pastoris................. 72 3.4.3. Tinh s ch rChit................................................................................... 77 3.4.4. Đánh giá đặc tính lý hóa c a rChit từ n m men P. pastoris X33....... 79 3.5. Th nghi m kh năng c ch r p và n m b nh c a chitinase và bào t t n m L. lecanii............................................................................. 3.5.1. 85 nh hư ng c a chitinase t i sự phát triển c a n m bệnh h i cây trồng............................................................................................................. 85 3.5.2. nh hư ng c a rChit t i kh năng phát triển c a rệp........................ 87 3.5.3. nh hư ng c a nhiệt đ đ n kh năng phát triển c a s i n m........... 88 3.5.4. nh hư ng c a nhiệt đ đ n kh năng nẩy mầm c a bào t n m...... 89 3.5.5. Kh năng diệt rệp c a ch ng n m L. lecanii 43H.............................. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 90 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi K T LU N VÀ KI N NGH ................................................................... 93 1. K T LU N.............................................................................................. 93 2. KI N NGH ............................................................................................. 93 ... 94 TÀI LI U THAM KH O......................................................................... 95 DANH M C PH L C............................................................................. 114 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH M C CÁC CH Ti ng Anh VI T T T Ti ng Vi t BLAST Basic local alignment search tool Phần mềm so sánh trình tự bp Base pair Cặp baz cDNA Complement DNA DNA bổ sung Chit Gene encoding chitinase Gen mã hóa chitinase CMC Cacboxyl methyl cellulose Cacboxyl methyl cellulose DEPC Diethylpyrocarbonate Diethylpyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DNase Deoxyribonuclease Enzyme th y phân DNA dNTPs 2 -Deoxynucleoside 5 - Các nucleotide triphosphate ĐC Control Đ i ch ng IPTG Isopropyl-beta-D- Isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside thiogalactopyranoside EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid Axit ethylenediamine tetraacetic EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide kb Kilo base Kilo base kDa Kilo Dalton Kilo Dalton M Marker Thang chuẩn OD Optical density M t đ quang PCR Polymerase chain reaction Ph n ng khu ch đ i gen RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii RNase Ribonuclease Enzyme th y phân RNA RT-PCR Reverse transcription polymerase Ph n ng khu ch đ i gen chain reaction rChit Recombinante chitinase Chitinase tái tổ h p SDS- Sodium dodecyl sulfate Điện di bi n tính protein trên gel PAGE Polyacrylamide gel polyacrylamide electrophoresis Taq Thermus aquaticus Thermus aquaticus TBE Tris boric acid EDTA Tris boric acid EDTA TE Tris EDTA Tris EDTA TEMED N,N,N ,N - N,N,N ,N - Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine v/v Volume/volume Thể tích/thể tích w/v Weight/volume Kh i lư ng/thể tích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ix DANH M C HÌNH Trang Hình 1.1. C u trúc b c 2 c a chitinase từ n m C. immitis........................... 10 Hình 1.2. C u trúc c a chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. A-471 ............. 11 Hình 1.3. C ch xúc tác c a chitinase B từ vi khuẩn S. mecescens........... 12 Hình 1.4. C ch th y phân -chitin b i chitinase A từ vi khuẩn B. circulans................................................................................................... 13 Hình 2.1. Đư ng chuẩn nồng đ N-acetyl glucosamine theo phư ng pháp Miller............................................................................................................ 37 Hình 2.2. Các bư c tinh s ch chitinase........................................................ 38 Hình 2.3. Đư ng chuẩn hàm lư ng albumin huy t thanh bò theo Bradford........................................................................................................ 39 Hình 2.4. Đồ th Lineawever-Burk.............................................................. 40 Hình 2.5. S đồ mô t v trí g n c a gen Chit vào genome c a n m men P. pastoris X33............................................................................................. 47 Hình 3.1. Ho t tính chitinase c a 8 ch ng n m L. lecanii........................... 50 Hình 3.2. Hình nh điện di s n phẩm PCR từ khuôn DNA c a ch ng n m L. lecanii 43H; S n phẩm Plasmid và S n phẩm c t vector tái tổ h p bằng XhoI và XbaI...................... .......................................................................... 51 Hình 3.3. Trình tự đo n gen 28S rRNA và cây phân lo i trình tự gen 28S rRNA từ ch ng n m L. lecanii 43H v i các loài khác……………………. 52 Hình 3.4. nh hư ng c a th i gian và nhiệt đ nuôi c y đ n kh năng sinh tổng h p chitinase ................................................................................ 53 Hình 3.5. nh hư ng c a nồng đ chitin huyền phù và nguồn nit đ n kh năng sinh tổng h p chitinase ................................................................ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ x Hình 3.6. nh hư ng c a nguồn cacbon và pH nuôi c y lên kh năng sinh tổng h p chitinase ................................................................................ 56 Hình 3.7. Hình nh điện di SDS-PAGE c a chitinase tinh s ch từ ch ng n m L. lecanii 43H và ho t tính chitinase c a các phân đo n qua c t DEAE-Sephadex A-50 trên đĩa th ch có bổ sung c ch t chitin huyền phù 0,5%.............................................................................................................. 59 Hình 3.8. Nhiệt đ và pH thích h p c a chitinase ...................................... 61 Hình 3.9. Đ bền nhiệt và đ bền pH c a chitinase .................................... 62 Hình 3.10. nh hư ng c a dung môi h u c và ch t tẩy r a lên ho t tính chitinase ....................................................................................................... 65 Hình 3.11. Phân tích TLC các s n phẩm th y phân chitin b i chitinase....... 67 Hình 3.12. K t qu nhân dòng gen Chit từ DNA hệ gen............................. 67 Hình 3.13. Trình tự gen Chit và amino acid suy diễn từ L. lecanii 43H..... 68 Hình 3.14. Cây phân lo i dựa vào so sánh trình tự gen Chit c a ch ng L. Lecanii 43H và các ch ng khác trong GenBank...................................... 69 Hình 3.15. K t qu nhân dòng gen Chit từ mRNA...................................... 70 Hình 3.16. Cây phân lo i dựa vào so sánh trình tự amino acid c a rChit từ L. Lecanii 43H và các ch ng khác trong GenBank.................................. 71 Hình 3.17. K t qu thi t k c u trúc vector biểu hiện pPChit..................... 72 Hình 3.18. Điện di s n phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rChit trong P. pastoris X33............................................................................................................... 71 Hình 3.19. Kh năng sinh tổng h p rChit c a ch ng tái tổ h p khi đư c c m ng các nồng đ methanol khác nhau................................................ 74 Hình 3.20. Kh năng sinh tổng h p rChit các kho ng th i gian khác nhau.............................................................................................................. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 75 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ xi Hình 3.21. Điện di SDS-PAGE c a rChit tinh s ch từ P. pastoris X33...... 78 Hình 3.22. Nhiệt đ và pH thích h p c a rChit........................................... 80 Hình 3.23. Đ bền nhiệt và đ bền pH c a rChit......................................... 81 Hình 3.24. nh hư ng c a dung môi h u c và ch t tẩy r a lên ho t tính rChit ............................................................................................................. 84 Hình 3.25. c ch sự phát triển c a n m bệnh F. oxysporum và R. solani b i chitinase ................................................................................................. 87 Hình 3.26. S i n m c a R. solani và F. oxysporum đư c x lý v i nư c và v i chitinase từ ch ng n m L. lecanii 43H.............................................. 87 Hình 3.27. H n h p chitin c a rệp đư c x lý v i nư c và rChit từ n m men P. pastoris X33 ................................................................................... 88 Hình 3.28. nh hư ng c a nhiệt đ đ n t lệ nẩy mầm c a bào t n m L. lecanii 43H ........................................................................... 90 Hình 3.29. Mô hình lá c i có rệp sau khi đư c phun d ch bào t n m và biểu đồ thể hiện kh năng diệt rệp bằng bào t c a ch ng n m L. lecanii 43H .............................................................................................................. 92 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ xii DANH M C B NG Trang B ng 2.1. Các môi trư ng thí nghiệm.......................................................... 32 B ng 2.2. Các điều kiện nuôi c y ch ng n m L. lecanii 43H sinh tổng h p chitinase................................................................................................. 34 B ng 2.3. Thành phần gel cô và gel tách.................................................... 39 B ng 2.4. Quan hệ gi a 1/[S] và 1/V........................................................... 40 B ng 2.5. Các cặp mồi s d ng................................................................... 44 B ng 2.6. Thành phần PCR.......................................................................... 45 B ng 3.1. K t qu tinh s ch chitinase từ ch ng n m L .lecanii 43H........... 59 B ng 3.2. nh hư ng c a ion kim lo i và EDTA đ n ho t tính chitinase... 63 B ng 3.3. Ho t tính chitinase c a các dòng n m men P. pastoris X33/pPChit tái tổ h p............................................................... B ng 3.4. Ho t tính rChit 73 các môi trư ng biểu hiện khác nhau................ 74 B ng 3.5. K t qu tinh s ch rChit từ n m men P. pastoris X33.................. 77 B ng 3.6. nh hư ng c a các ion kim lo i và EDTA lên ho t tính rChit... 82 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 M Đ U 1. Đ t v n đ tâm nghiên c u. Các ch phẩm sinh học từ n m ra đ i đã đư c s d ng để diệt trừ các lo i sâu . Cùng v i sự phát triển kinh t - nhanh và ch diệt các loài côn trùng có h i mà không nh hư ng t i nguồn nư c, môi trư ng sinh thái và s c kh e con ngư i, v t nuôi. N m kí sinh côn trùng thư ng tác đ ng đ n nh ng lo i mô nh t đ nh như tuy n mỡ và các mô khác b hòa tan là do các enzyme (chitinase, protease) c a n m. Trong quá trình tác đ ng lên côn trùng, n m ti t ra các enzyme càng m nh thì t c đ h y ho i và tiêu diệt côn trùng gây bệnh càng nhanh, ti t kiệm đư c th i gian. Dựa vào đặc tính này c a n m, việc t o ra m t lư ng l n enzyme đặc biệt là chitinase bổ sung vào ch phẩm sinh học là r t cần thi t. Chitinase là enzyme thuỷ phân chitin thành các đ n phân N-acetyl glucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự th y gi i liên k t -1,4-glucoside gi a C1 và C4 c a 2 phân t N-acetyl glucosamine liên ti p nhau trong chitin. Chitinase có ng d ng r ng rãi trong lĩnh vực nông nghiệp, y học. Từ thực t trên, việc nghiên c u đặc tính chitinase và qui trình t o ra chitinase cao góp phần làm tăng hiệu qu c a ch phẩm bào t n m là r t cần thi t. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 Xu t phát từ nh ng lý do trên, chúng tôi ti n hành lựa chọn đề tài lu n án: “Nghiên c u đ c tính c a chitinase t nhiên và bi u hi n chitinase tái t h p t ch ng n m Lecanicillium lecanii”. 2. M c tiêu nghiên c u 2.1. M c tiêu chung n m L. lecanii biểu hiện chitinase trong n m men Pichia pastoris . X33 2.2. M c tiêu c th ch ng n m L. lecanii có kh năng sinh tổng h p chitinase cao. ; L. lecanii ; n m L. lecanii Pichia pastoris X33; trò diệt rệp, n m bệnh h i cây trồng c a chitinase. 3. Nội dung nghiên c u (1) uyển chọn ch ng n m L. lecanii sinh chitinase cao và kh o sát điều kiện sinh tổng h p chitinase. (2) tinh s ch . ch ng n m đã tuyển chọn , tinh s ch và nghiên c u m t s tính ch t lí hóa c a chitinase tái tổ h p. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 n m bệnh và rệp h i cây trồng. 4. Nh ng đóng góp m i c a lu n án 4.1. Lu n án đã , đánh giá m t s tính ch t lý hóa kh năng c ch sự phát triển s i n m Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani c a exochitinase từ ch ng n m L. lecanii 43H kh năng diệt đư c rệp bào t n m L. lecanii. : (i) Gen Chit từ ch ng n m L. lecanii 43H đ nh đư ; đo n gen Chit đư c đăng kí trong GenBank v i mã s JX665045. (ii) Biểu hiện thành công gen Chit mã hóa endochitinase thu c họ 18 glycosyl hydrolase trong n m men P. pastoris X33 cho ho t tính cao. Tinh s ch đư c chitinase tái tổ h p và đánh giá đư c m t s tính ch t lý hóa c b n. (iii) Ch ng minh đư c rChit làm suy gi m l p v chitin c a rệp. i) K t qu nghiên c u c a lu n án cung c p d n liệu khoa học về phư ng pháp tinh s ch chitinase, các y u t nh hư ng t i ho t tính c a chitinase và kh năng diệt n m bệnh c a chitinase từ ch ng n m L. lecanii. ii) Cung c p nh ng thông tin về gen mã hóa chitinase 43H, chitinase tái tổ h p và các y u t ch ng n m L. lecanii nh hư ng t i ho t tính rChit và kh năng th y phân l p v rệp c a rChit. iii) Cung c p thông tin về kh năng diệt rệp c a bào t và đặc điểm sinh học c a n m L. lecanii. Nh ng k t qu đánh giá toàn diện từ khâu lựa chọn điều kiện sinh tổng h p chitinase, tinh s ch và xác đ nh tính ch t lý hóa, kh năng diệt n m bệnh và rệp c a chitinase, cũng như quá trình nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 4 làm căn c để đánh giá và ng d ng c a chitinase v i bào t n m trong quá trình t o ch phẩm sinh học diệt rệp c a ch ng n m L. lecanii. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 5 Ch ng 1 1.1. N m Lecanicillium lecanii Lecanicillium là chi n m kí sinh côn trùng thu c ngành n m túi Ascomycota, l p Sordariomycetes, b Hypocreales, họ Clavicipitaceae. Chi n m Lecanicillium gồm nhiều loài như: Lecanicillium lecanii, L. attenuatum, L. longisporum, L. muscarium hoặc L. nodulosum. N m L. lecanii trư c đây đư c gọi là Verticillium lecanii. Ngày nay, L. lecanii đư c bi t là m t hình th c sinh s n vô tính trong nhóm trùng th o Cordyceps confragosa [124]. N m Lecanicillium có kh năng kí sinh tự nhiên và gi t ch t nhiều lo i côn trùng như rệp, ruồi tr ng, b cánh đều, b cánh c ng, b cánh thẳng, bư m [22], [47], [49], [60], [93]. C ch diệt côn trùng c a Lecanicillium dựa trên sự ti p xúc trực ti p c a bào t v i côn trùng. Sau khi bám vào c thể côn trùng, các bào t n y mầm và t o thành s i n m đâm sâu vào các khoang trong c thể, t i đây chúng sinh trư ng và phá h y mô. Sau đó, s i n m s phát triển xuyên qua các l p biểu bì c a côn trùng. Trong điều kiện đ ẩm cao, bào t đư c t o thành bên ngoài c thể côn trùng và có thể lây truyền bệnh cho côn trùng khác [95]. Dựa vào đặc tính diệt côn trùng c a n m L. lecanii, các nghiên c u hiện nay đi theo hai hư ng chính là: đi sâu khai thác đặc điểm sinh học c a ch phẩm bào t n m L. lecanii s d ng trong kiểm soát côn trùng; và tìm hiểu vai trò c a hệ enzyme (chitinase, protease, lipase) hoặc đ c t do n m L. lecanii sinh ra trong quá trình diệt côn trùng. Các nghiên c u về chitinase từ n m Lecanicillium đã đư c các tác gi nghiên c u theo các hư ng chính là (i) t i ưu quá trình sinh tổng h p chitinase; (ii) tinh s ch và xác đ nh kh năng th y phân l p v tr ng c a côn trùng và (iii) nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase. Tuy nhiên, các k t qu nghiên c u ch dừng l i từng khâu nghiên c u riêng lẻ và ho t tính chitinase sinh ra còn r t th p. Mặt khác, ch ng n m L. lecanii nói riêng và các vi sinh v t nói chung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 6 thư ng hay xu t hiện các bi n d và quá trình sinh chitinase luôn thay đổi các điều kiện môi trư ng, d n t i tính ch t c a chitinase sinh ra từ các ch ng n m là khác nhau. Do v y, quá trình nghiên c u đầy đ về chitinase từ bư c lựa chọn điều kiện môi trư ng thích h p cho việc nâng cao kh năng tổng h p chitinase đ n tinh s ch và xác đ nh các điều kiện nh hư ng t i ho t tính enzyme; cũng như việc nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase từ ch ng n m L. lecanii trong n m men để nâng cao kh năng biểu hiện, sau đó th nghiệm ho t tính c a chitinase và ch phẩm bào t trong quá trình diệt rệp và n m bệnh h i cây trồng là hư ng nghiên c u cần thi t để nâng cao hiệu qu c a ch phẩm sinh học. 1.2. Chitinase Chitinase là nhóm enzyme th y phân có kh năng phân c t liên k t -1,4-glycoside gi a C1 và C4 c a hai phân t N-acetyl glucosamine liên ti p nhau trong phân t chitin, chitobiose và chitotriose. Chitinase đư c chia thành 2 lo i chính là endochitinase (EC 3.2.1.14) và exochitinase. Exochitinase gồm chitobiosidase (EC 3.2.1.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC 3.2.1.30). M i lo i enzyme tham gia vào th y phân c ch t theo m t c ch nh t đ nh và nh sự ph i h p ho t đ ng c a các enzyme đó mà phân t c ch t đư c th y phân hoàn toàn t o các đ n phân N-acetyl glucosamine. C ch t th y phân c a chitinase thư ng là chitin. Chitin là m t polysacharide m ch thẳng không cu n xo n, có màu tr ng, c ng và không đàn hồi đư c t o nên từ các đ n phân N-acetyl glucosamine thông qua liên k t 1,4- glycoside. Chitin là ch t h u c đ ng th 2 trong tự nhiên sau cellulose. Trong tự nhiên, chitin gồm 3 d ng c u trúc là α, và -chitin. Trong đó, d ng α-chitin có c u trúc đ i song song gồm các chu i polysaccharide x p xen k nhau và là d ng phổ bi n nh t trong tự nhiên. α-chitin là thành phần c u t o nên b xư ng ngoài c a côn trùng, giáp xác, nhuyễn thể và vách t bào c a n m. D ng -chitin thư ng hi m h n, có c u trúc song song gồm các chu i polysaccharide x p xen k nhau và tồn t i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN d ng liên k t v i protein. D ng http://www.lrc-tnu.edu.vn/