Tài liệu Luận văn Nghiên cứu công nghệ khử nghiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao bằng 1 số chủng vi khuẩn và vi nấm

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề. Ngô, lạc là hai loại nông sản chính của ngành nông nghiệp nước ta. Chúng không chỉ là nguồn lương thực quan trọng cho đời sống con ngưòi mà còn là nguồn thức ăn quan trọng trong chăn nuôi gia súc gia cầm. Không những thế lạc còn đựơc xuất khẩu với số lượng lớn ra nước ngoài. Vì vậy việc nghiên cứu để bảo quản, nâng cao chất lượng nông sản đã thu hút các tổ chức quốc tế cũng như các cơ quan khoa học về lương thực thực phẩm của thế giới. Điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm của nước ta rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển. Các nông sản dạng hạt như ngô, lạc là nguồn cơ chất lý tưởng cho sự phát triển của nấm mốc. Nấm mốc phát triển không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của hạt mà còn sinh ra các độc tố khác nhau gọi chung là mycotoxin. Trong những độc tố nguy hiểm phải kể đến aflatoxin. aflatoxin là độc tố của nấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nominus. Ngô, lạc là hai sản phẩm thường nhiễm aflatoxin ở mức độ cao. Trên thế giới hiện nay việc nghiên cứu để tìm ra biện pháp làm giảm lượng độc tố aflatoxin trong lương thực nói chung và trong ngô, lạc nói riêng đã và đang được các nhà khoa học rất quan tâm. Ở nước ta từ những năm 1970 Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự [8] đã nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc trên thóc ở kho bảo quản lương thực miền Bắc Việt Nam và một số lương thực như đậu, đỗ, lạc…Đặng Hồng Miên [2] cũng đã nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc aflatoxin trên lạc. Nguyễn Thùy Châu và cộng sự - 1997 [11] đã nghiên cứu tình hình nhiễm độc tố nấm mốc: aflatoxin, fumonixin, ochratoxin Alternaria, deoxynivalenol và nivalenol… trên ngô, gạo, và các biện pháp phòng trừ. Khoa Công nghệ Sinh học 1 Một số công trình của Đậu Ngọc Hào về sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên thức ăn gia súc và các biện pháp khử độc tố aflatoxin B 1 bằng NH4OH cũng đã được nghiên cứu và công bố [3]. Nguyễn Thùy Châu và cộng sự cũng đã nghiên cứu khử aflatoxin trên ngô bằng NH3 và Ca(OH)2, kết quả cho thấy NH3 và Ca(OH)2 có tác dụng khử rõ rệt aflatoxin trên ngô và cho hiệu quả khử là 90%. Tuy nhiên việc khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất như NH 3 có giá thành cao và để lại mùi khó chịu cho nông sản bị xử lý. Để khắc phục nhược điểm này các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu khử nhiễm aflatoxin bằng biện pháp sinh học. Góp phần vào việc nghiên cứu công nghệ khử nhiễm aflatoxin trên ngô lạc chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu công nghệ khử nghiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao bằng một số chủng vi khuẩn và vi nấm”. 1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu. 1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu. - Tìm được công nghệ khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng một số chủng vi khuẩn và vi nấm. 1.2.2. Nội dung nghiên cứu. - Nghiên cứu khả năng khử nhiễm aflatoxin của một số chủng Rhizopusdelemar. - Nghiên cứu khả năng khử nhiễm aflatoxin của một số chủng Flavobacterium aurantiacum. - Nghiên cứu một số yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm và thời gian xử lý cho việc khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng chủng Rhizopusdelemar có hoạt tính khử nhiễm cao. Khoa Công nghệ Sinh học 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Đại cương về độc tố nấm mốc Độc tố nấm mốc (hay còn gọi là mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các nấm mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá và gia cầm [15]. Sự sinh trưởng và phát triển của nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái (Moreau 1975) [6]. Những điều kiện đó là vùng sinh thái, khí hậu (nhiệt độ, độ ẩm), lượng nước có trong cơ chất…Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của sự tác động qua lại giữa kiểu gen (genotype) và điều kiện phát triển của chúng. Độc tố nấm là sản phẩm thứ cấp tiết ra trong quá trình chuyển hóa của một số loài nấm mốc. Quá trình trao đổi chất của nấm gồm 2 giai đoạn: trao đổi chất sơ cấp và trao đổi chất thứ cấp. Trao đổi chất sơ cấp được hiểu là các phản ứng tạo thành các chất cần thiết đảm bảo sự sống và sự phát triển của tế bào. Trao đổi chất thứ cấp là quá trình tạo thành các chất mà vai trò sinh lý của chúng chưa thật cần thiết cho sự tồn tại của chính tế bào đó. Quá trình trao đổi chất sơ cấp của tế bào nhìn chung là giống nhau ở hệ thống sống, nhưng quá trình trao đổi chất thứ cấp thì phụ thuộc khá chặt chẽ vào đặc tính của mỗi loài mỗi chủng nấm mốc.Thông thường quá trình này xảy ra vào cuối giai đoạn phát triển của tế bào nấm mốc. Bệnh độc tố nấm mốc được bắt đầu nghiên cứu sâu từ khi mà cả thế giới bị thức tỉnh bằng việc phát hiện bệnh X ở gà tây của nước Anh vào năm 1960. Bệnh X đã làm chết hàng vạn con gà tây do ăn lạc bị nhiễm loài nấm mốc rất phổ biến là A. flavus. Hầu như tất cả các sản phẩm thực vật đều có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo, do đó nó có Khả năng nhiễm trực tiếp vào thực phẩm của con người. Khi gia súc ăn các thức ăn có Khoa Công nghệ Sinh học 3 mycotoxin chúng không chỉ chịu tác dụng độc trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt và như vậy tạo sự nhiễm mycotoxin vào con người. Những độc tính của mycotoxin đối với động vật thực nghiệm đã được chứng minh là rất lớn. Các mycotoxin đã thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học ở nhiều lĩnh vực khác nhau.Nó đã được chứng tỏ bằng nhiều hội nghị quốc tế và hội thảo, tạp chí và các bài báo nghiên cứu dành cho vấn đề có tính cấp thiết này [22]. Cho đến nay có trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên cứu. Nhưng chỉ có 20 loại mycotoxin có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và thường liên quan đến an toàn thực phẩm, chúng được tạo bởi 5 chi nấm Claviceps, Penillium, Apergilus, Fusarium, Alternaria. Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), sterimatocystin, acid cyclopianzoic. Các độc tố của Penillium: Patulin, ochratoxin A, citrinin, penitremA, và acid cyclopianzoic toxin, diacetocyscirpenol, fumonsin, và moniliformin. Các độc tố của nấm Fusarium: Deoxynivalenol, nivalenol, zearelenon, T-2 toxin. Các độc tố của Alternaria: acid tenuazoic, alternarion,methyl ether alternarion Các độc tố của Claviceps: Các alkanloid Ergot [14] 2.2.Độc tố aflatoxin Trong số các mycotoxin thì aflatoxin là độc tố được phát hiện sớm nhất và được nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện. 2.2.1.Tích chất hóa lý Các aflatoxin gồm bốn hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản phẩm trao đổi chất tạo bởi nấm A. flavus và A. parasiticus được đặt tên là B1, B2, G1, G2 .Các aflatoxin nhiễm trên các sản phẩm thực vật. Khoa Công nghệ Sinh học 4 Các công thức cấu tạo của một số aflatoxin và các chất trao đổi liên quan đến aflatoxin B1,G1 và aflatoxin B2, G2, là dẫn xuất hydro của các hợp chất mẹ. Các aflatoxin M1, M2 là các chất trao đổi hydroxilat hóa của B1 và B2 theo thứ tự. Chúng có công thức cấu tạo như sau: O O O Aflatoxin B1 O O O Aflatoxin O B2 O O OCH3 O O O Aflatoxin M1O O O OH OCH3 O O OCH3 O Aflatoxin M2 O OH O O O O OCH3 O O O O O Aflatoxin G2 Aflatoxin G1 OCH3 Khoa Công O nghệOSinh học O O OCH3 5 Bốn hợp chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng. B là chữ viết tắt của Blue (màu xanh nước biển), chữ G là viết tắt của Green (màu xanh lá cây). Aflatoxin B1 và B2 trong sữa bò được chuyển hóa và gọi là aflatoxin M1 và aflatoxin M2 (M là chữ viết tắt của Milk). Trong bốn loại aflatoxin, aflatoxin M1 được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, sau đó là G 1 còn B2 và G 2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn. Các aflatoxin phát quang mạnh khi dưới ánh sáng cực tím sóng dài. Điều này cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực thấp (0.5ng hay thấp hơn trên một vét sắc kí bản mỏng). Nó cung cấp điểm cơ bản về mặt thực hành cho tất cả phương pháp hóa lý cho việc phát hiện và định lượng. Aflatoxin M1 ở nồng độ 0.02mg/l có thể phát hiện được trong sữa lỏng. Các aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như chloroform và metanol đăc biệt tan nhiều trong dimethysunfoxit (dung môi thường được sử dụng như phương tiện trong việc áp dụng các aflatoxin vào các động vật thực nghiệm). Tính tan của aflatoxin trong nước dao động từ 1020mg/l. Vì là chất tinh khiết nên các aflatoxin rất bền ở nhiệt độ cao, khi được làm nóng trong không khí. Tuy nhiên nó tương đối không bền khi được để trong không khí dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng và đặc biệt khi hòa tan ở các dung môi có độ phân cực cao. Các aflatoxin ít hoặc không bị phá hủy dưới điều kiện nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng. Tuy nhiên, lạc rang đã giảm đặc biệt lượng aflatoxin và nó có thể bị phá hủy hoàn toàn bằng amoniac hay hypochlorit. Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủy phân trong môi trường kiềm, đặc tính này là quan trọng trong bất kỳ quá trình chế biến thực phẩm, vì quá trình xử lý kiềm làm giảm sự nhiễm của aflatoxin trong sản phẩm, mặc dầu sự có mặt của pH, protein trong sản phẩm Khoa Công nghệ Sinh học 6 và thời gian xử lý có thể thay đổi kết quả. Tuy nhiên nếu xử lý kiềm là nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu. Moreau và cộng sự [6] khi nghiên cứu tích chất của aflatoxin đã đưa ra những kết quả sau: Bảng 2.1.Tích chất hóa lý của một số Aflatoxin Nhiệt độ nóng chảy Công thức phân tử Trọng lượng phân tử B1 C17H12O6 312 268-269 265-270 252-266 Xanh lam B2 C17H14O6 314 286-289 305-309 280-283 Xanh lam G1 C17H12O7 328 244-246 247-250 246-247 Xanh lục G2 C17H14O7 330 229-231 237-240 Xanh lục M1 C17H12O7 328 299 Xanh lam tím M2 C17H14O7 320 293 Tím Aflatoxin * ** *** Huỳnh quang Ghi chú: *: kết quả của Townsend * *: kết quả của Stubblefield * * *: kết quả của Beljaas 2.2.2. Sự tạo aflatoxin do các nấm mốc Khả năng tạo aflatoxin thường được thấy ở hai chủng A. flavus và A. Parasiticus. Khoa Công nghệ Sinh học 7 Các chủng Aspergillus tạo aflatoxin rất phổ biến và thường được phân lập từ những nguyên liệu khác nhau. Bảng (2.2) cho thấy các chủng A. flavus phân lập được có khả năng tạo aflatoxin với tỷ lệ cao (từ 20-98%). Bảng 2.2. Các chủng tạo aflatoxin của A. flavus phân lập từ bốn loại hạt cốc Nguồn Số chủng phân lập Phần trăm chủng phân lập tạo aflatoxin (%) Lạc 100 98 3300 Hạt bông 59 81 3200 Gạo 127 20 1100 Lúa 63 24 3300 Sản lượng tạo aflatoxin (µ/kg) (Số liệu Schroder và Boller 1976) Sản lượng aflatoxin thường tỷ lệ với trọng lượng hệ sợi nấm tạo thành khi nuôi cấy: khi số lượng hệ sợi nấm đạt giá trị tối ưu thì sản lượng aflatoxin lớn nhất. Độc tố này sẽ giảm sút nhanh chóng khi hệ sợi nấm phân giải. Sự sản sinh aflatoxin trong điều kiện nuôi cấy thông thường bắt đầu từ lúc hình thành các cơ quan mang bào tử đính của A. flavus, nó tăng dần cho đến giai đoạn sinh bào tử mạnh mẽ [6]. 2.2.3. Điều kiện sinh độc tố Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích và cực đại cho sự tạo aflatoxin là 12 oC, 27oC và 40-42oC theo thứ tự. Northolt đã nhiên cứu tác dụng của hoạt tính nước và nhiệt độ lên sự phát triển và sự tạo aflatoxin của A. parasiticus và đi đến kết luận rằng: aflatoxin được tạo ra ở hoạt độ nhỏ hơn 0.83 và nhiệt độ Khoa Công nghệ Sinh học 8 dưới 10oC là rất ít và không phát hiện được [22]. Tóm lại, khả năng sinh độc tố phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đó là chủng nấm mốc, nhiệt độ và yếu tố môi trường. Lượng aflatoxin sản sinh ra cũng thay đổi phụ thuộc vào các yếu tố này. Một số chủng sinh aflatoxin có thể bị mất khả năng này sau nhiều lần cấy truyền liên tiếp trên môi trường tổng hợp nhưng cũng có thể làm tăng tính độc của chúng nếu cấy truyền trên các môi trường thích hợp. Khi hệ sợi nấm càng phát nhiều thì khả năng sinh độc tố càng mạnh và ngược lại. Môi trường có bổ sung nấm men hoặc pepton hoặc các acid amin cùng với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH=5-5.4, nhiệt độ 26-28oC) là điều kiện tốt nhất cho sự tạo thành độc tố aflatoxin. Hàm ẩm của cơ chất cũng là yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin cho thấy rằng hàm ẩm 18.3% trên cơ sở trọng lượng ẩm là giới hạn dưới đối với sự phát triển của A. flavus ở ngô bóc vỏ. Các nghiên cứu sâu hơn trong điều kiện khống chế chính xác cho thấy hàm ẩm cân bằng với độ ẩm tương đối 85% là giới hạn dưới của sự phát triển A. flavus ở tinh bột. Ngoài ra các vitamin nhóm B cũng kích thích sự tạo thành các aflatoxin. Người ta đã xác định được rằng khi A. flavus phát triển trên hạt lúa mì thì hàm lượng aflatoxin tạo ra ở giai đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn giai đoạn phôi nhũ. Việc thêm nước chiết từ lúa mì, lipit hay các acid béo sẽ kích thích tốt sự tạo thành aflatoxin. Điều này khiến người ta nghĩ rằng các chất này có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp aflatoxin vì sự phân hủy của chúng tạo thành các chất tiền sản phẩm tham gia vào vòng chuyển hóa sinh tổng hợp aflatoxin. Khoa Công nghệ Sinh học 9 2.2.4. Sự nhiễm aflatoxin trên lương thực thực phẩm. Các hạt lạc có thể bị nhiễm A. flavus trước khi thu hoạch nhưng bị nhiễm nhanh hơn sau khi cây lạc được nhổ lên và làm khô sơ bộ trước khi củ lạc được lấy ra khỏi cây.Thời gian sau thu hoạch này là thời gian nhiễm độc cao đối với sự tạo thành aflatoxin. Các côn trùng gây thương tổn cho hạt cũng là yếu tố đối với sự nhiễm A. flavus. 2.2.4.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới Sự gây thương tổn do côn trùng do ngô ở ngoài đồng cũng có thể đi kèm hoặc tiếp theo sự nhiễm A. flavus và sự tạo aflatoxin trước thu hoạch. Theo ước tính của tổ chức Nông lương quốc tế (FAO) thì có khoảng 25% nông sản của thế giới chịu ảnh hưởng nghiêm trọng bởi mycotoxin, chủ yếu là aflatoxin. Aflatoxin đã làm thiệt hại cho ngành trồng trọt và chăn nuôi rất lớn [22]. Mặc dù aflatoxin được tìm thấy trong nhiều loại lương thực, thực phẩm khác nhau nhưng hầu hết sự nhiễm tập trung ở lạc, các hạt có dầu khác như bông, ngô, và các sản phẩm được chế biến từ chúng. Hạt dẻ Braxin là thường nhiễm nhất. Bên cạnh đó, lúa mạch ở Ấn Độ cũng bị nhiễm aflatoxin. Những nghiên cứu của Ablas K. và cộng sự (2004) cho thấy sự nhiễm aflatoxin trên ngô do nấm A. flavus gây nên là một vấn đề nghiêm trọng ở các vùng trồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ. Trong 3 năm nghiên cứu từ 2000 đến 2002, các tác giả đã nghiên cứu mức nhiễm A. flavus trong đất và đã xác định rằng mức nhiễm A. flavus trong đất trồng ngô bị ảnh hưởng bởi các vụ canh tác trước. Mật độ A. flavus cao nhất là 794 CFU/g, trong đất trồng ngô vụ 2001 so với 251 CFU/g trong đất trồng bông gối vụ năm 2000 và 457 CFU/g đất trồng lúa mì gối vụ năm 2002. Sự nhiễm A. flavus trên ngô hạt năm 2000 dao động từ 0% đến 100% (trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm lượng aflatoxin trong ngô dao động từ 0 đến 1590 ppb (trung bình là 57ppb). Khoa Công nghệ Sinh học 10 Ở Thái Lan 35% mẫu ngô nhiễm aflatoxin B1 với hàm lượng trung bình 400 microgam/kg. Ở Uganda tỷ lệ này là 40% hàm lượng trung bình là 133 microgam/kg và đặc biệt ở đảo Sebu (Philippin) tỷ lệ nhiễm tới 79%, hàm lượng phát hiện được là 231 microgam/kg. Hàm lượng các mẫu ngô ở các gia đình đã liên quan đến sự bùng nổ của bệnh gan, độc tố gây cấp tính của Tây bắc Ấn Độ [22]. Theo kết quả nghiên cứu của Goto và cộng sự [16] trong mùa mưa năm 1984, 1985 ở Thái Lan 85% số mẫu ngô thu thập được từ các kho bảo quản đã nhiễm aflatoxin B1 với hàm lượng 6.3-1310 ppb và 0.6-767 ppb theo thứ tự. 2.2.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự [8] đã nghiên cứu mức độ nhiễm mốc trên ngô, kết quả là 38 mẫu bảo quản trong kho lương thực của thành phố Thanh Hóa đã nhiễm nấm mốc thuộc các chi sau: Aspergillus, Cladosporium, Penillium, Sporotrichuro, Saccharomyces, Trichoderma, Geotrichum. Tuy nhiên chưa có số liệu về mức nhiễm mycotoxin trong công trình này. Đậu Ngọc Hào và các cộng sự [5] đã nghiên cứu mức nhiễm mốc và aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hóa. Kết quả phân tích của 24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột cho thấy các mẫu này đã nhiễm nhiễm A.flavus với tỷ lệ từ 50-80%. Các loài như A. glaucus, A. candidus cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao. Loài A .ochraceus đã phát hiện thấy ở tỷ lệ thấp. Các loài của chi Fusarium đã nhiễm với tỷ lệ 15%. Kết quả nghiên cứu mức nhiễm aflatoxin ở các mẫu ngô trên đã cho thấy là 33% mẫu ngô hạt đã nhiễm aflatoxin B1 từ 10- 40 ppb, 8.3% số mẫu nhiễm aflatoxin B 2 từ 10 - 20 ppb, 72% số mẫu ngô bột đã nhiễm aflatoxin B1 từ 25 – 250 ppb, 9.5% số mẫu nhiễm aflatoxin B2 từ 10-20 ppb. Khoa Công nghệ Sinh học 11 Nguyễn Thùy Châu và cộng sự đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên nông sản của Việt Nam. Mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô và gạo ở một số địa phương cho thấy tần xuất nhiễm aflatoxin trên ngô ở miền Nam và miền Bắc Việt Nam là cao từ 73,3% - 95,8% trong đó hàm lượng aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8ppb và hàm lượng aflatoxin trung bình thấp nhất là 16,25ppb đối với các tỉnh khác nhau . Nguyễn Thùy Châu và cộng sự đã nghiên cứu công nghệ khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng một số hóa chất như NH3, foocmanđehit, Ca(OH)2 kết quả cho thấy rằng NH3 và Ca(OH)2 có tác dụng khử rõ rệt aflatoxin B1 trên ngô và cho hiệu quả đạt 90%. 2.2.5. Độc tính của Aflatoxin Tác động lên tế bào: khả năng gây ung thư của các aflatoxin đã được Wogan nghiên cứu [24] và được IARC đánh giá lại [25]. Ở mức độ tế bào việc cho uống aflatoxin với liều lượng khác nhau đã nhanh chóng ức chế enzym ADN polymeraza và ARN polymeraza ở gan, hiện tượng này được quan sát thấy ở cả tế bào người và tế bào động vật. Quá trình sinh tổng hợp protein cũng bị hỏng, đặc biệt khi quá trình này chịu ảnh hưởng mạnh của quá trình sinh tổng hợp ARN thông tin. Dường như sự ức chế polymeraza là hậu quả gián tiếp của hoạt tính mẫu bị hỏng của nhiễm sắc thể, do tương tác nhiễm sắc thể - toxin. Sự tương tác giữa aflatoxin hay một số các dẫn xuất của nó với ARN với thành phần khác của nhiễm sắc thể là sự nhận xét như sự việc ban đầu ở hàng loạt các quan sát của các phản ứng. Bằng chứng khác do sự tác động của các aflatoxin lên lưới nội chất và do đó làm thay đổi sự gắn polysome vào thành tế bào chất. Krustev và các cộng sự đã nghiên cứu các biến đổi về mặt siêu cấu trúc và hình thái bệnh học của mô gan của chuột đực liên quan đến tác dụng của liều đơn độc aflatoxin B1 [16]. Khoa Công nghệ Sinh học 12 Với liều nhiễm 6µ aflatoxin B1/100 g trọng lượng cơ thể chuôt đực, những biến đổi về mặt hình thái của tế bào gan được đặc trưng bởi sự phân ly của các thành phần hạt và sợi của nhân, sự vón nhiễm sắc thể ở ngoại biên của nhân, một vài sự biến dạng của màng nhân, làm giảm khoảng không xung quanh nhân và các giọt mỡ nhỉ ở một và nhân. Lưới nội chất xung quanh nhân ít được nhìn thấy và mất sự tạo hạt của các ribosome của chúng. Từ các bộ phận khác, đặc biệt lý thú là các ribosome, rất nhiều không chỉ ở tế bào gan mà còn ở các tế bào Kupfer. Hoạt tính photphotaza acid cũng giảm rõ rệt [16]. Tác động ở người: nhiều nghiên cứu về các vùng dân cư khác nhau trên thế giới cho thấy rằng các nồng độ aflatoxin thực tế ở thức ăn có liên quan đến tai biến ung thư gan ở vùng đó. Bảng 2.3. Tỷ lệ dân số bị ung thư gan và hàm lượng aflatoxin trung bình có trên thực phẩm. (Số liệu của Alain Reilly, 1993). Tên nước hoặc vùng Vùng cao Kenya Songkha (Thái Lan) Thảo nguyên vùng cao (Thụy sỹ) Vùng cao trung bình Kenya Thảo nguyên trung bình (Thụy Sỹ) Vùng thấp Kenya Ratbải (Thái Lan) Thảo nguyên vùng thấp (Thụy Sỹ) Môzămbic Hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm(µ/kg) 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 1,6 1,5 7,8 Tỷ lệ người mắc ung thư gan trên 105người/năm 1,2 2,0 2,2 2,5 3,8 4,0 4,0 9,2 13,0 Ba trẻ em ở Đài Loan và một trẻ em ở Uganđa đã bị hoại tử gan cấp tính liên quan đến việc ăn phải gạo và sắn nhiễm aflatoxin ở liều 200 microgam/kg Khoa Công nghệ Sinh học 13 và 1700 microgam/kg là bằng chứng thuyết phục nhất về mối liên quan giữa aflatoxin với bệnh gan cấp tính. Ở vùng Tây bắc Ấn Độ năm 1974, trong một dịch vụ vài trăm dân làng ăn ngô bị nhiễm aflatoxin ở mức 15μ/kg có dấu hiệu ngộ độc và trên 100 người đã bị chết. Các aflatoxin tác động lên gan theo trình tự như sau: đầu tiên là hoại tử mô gan, tăng sinh biểu mô, sau đó là xâm nhiễm tế bào lympho để nhằm chống đỡ tạm thời rồi đến sơ gan, nếu thời gian kéo dài sẽ dẫn đến ung thư gan. Nhưng bản chất aflatoxin không gây ung thư mà do nó gắn vào một enzym dẫn đến ung thư, khả năng này phụ thuộc vào sự tồn tại của nhân dihydrofuran và phần 5 lacton chứa nó, do đó nó đổi phần tận cùng difuran quan trọng trong tính độc và tính gây độc. 2.2.6. Giới hạn Aflatoxin cho phép Nhiều nước đã quy định giới hạn aflatoxin bị nhiễm trong lương thực, thực phẩm ở mức 5-20 microgam/kg. Tổ chức tiêu chuẩn hóa thực phẩm thế giới (Codex) quy định là 10 microgam/kg. Tại Việt Nam Bộ Nông Nghiệp và phát triển nông thôn cũng đã đưa ra quy định về hàm lượng tối đa aflatoxin B 1 và hàm lượng tổng số các aflatoxin (B1 +B2 +G1+G2) được tính bằng mg trong 1 kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia cầm gia súc (ppb) [22]. Bảng 2.4. Quy định về độc tố aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số của Việt Nam Loại vật nuôi Aflatoxin B1(ppb) Tổng số các aflatoxin (ppb) Gà con từ 1-28 ngày tuổi Nhóm gà còn lại Vịt con từ 1-28 ngày tuổi Nhóm vịt còn lại Heo con theo mẹ 1-20 ngày tu Nhóm heo còn lại Bò nuôi lấy sữa ≤ 20 ≤ 30 Không có ≤ 10 ≤ 10 ≤ 100 ≤ 20 ≤ 30 ≤ 50 ≤ 10 ≤ 20 ≤ 30 ≤ 200 ≤ 50 Khoa Công nghệ Sinh học 14 Bảng 2.5. Những quy định mức cho phép aflatoxin trong thức ăn ở Mỹ (FAO,1995) Loại thực liệu Mọi thức ăn (người) trừ sữa Sữa (làm thức ăn cho người) Nguyên liệu thức ăn gia súc Hạt bông vải làm nguyên liệu thức ăn cho bò thịt, heo, gia cầm Bắp và khô dầu phộng (cho bò,heo,gia cầm trưởng thành vỗ béo) Bắp cho thú non và bò sữa Bắp cho thú ,bò thịt, heo,gà giống Bắp cho bò thịt vỗ béo Bắp cho heo vỗ béo Loại aflatoxin Mức cho phép (ppb) B1+B2+G1+G2 M1 B1+B2+G1+G2 20 0.5 20 B1+B2+G1+G2 300 B1+B2+G1+G2 200 B1+B2+G1+G2 B1+B2+G1+G2 B1+B2+G1+G2 B1+B2+G1+G2 20 100 300 200 2.3. Vấn đề khử nhiễm các mycotoxin Sự nhiễm aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc có thể gây nguy hiểm đến sức khỏe con người và động vật. Vì vậy các nhà khoa học đã cố gắng tìm kiếm các phương pháp để loại trừ hay phá hủy các aflatoxin trong các sản phẩm bị nhiễm. Phương pháp giải quyết tốt nhất là kiềm chế aflatoxin và phòng ngừa. Tuy nhiên sự nhiễm aflatoxin đôi khi là không thể tránh được, và nếu phòng ngừa thất bại thì phải xem tới các biện pháp khác. Các kỹ thuật dùng để khử aflatoxin trong các mặt hàng khác nhau bao gồm phòng trừ bằng phương pháp vật lý, hóa học và sinh học. Khoa Công nghệ Sinh học 15 2.3.1. Vấn đề phòng ngừa Vấn đề phòng ngừa sự nhiễm Aspergillus sản sinh aflatoxin có thể đưa ra những biện pháp kiềm chế có lợi và hiệu quả nhất. Nó có thể làm giảm phần lớn những tổn thất lương thực do nấm mốc gây hại. Sau đây là một số biện pháp phòng chống nấm mốc cho lương thực trong quá trình bảo quản: - Làm khô bằng nhiệt: Làm khô tự nhiên ( phơi dưới ánh nắng mặt trời). Sấy khô ( hàn, điện) làm cho các cơ chất đạt lượng nước cho phép. Ví dụ ngô cần làm khô tới ≤ 13% trước khi bảo quản. Phần lớn các loại nấm mốc phát triển tốt ở hàm lượng cơ chất 18-25%. - Chiếu xạ: Chiếu xạ tia cực tím, tia λ với mục đích tiêu diệt các loại vi khuẩn, nấm mốc để làm giảm thiệt hại do chúng gây ra, các tia này làm biến đổi cấu trúc chủ yếu của các axit amin, axit nucleic, protein làm tác động chuyển hóa tế bào, tác dụng diệt nấm, diệt vi khuẩn. Phần lớn các loài nấm mốc bị diệt ở liều 4.5 kgy (1kgy = 100 Krad = 1kJ/kg). - Sử dụng các loại khí: Metylbromid ở liều 129 mg/l/Penillium hoặc 40mg/l/Penillium có thể diệt được nhiều loại nấm mốc. Khí ozon ở liều 10mg/m3 không khí được xác định liên tục trong nhiều ngày có thể ngăn cản sự phát triển của nấm mốc. Khí CO2 được ứng dụng trong bảo quản lương thực trong túi PE kín có thể chống được nấm mốc. - Hoá học : Được ứng dụng và nghiên cứu do tích chất an toàn của một số hoá chất, đặc biệt là các axit hữu cơ: axit sorbic, axit propionic, axit acetic, axit benzoic các muối Na và Ca của chúng như canxipropionat hay natripionat ở liều 1-3% các axit hoặc muối của axit trên có thể ức chế sự phát triển của nấm mốc trong thời gian dài. Một số hợp chất hữu cơ khác thiosulfit, Na 2SO3, KHSO2, NaHSO3, Na2S2O5 thiabendazon diphing, tinh dầu thực vật( tinh dầu cam ở liều 0.2%) có thể ức chế được nhiều loại nấm mốc, mentho liều 1.1% Khoa Công nghệ Sinh học 16 một số tinh dầu khác: tinh dầu hôi tinh dầu được chiết từ cây tỏi có tác dụng ức chế nấm mốc. - Sinh học: Dùng các loại cây có sẵn trong thiên nhiên để chống nấm mốc thực phẩm. Ví dụ dùng lá cây xoan hoặc lá hoa cúc vàng để xông vì cả hai loại lá cây này đều có tinh dầu, axit focmic. Đó là những chất sát khuẩn, kháng khuẩn. Khi xông bằng hai loại lá này thì ngô có độ ẩm 10-13% có thể kéo dài thời gian bảo quản 30 ngày. - Vô hoạt hay mất hoạt tính bằng phương pháp vật lý: ít có hiệu quả vì aflatoxin có thể chịu nhiệt được nhiệt độ >100-105oC. Nếu chiếu xạ 10kgy thì sẽ gây ảnh hưởng tới nguyên liệu. Dùng hấp ướt (autoclve) 1.5at trong 60 phút nhưng lại ít có giá trị ứng dụng trong thực tế. - Phương pháp hấp thụ: Các chất hấp thụ như silicagel, axit nhân silic, than hoạt tính… có tác dụng rất tốt để hấp thụ aflatoxin trong quá trình tiêu hóa, các aflatoxin được hấp thụ sẽ được thải ra ngòai qua phân. - Làm mất hoạt tính bằng các hợp chất oxi hóa khử Na2SO4, NaHSO3, 1% hoặc 2% có tác dụng vô hoạt aflatoxin. Hiện nay người ta sử dụng NH3 ở dạng khí nén được bơm tuần hoàn vào các thùng chứa ngô bằng thép (Metal silo) hoặc trong các túi PE có thể chứa đến 2030 tấn ngô. Ngô có hàm lượng aflatoxin 750ppb sau 13 ngày xử lý, với 1.5 % NH3 ở nhiệt độ 32oC đã làm giảm xuống còn 7 ppb. 2.3.2. Các phương pháp khử độc tố bằng hóa chất Nhiều hóa chất có thể phá hủy aflatoxin tinh khiết hayaaflatoxin trong các nguyên liệu nhiễm tự nhiên. Những hóa chất này bao gồm: chlorine, ozon, acid hydrochloric, peroxit benzoic, amoniac, natri hydrochlorit và etanolamin. Các hóa chất dùng cho việc khử độc tố aflatoxin phải thỏa mãn các tiêu chuẩn sau: - Phải phá hủy hay khử aflatoxin Khoa Công nghệ Sinh học 17 - Không được tạo hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc hay gây ung thư ở sản phẩm cuối cùng. Phải phá hủy các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi, chúng có thể tái nhiễm lại ở sản phẩm. Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban đầu. Nhiều hóa chất khảo sát đã không thỏa mãn tất cả các tiêu chuẩn trên. Mặc dù chúng phá hủy các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm có tác dụng phụ không mong muốn. Một số quá trình xử lý bằng hóa chất có hiệu quả trong việc phá hủy các afatoxin thỏa mãn những tiêu chuẩn trên. Trong số này hydrogen peroxit, natri hydroxit và natri hydroclorit dường như có khả năng trong việc khử afltaoxin từ các sản phẩm giàu protein hay các sản phẩm dùng cho người ăn, trong khi đó dimetylamin hay amoniac có thể áp dụng cho việc khử độc tố các hạt có dầu. 2.3.3. Giảm hàm lượng aflatoxin bằng biện pháp sinh học Nhiều loại hóa chất có thể phá hủy aflatoxin tinh khiết hoặc các aflatoxin trong các nguyên liệu tự nhiễm tự nhiên khác như: chlorin, ozon, acid hydrôchloric…Các hóa chất này mặc dầu phá hủy aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm phụ có tác dụng không mong muốn. Do vậy việc sử dụng các biện pháp sinh học không có hại cho con người và thực phẩm mà lại có khả năng làm giảm sự tạo độc tố hoặc ức chế hoàn toàn việc tạo độc tố là biện pháp lý tưởng. Một số chủng nấm mốc và vi khuẩn có khả năng giảm sự tạo độc tố thì ngoài việc đảm bảo tính an toàn không độc hại đối với con người và thực Khoa Công nghệ Sinh học 18 phẩm được xử lý, đôi khi cần phải thỏa mãn một số yêu cầu khác, chẳng hạn Streptorocus lactic đòi hỏi nuôi trên môi trường dinh dưỡng đặc biệt nên không thể thích hợp đối với việc xử lý trên ngũ cốc và thực phẩm. Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá giới hạn cho phép sử dụng là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hoá chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản. Khử độc tố bằng biện pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzym hay chuyển hoá sinh học của các độc tố nấm. 2.3.3.1. Khử nhiễm aflatoxin bằng chủng Flavobacteroum aurantiacum Flavobacterium aurantiacum là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí tế bào hình que, dạng thuôn dài, kích thước chiều dài 2-5 µm, rộng 0.3-0.5 µm, jhông có khả năng di động. Khuẩn lạc trên thạch có màu từ vàng kem đến màu vàng cam. Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như Claude Morro (1970), Cotty Pitter (1992) đã cho thấy vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum có khả năng phân huỷ aflatoxin. Nó có khả năng phân hủy aflatoxin một cách không trở lại cả từ môi trường rắn và môi trường lỏng. Khả năng loại trừ aflatoxin B 1 của vi khuẩn này từ các thực phẩm đã được chứng minh ở các loại dầu thực vật lạc, ngô, bơ lạc và sữa lạc. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng yếu tố có vai trò quan trọng trong việc phân giải aflatoxin B 1 bằng chất chiết của Flavobacterium aurantiacum có thể là protein với các tính chất enzym. Khả năng sử dụng chất chiết protein thô từ Flavobacterium aurantiacum được tinh chế trong công nghiệp thực phẩm đã được Cộng đồng Châu Âu và cơ quan Khoa Công nghệ Sinh học 19 Quản lý thực phẩm và thuốc của Mỹ đề nghị như các biện pháp loại trừ aflatoxin từ các thực phẩm bị nhiễm. 2.3.3.2. Khử nhiễm aflatoxin bằng chủng Rhizopus delemar. Theo Larone Rhizopus delemar là lòai phổ biến trong thiên nhiên như trong đất, không khí, hoa quả thối, trong xác động thực vật và trong bánh mì để lâu ngày. Rhizopus delemar thường phát triển khuẩn ty bao phủ phần bên ngoài cở chất. Khuẩn ty của Rhizopus delemar không có vách ngăn. Khi còn non sợi khuẩn ty có dạng sợi bông vải màu trắng. Khi trưởng thành sợi khuẩn ty có màu xám, khi già chuyển thành màu xám hơi vàng. Khuẩn lạc Rhizopus delemar phát triển rất nhanh trên môi trừơng PDA. Mặt trắng của khuẩn lạc có màu trắng nhợt. Cuống sinh bào tử hình tròn hoặc hình trứng, đường kính 4-11µm, bề mặt trơn. Nhiệt độ là 25oC và pH tối ưu của Rhizopus delemar là 5.5-5.8. Zhu C.R. và cộng sự (1989) đã nghiên cứu tác dụng khử nhiễm aflatoxin của Rhizopus delemar bằng thực nghiệm trên chuột nhắt có nhiễm aflatoxin. aflatoxin B1 đã được đưa vào nước uống cho chuột nhắt cái ở liều 126 g trong một tuần và toàn thể liều thử là 3,40 mg trong thời gian 27 tuần. Chất chiết của Rhizopus delemar đã được đưa đồng thời vào nhóm chuột này bằng việc trộn dung dịch aflatoxin B1. Chuột được giết riêng biệt vào các tuần tuổi 18. 30, 38, và 52. Các ổ bệnh thay đổi tế bào gan và các mô ung thư đã được định lượng bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử và bằng các phản ứng enzym. Ở nhóm chuột ăn thức ăn nhiễm aflatoxin B 1, tai biến ung thư gan là 71%. Ở nhóm chuột ăn thức ăn có Rhizopus delemar cùng với aflatoxin B1, các ổ bệnh phát triển quá mức và các ổ bệnh có triệu chứng bệnh Khoa Công nghệ Sinh học 20