Tài liệu Khóa luận Định danh nhóm nấm trichoderma spp phân lập tại Việt Nam

B TR GIÁO D C VÀ ĐÀO T O NG Đ I H C NÔNG LÂM TP. HCM ------ KHÓA LU N T T NGHI P Đ NH DANH VÀ PHÂN NHÓM N M Trichoderma spp. PHÂN L P T I VI T NAM Ngành h c: CÔNG NGH SINH H C Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hi n: NGUY N TH KH TÚ Thành ph H Chí Minh Tháng 9/2007 B TR GIÁO D C VÀ ĐÀO T O NG Đ I H C NÔNG LÂM TP. HCM B MÔN CÔNG NGH SINH H C ------- Đ NH DANH VÀ PHÂN NHÓM N M Trichoderma spp. PHÂN L P T I VI T NAM Giáo viên h ng d n Sinh viên thực hi n TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUY N TH KH TÚ Thành ph H Chí Minh Tháng 9/2007 iii “Không gì có thể so sánh đ nh ng ng c tình yêu tôi dành cho mẹ, ba, ch và em tôi, i n m gi trái tim tôi trọn đ i. Tôi luôn c m th y m áp b i sự quan tâm và tình th ng ng chân thành của nh ng i thân tộc dành cho tôi. Không bao gi quên sự quan tâm, chia sẻ và nh ng l i d y dỗ của Th y TS. Lê Đình Đôn, một ng i th y lớn. Tôi luôn tự hào vì đã đ c học t p và rèn luy n tr ng Đ i học Nông Lâm Thành phố H Chí Minh nói chung và bộ môn Công ngh sinh học nói riêng. G i l i c m n sâu s c đ n anh Nguy n Văn L m, ch Tr n Th Vân, Nguy n Th Thùy D ng, Ph m Th Minh Ki u, Tr nh Th Ph ng Vy và các Anh, Ch vi n Nghiên cứu Công ngh sinh học và Công ngh môi tr ng, tr ng Đ i học Nông Lâm Thành phố H Chí Minh đã luôn quan tâm, t n tình giúp đỡ và h ớng d n tôi trong suốt th i gian thực hi n đ tài này. Luôn nhớ đ n các b n cùng lớp DH03SH với tôi và các b n khoa Nông học cùng làm chung phòng 105, bộ môn B o v Thực v t, khoa Nông học, tr học Nông Lâm Thành phố H Chí Minh, nh ng ng ng Đ i i th t đáng m n. Có nh ng giai đo n th t khó khăn trong cuộc sống và tôi th t may m n có đ ng c i b n đã ch u đựng và luôn làm tôi c m th y m áp. C m n mày nhi u l m Tuy n”. Nguy n Th Kh Tú iii TÓM T T Đ tài: “Đ nh danh và phân nhóm n m Trichoderma spp. phân l p t i Vi t Nam” do Nguy n Th Kh Tú thực hi n từ 19/3/2007 đ n ngày 19/8/2007 t i bộ môn B o v thực v t, khoa Nông học, tr ng Đ i học Nông Lâm Thành phố H Chí Minh và phòng Công ngh sinh học thực v t, vi n Nghiên cứu Công ngh sinh học và Công ngh môi tr ng, tr ng Đ i học Nông Lâm Thành phố H Chí Minh. M c đích Đ nh danh tên loài 11 dòng n m Trichoderma spp. phân l p Vi t Nam. Phân nhóm và xác đ nh mối qua h di truy n gi a 11 dòng Trichoderma spp.. Xác đ nh mối quan h di truy n 11 dòng Trichoderma spp. (Trichoderma) với d li u của chúng Ph các vùng sinh thái, đ a lý khác nhau trên th giới. ng pháp thực hi n K t qu đ nh danh dựa vào hình thái k t h p với k t qu so sánh trình tự vùng b o t n ITS – rDNA (Internal Transcribed Space – rDNA) và một ph n vùng chức năng tef1 (4th large intron) (EF – 1α, Translation Elongation Factor – 1 alpha) với d li u của chúng trên NCBI bằng ph n m m ClustalX 1.83. So sánh trình tự vùng ITS – rDNA và một ph n vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma bằng ph n m m ClustalX 1.83 và đọc k t qu bằng ph n m m TreeView 1.6.6. Trình tự vùng ITS – rDNA và một ph n vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma đ c so sánh với d li u của chúng các vùng sinh thái, đ a lý khác nhau trên th giới bằng ph n m m ClustalX 1.83 và đọc k t qu bằng ph n m m TreeView 1.6.6. K t qu đ t đ c Khẳng đ nh tên loài chính xác 10 dòng Trichoderma. Thi t l p và thể hi n rõ đ c mối quan h di truy n gi a 11 dòng Trichoderma. 11 dòng Trichoderma Vi t Nam thuộc 5 loài T. longibrachiatum, T. asperellum, T. atroviride, T. harzianum, T. virens (trừ dòng T. asperellum (T6)) có quan h di truy n khá xa so với các dòng trên th giới. 10 dòng có ngu n gốc b n đ a và dòng iv T. asperellum (T6) là dòng ngo i lai du nh p vào n ớc ta. Mối quan h di truy n gi a 5 loài này là b n v ng và phù h p với mối quan h v hình thái. K t lu n Với k t qu đ nh danh dựa vào hình thái k t h p trình tự vùng ITS – rDNA và một ph n vùng tef1 có thể đ nh danh chính xác tên loài và xác đ nh đ c mối quan h di truy n gi a các loài cũng nh các dòng trong cùng loài của Trichoderma. S d ng trình tự vùng ITS – rDNA và nh t là trình tự một ph n vùng tef1 có thể phân bi t gi a dòng Trichoderma b n đ a với các dòng ngo i lai. M ra triển vọng cho các nghiên cứu và ứng d ng ti p theo của ph v ng pháp đ nh danh trong đ tài. ABSTRACT “Identifying and grouping of Trichoderma spp. collected in Viet Nam”, thesis is carried out by Nguyen Thi Kha Tu, from 19 Mar, 2007 to 19 Aug, 2007 at Plant Protection Pepartment, Argonomy Faculty, Nong Lam University and Phytobiotechnology Laboratory, Reseach Institute Biological and Enviromental Technology, Nong Lam University. This thesis was based on molds identified results then using Clustal 1.83 and Treeview 1.6.6 software to compare ITS – rDNA (Internal Transcribed Space – rDNA) stable and apart of tef1 (EF – 1α, Translation Elongation Factor – 1 alpha) funtional regions with their data on NCBI to identifying species and grouping of 11 Trichoderma genus. Finally, ITS – rDNA and apart of tef1 regions of 11 Trichoderma genus were compared with their data at different ecological, geographic areas on over the world to clear the genetic relationship. The results show that confirming exactly the species of 10 Trichoderma genus, T68 genus was identified T. atroviride. Establishing and clearing the genetic relationship among 11 Trichoderma genus. In which, 11 Trichoderma genus in Viet Nam of 5 species T. longibrachiatum, T. asperellum, T. atroviride, T. harzianum , T. virens (except T. asperellum genus (T6)) have a rather far genetic relationship from others in the world. 10 genus orginated from locality and T. asperellum (T6) is the one migrated in our country. Genetic relationship among 5 species is stable and suitable with morphological characteristics. vi M CL C TÓM T T ................................................................................................................. iv ABSTRACT .............................................................................................................. vi M C L C ................................................................................................................. vi DANH SÁCH CÁC CH VI T T T .......................................................................x DANH SÁCH CÁC B NG ..................................................................................... xii DANH SÁCH CÁC HÌNH ...................................................................................... xii Ch ng 1 .....................................................................................................................0 M Đ U .....................................................................................................................0 1.1. Đặt v n đ ......................................................................................................0 1.2. M c đích ........................................................................................................0 1.3. Yêu c u ..........................................................................................................0 Ch ng 2 .....................................................................................................................2 T NG QUAN TÀI LI U ...........................................................................................2 2.1. Giới thi u v n m Trichoderma .....................................................................2 2.1.1. Phân lo i...................................................................................................2 2.1.2. Ngu n gốc ................................................................................................2 2.1.3. Đặc điểm hình thái ...................................................................................3 2.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học .......................................................4 2.1.5. C ch đối kháng với n m gây b nh cây tr ng .......................................4 2.2. C u t o t bào Trichoderma ...........................................................................6 2.3. Các ph ng pháp đ nh danh tên loài n m Trichoderma ................................7 2.4. Giới thi u v vùng rDNA và vùng ITS – rDNA ...........................................9 2.5. Giới thi u v vùng tef1.................................................................................10 2.6. Ph ng pháp đ nh l ng n ng độ DNA bằng phân t Mass .......................10 2.7. Các nghiên cứu có liên quan đ n Trichoderma và vùng rDNA ..................11 2.8. Các nghiên cứu có liên quan đ n đ nh danh và phân nhóm Trichoderma...13 Ch ng 3 ...................................................................................................................15 vii V T LI U VÀ PH NG PHÁP ............................................................................15 3.1. Th i gian, đ a điểm, đối t ng nghiên cứu ..................................................15 3.1.1. Th i gian và đ a điểm nghiên cứu .........................................................15 3.1.2. Đối t ng nghiên cứu ............................................................................15 3.2. Hoá ch t .......................................................................................................16 3.3. D ng c và thi t b .......................................................................................17 3.4. Ph c h i các dòng Trichoderma. .................................................................17 3.5. Nhân và thu sinh khối Trichoderma ............................................................17 3.6. Ly trích DNA t ng số Trichoderma .............................................................18 3.7. Kiểm tra k t qu ly trích và pha loãng DNA ...............................................18 3.8. Ph n ứng PCR ..............................................................................................19 3.9. Đánh giá k t qu PCR .................................................................................21 3.10. Đ nh danh tên loài các dòng Trichoderma ...................................................22 3.11. Phân nhóm t o ph h di truy n ..................................................................24 3.12. Xác đ nh mối quan h di truy n 11 dòng Trichoderma Vi t Nam với d li u của chúng Ch các vùng sinh thái, đ a lý khác nhau trên th giới ............................24 ng 4 ...................................................................................................................25 K T QU VÀ TH O LU N .................................................................................25 4.1. K t qu ly trích DNA ...................................................................................25 4.2. K t qu PCR khu ch đ i vùng ITS – rDNA và một ph n vùng tef1 ...........26 4.3. K t qu đ nh danh tên loài ...........................................................................27 4.4. K t qu phân nhóm t o ph h di truy n .....................................................35 4.4.1. K t qu phân nhóm từ trình tự vùng ITS – rDNA và một ph n vùng tef1 ................................................................................................................35 4.4.2. K t qu phân nhóm từ trình tự vùng ITS1, 5.8S và ITS2 – rDNA ........37 4.5. So sánh vùng ITS1 và ITS2 – rDNA với d li u của chúng trên NCBI......39 4.6. Xác đ nh mối quan h di truy n của vùng ITS – rDNA và một ph n vùng tef1 với d li u của chúng trên th giới.................................................................41 Ch ng 5 ...................................................................................................................44 viii K T LU N VÀ Đ NGH .......................................................................................44 5.1. K t lu n ........................................................................................................44 5.2. Đ ngh .........................................................................................................44 TÀI LI U THAM KH O PH L C ix DANH SÁCH CÁC CH VI T T T µg: microgram µl: microlite µM: micromol/lite dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate. DNA: Deoxyribonucleic acid EDTA: Ethylene diamin tetracetic acid. PCR: Polymerase chain reaction. RAPD: Random amplified polymorphism DNA. RNA: Ribonucleic acid. SDS: sodium dodecyl sulfate. Taq: Thermus aquaticus. TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid. TE: Tris ethylene diamine tetra acetate. Tm: Melting Tempereture (nhi t độ nóng ch y). U: Đ n v ho t tính. x DANH SÁCH CÁC B NG B ng 3. 1 Các dòng n m s d ng để đ nh danh và phân nhóm trong đ tài ...........15 B ng 3. 2 Các primer dùng trong đ tài và trình tự của chúng ...............................20 B ng 3. 3 Thành ph n ph n ứng PCR và li u l ng dùng cho một ph n ứng .......21 B ng 3. 4 Chu kỳ nhi t ph n ứng PCR ...................................................................21 B ng 3. 5 Trình tự vùng ITS – rDNA của các dòng Trichoderma trên NCBI .......22 B ng 3. 6 Trình tự vùng tef1 của các dòng Trichoderma trên NCBI .....................23 B ng 4. 1 Độ t ng đ ng di truy n (%) dòng T37 với các loài trên NCBI ............28 B ng 4. 2 Độ t ng đ ng di truy n (%) dòng T42 với các loài trên NCBI ............28 B ng 4. 3 Độ t ng đ ng di truy n (%) dòng T38 với các loài trên NCBI ............29 B ng 4. 4 Độ t ng đ ng di truy n (%) dòng T19 với các loài trên NCBI ............29 B ng 4. 5 Độ t ng đ ng di truy n (%) dòng T33 với các loài trên NCBI ............30 B ng 4. 6 Độ t ng đ ng di truy n (%) dòng T2 với các loài trên NCBI ..............30 B ng 4. 7 Độ t ng đ ng di truy n (%) dòng T14 với các loài trên NCBI ............31 B ng 4. 8 Độ t ng đ ng di truy n (%) dòng T85 với các loài trên NCBI ............31 B ng 4. 9 Độ t ng đ ng di truy n (%) dòng T88 với các loài trên NCBI ............32 B ng 4. 10 Độ t ng đ ng di truy n (%) dòng T6 với các loài trên NCBI .............32 B ng 4. 11 Độ t ng đ ng di truy n (%) dòng T68 với các loài trên NCBI ...........33 B ng 4. 12 K t qu đ nh danh tên loài các dòng Trichoderma của đ tài ...............33 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2. 1 Khuẩn ty T. harzianum (vùng màu tr ng) phát triển trên môi tr ng PDA sau 2 – 3 ngày nuôi c y và t o thành bào t (vùng màu xanh) ...................3 Hình 2. 2 K t qu Blast từ trình tự vùng ITS – rDNA của dòng có mã số truy c p là AF 3362109 trên NCBI ...............................................................................9 Hình 3. 1 S đ phân vùng và v trí primer trên vùng từ 18S đ n 28S – rDNA và v trí vùng khu ch đ i (vùng đánh d u ellip) với cặp primer ITS4 và ITS5 .20 Hình 3. 2 S đ các primer trên toàn vùng tef1 và v trí vùng khu ch đ i (vùng đánh d u ellip) với cặp primer EF1 – 728R và EF1 – 986F ..............................20 Hình 4. 1 K t qu đi n di DNA t ng số Trichoderma ly trích đ 1% c, trên gel agarose 110V, 400A trong 20 phút ..............................................................26 Hình 4. 2 K t qu đi n di DNA t ng số Trichoderma ly trích đ loãng 10 l n, trên gel agarose 1 % Hình 4. 3 K t qu đi n di trên gel agarose 1 % c sau khi pha 110 V, 400 A trong 20 phút ............26 110 V, 400 A trong 20 phút, s n phẩm PCR khu ch đ i vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5, có kích th ớc 600 bp ......................................................................................27 Hình 4. 4 K t qu đi n di trên gel agarose 1 % 110V, 400A trong 20 phút, s n phẩm PCR khu ch đ i một ph n vùng tef1với cặp primer EF1 – 728R và EF1 – 986F, có kích th ớc 320bp .............................................................27 Hình 4. 5 K t qu phân nhóm từ trình tự vùng ITS – rDNA (A) và một ph n vùng tef1 (B). ......................................................................................................36 Hình 4. 6 K t qu phân nhóm từ trình tự vùng ITS1– rDNA (A) và ITS2– rDNA (B) ...................................................................................................................38 Hình 4. 7 K t qu so sánh trình tự vùng ITS1(A) và ITS2– rDNA (B) với d li u của chúng trên th giới. .............................................................................40 Hình 4. 8 K t qu so sánh trình tự vùng ITS – rDNA của 11 dòng Trichoderma ....... Vi t Nam với d li u của chúng trên th giới ...........................................43 Hình 4. 9 K t qu so sánh trình tự một ph n vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma Vi t Nam với d li u của chúng trên th giới ...........................................42 xii Ch ng 1 M Đ U 1.1. Đặt v n đ N m Trichoderma là một lo i n m mốc có ph đối kháng rộng đối với các lo i n m gây b nh h i cây tr ng và có kh năng kích thích sự phát triển của bộ r cây. Vi c khai thác ti m năng của Trichoderma d ới d ng ch phẩm sinh học nh một tác nhân sinh học phòng trừ nhi u b nh h i cây tr ng, giúp cho cây sinh tr phát triển tốt h n đã và đang đ ng và c các n ớc trên th giới trong đó có n ớc ta r t quan tâm nhằm t o s n phẩm nông nghi p không có d l ng thuốc hóa học là một yêu c u b t buộc vì sức khỏe cộng đ ng, xu t khẩu và cân bằng môi tr ng sinh thái, h ớng đ n một n n nông nghi p b n v ng. Vì th , vi c đ nh danh chính xác tên loài và xác đ nh mối quan h di truy n của chúng tr nên th t c n thi t. Nh ng do h thống đ nh danh và phân lo i của Trichoderma v n ch a hoàn ch nh nên vi c ch dựa đ n lẻ vào hình thái, trình tự vùng b o tôn hoặc trình tự các vùng chức năng thì không thể đ nh danh chính xác tên loài của chúng (Gary J. Samuels, 2004). Khóa lu n tốt nghi p này nhằm m c đích đ nh danh tên loài với độ chính xác cao, bằng cách k t h p k t qu đ nh danh dựa vào hình thái với trình tự vùng b o t n ITS – rDNA và một ph n vùng chức năng tef1 (4th large intron) mà ph ng pháp đ nh danh ch bằng hình thái không hoàn toàn chính xác. Đ ng th i, phân nhóm t o ph h di truy n để thành l p d li u chi ti t v qu n thể n m Trichoderma phân l p từ các vùng sinh thái, đ a lý khác nhau trên lãnh th n ớc ta. 1.2. M c đích Đ nh danh tên loài va phân nhóm xác đ nh mối qua h di truy n gi a Trichoderma phân l p Vi t Nam. 11 dòng . Xác đ nh mối quan h di truy n 11 dòng Trichoderma với d li u của chúng các vùng sinh thái, đ a lý khác nhau trên th giới. 1.3. Yêu c u Ph c h i 11 dòng Trichoderma từ nh ng ống nghi m l u tr ngu n n m. Nuôi c y và nhân sinh khối Trichoderma. Ly trích DNA từ sinh khối Trichoderma với độ tinh khi t cao. Thi t l p đ c quy trình PCR khu ch đ i vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5 và một ph n vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R Xác đ nh đ c tên loài 11 dòng Trichoderma trên c s k t qu đ nh danh dựa vào hình thái k t h p với k t qu so sánh mức độ t ng đ ng của trình tự vùng ITS – rDNA và một ph n vùng tef1 với d li u của chúng trên NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) bằng ph n m m ClustalX 1.83. Phân nhóm và xác đ nh đ c mối quan h di truy n gi a 11 dòng Trichoderma thông qua vi c so sánh trình tự vùng ITS – rDNA và một ph n vùng tef1 bằng ph n m m ClustalX 1.83 và đọc kêt quả băng ph n m m TreeView 1.6.6. Đánh giá đ c mối quan h di truy n gi a trình tự vùng ITS – rDNA và một ph n vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma với d li u của chúng các vùng sinh thái, đ a lý khác nhau trên th giới bằng ph n m m ClustalX 1.83 và ph n m m TreeView 1.6.6. 1 Ch ng 2 T NG QUAN TÀI LI U 2.1. Gi i thi u v n m Trichoderma 2.1.1. Phân lo i Trichoderma là một trong nh ng nhóm vi n m gây nhi u khó khăn cho vi c đ nh danh, phân lo i do còn nhi u đặc điểm c n thi t cho vi c đ nh danh, phân lo i v n ch a đ c bi t đ y đủ. Theo truy n thống, h thống phân lo i th sự khác bi t v đặc tr ng dựa vào ng hình thái; đặc điểm bào t , cành bào t và quá trình sinh s n bào t vô tính. Năm 1801, Persoon ex Gray đã xác đ nh Trichoderma thuộc giới fungi, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreaceae, giống Trichoderma (trích d n của Clipson, N. và cs, 2001). Đã có h n 50 loài Trichoderma khác nhau đã đ c tìm th y. Trichoderma đ c phân thành 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và Hypocreanum. Trong đó, nhóm Saturnisporum không tìm th y giai đo n teleomorph (giai đo n sinh s n h u tính, đây là một d ng bi n d từ sự tái t h p do lai chéo ngo i huy t nh trong chu kì c n giới tính) và nhóm Hypocreanum hi m khi gặp có giai đo n này độc l p, ch có 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum có giai đo n teleomorph nên đ c gọi là Hypocrea, th ng không đ c dùng với m c đích kiểm soát sinh học (Gary J. Samuels, 2004). 2.1.2. Ngu n g c Trichoderma đ c tìm th y kh p mọi n i trừ nh ng vĩ độ cực Nam và cực B c. H u h t các dòng Trichoderma đ u ho i sinh, chúng ph bi n trong nh ng khu rừng nhi t đới ẩm hay c n nhi t đới, r cây, trong đ t hay trên xác sinh v t đã ch t, hoặc thực phẩm b chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên nh ng lo i n m khác (Gary J. Samuels, 2004). Trichoderma r t ít tìm th y trên thực v t sống và không sống nội kí sinh với thực v t. Mỗi dòng n m Trichoderme khác nhau có yêu c u nhi t độ và độ ẩm khác nhau (Gary E. Harman, 2000). 2 2.1.3. Đặc đi m hình thái (Gary J. Samuels, 2004) Khuẩn ty (s i n m) của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển r t nhanh, trên môi tr ng PGA ban đ u có màu tr ng, khi sinh bào t thì chuyển sang xanh đ m, xanh vàng hoặc l c tr ng. làm th ch của môi tr một số loài còn có kh năng ti t ra một số ch t ng PGA hóa vàng. Hình 2. 1 Khuẩn ty T. harzianum (vùng màu tr ng) phát triển trên môi tr ng PDA sau 2 – 3 ngày nuôi cây và t o thành bào t (vùng màu xanh) một số loài Trichoderma cuống bào t ch a đ c xác đ nh. Cuống bào t là một nhóm s i n m b n vào nhau. Một số loài khác có cuống bào t mọc lên từ nh ng c m hay nh ng nốt s n dọc theo s i n m hoặc khu vực tỏa ra của khuẩn l c (T. koningii), có kích th ớc từ 1-7 µm, có hình đ m r t r n ch c hoặc d ng nh bông không r n ch c, nh ng nốt s n d ng này đ c tách d dàng khỏi b mặt th ch agar và chúng ho t động nh ch i m m. Bào t đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên đ u cuối của cuống sinh bào t (phân nhi u nhánh), mang các bào t tr n bên trong không có vách ngăn, không màu, liên k t nhau thành chùm nhỏ nh ch t nh y. Đặc điểm n i b t của n m Trichoderma là bào t có màu xanh đặc tr ng, một số ít có màu tr ng (nh T. virens), vàng hay xanh xám. Chủ y u hình c u, hình ellip hoặc hình oval (với t l dài : rộng từ 1 – 1.1µm) hay hình ch nh t (với t l dài : rộng là h n 1.4 µm), đa số các bào t tr n láng. Kích th ớc không quá 5 m. Nh có kh năng t o thành bào t 3 chống ch u (chlamydospores) mà T. harzianum có thể t n t i 110 – 130 ngày dù không đ c cung c p ch t dinh d ỡng. Chlamydospores là nh ng c u trúc d ng ngủ làm tăng kh năng sống sót của Trichoderma trong môi tr chlamydospores có thể đ ng không đ c cung c p ch t dinh d ỡng nên c dùng để t o ch phẩm phòng trừ sinh học. 2.1.4. Đặc đi m sinh lý, sinh hóa, sinh h c Đa số các dòng n m Trichoderma phát triển Phát triển tốt trong đ t có độ pH từ 2.5 đ n 9.5. pH 4.5 – 6.5. Nhi t độ để Trichoderma phát triển tối u th 25 – 30 0C. Một vài dòng phát triển tốt 35 0C. Một số ít phát triển đ c ng là 40 0C (Gary J. Samuels, 2004). Theo Prasun K. M. và Kanthadai R. (1997) hình thái khuẩn l c và bào t của Trichoderma khác nhau khi 35 0C chúng t o ra nh ng khuẩn l c r n d th mép b t th ng, nh ng nhi t độ khác nhau. ng với sự hình thành bào t nhỏ và 37 0C không t o ra bào t sau 7 ngày nuôi c y. Trichoderma là loài s n xu t nhi u kháng sinh và enzyme nh chitinolytic (enzyme phân gi i chitin), cellulolytic (enzyme phân gi i cellulose), đây là 2 enzyme chính phân gi i thành và màng t bào, phá hủy khuẩn ty của các n m đối kháng với Trichoderma. Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng t l nẩy m m. Tuy nhiên c ch của tác động này ch a đ c bi t (Gary J. Samuels, 2004). Trong quá trình sinh s n vô tính của Trichoderma có thể x y ra hi n t ng đột bi n nên di truy n l i cho th h sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia t bào và tác động của đi u ki n môi tr ng sống khác nhau nên s d n đ n sự sai khác và đa d ng trong kiểu gen cũng nh kiểu hình của cùng một loài Trichoderma. Vì th , s t o ra nh ng dòng thích nghi tốt trong đi u ki n sinh thái, đ a lý khác nhau và đây chính là nh ng dòng r t có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng nh trong vi c t o ch phẩm sinh học kiểm soát m m b nh thực v t (Gary E. Harman, 2000). 2.1.5. C ch đ i kháng v i n m gây b nh cây tr ng (Gary J. Samuels, 2004) N m Trichoderma đ c s d ng để b o v cây tr ng chống l i n m Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytis spp., Fusarium spp. và Crinipellis spp. gây b nh khô vằn lúa; b nh thối gốc ch y mủ cam quýt, s u riêng; b nh thối gốc trên các lo i cây tr ng nh tiêu, bông, nho, b p, đ u nành, 4 m n, táo, cà rốt, hành, rau di p do có tính đối kháng với các n m h i này bằng cách c nh tranh dinh d ỡng, kí sinh với n m h i hoặc ti t kháng sinh, enzyme (chitinase, β-1,3-glucanase) phân hủy vách t bào n m gây b nh cây tr ng. Ti t kháng sinh: T. virens s n xu t gliotoxin và gliovirin, chúng kìm hãm sự phát triển của các loài Rhizoctonia solani và Pythium spp. Isonitriles đ c s n xu t b i T. hamatum, harzianum, viride, koningii, polysporum giúp h n ch sự phát triển của n m b nh. một vài loài T. atroviride và T. viride ti t 6-pentyl alpha-pyrone (α – pyrones) có h ng dừa, ho t động của lo i phytotoxin này có thể ngăn c n sự n y m m của nh ng noãn bào t n m gây b nh Phytophthrora cinnamomea và bào t của Botrytis cinnerea. Peptaibols do T. polysporum, harzianum, koningii s n xu t giúp ngăn c n sự t ng h p enzyme liên k t với màng trong sự hình thành t bào, đ ng th i ho t động hỗ tr enzyme phá huỷ thành t bào ngăn chăn sự phát triển của m m b nh và kích thích cây tr ng kháng l i m m b nh. T. virens, koningii, viride s n xu t sesquiterpenes và polyketides đ c T. harzianum s n xu t. Steroids (viridin) là một độc tố thực v t có hi u lực nh một lo i thuốc di t cỏ giúp h n ch sự n y m m của bào t , đ c s n xu t b i T. virens. Ký sinh: Trichoderma có thể nh n ra v t chủ của nó nh có tính h ớng hoá ch t, nó ký sinh phân nhánh h ớng v nh ng n m đã đ c đ nh tr ớc (do nh ng n m này ti t ra các hóa ch t). Ngoài ra, v t kí sinh và v t đối kháng đ c Trichoderma nh n d ng bằng phân t , sự nh n d ng này có thể do tự nhiên hay hóa học (qua trung gian là lectin trên b mặt t bào của m m b nh và v t đối kháng). Đ ng th i, Trichoderma kí sinh vào và cuộn quanh s i n m v t chủ thông qua hình thành các d ng móc hay d ng giác bám, ti t enzyme chitinase, β – glucanase, protease nh ng enzyme này có kh năng bào mòn thành t bào hay ti t ra nh ng lo i kháng sinh gây thủng s i n m v t chủ, đây là kh năng t n công trực ti p của Trichoderma. Không nh ng th , Trichoderma còn có kh năng ti t các enzyme phân gi i nh chitinase, glucanase, protease giúp bào mòn thành t bào sau khi kí sinh và cuộn quanh n m gây b nh đối kháng với nó. Khi kí sinh vào cây T. asperellum ti t cellulase, cho phép nó t n công nh ng n m nh Phytophthora 5 spp. và Pythium spp. khi chúng bám vào cây tr ng. C nh tranh: Trichoderma c nh tranh khai thác với n m gây b nh cây tr ng, làm suy ki t chúng bằng cách hút h t d ỡng ch t một cách th động và dai dẳng bằng nh ng bào t chống ch u (chlamydospores). Ngoài ra, Trichoderma còn c nh tranh mô già hoặc ch t với n m Botrysis spp. và Sclerotina spp. gây b nh cho cây (xâm nh p vào nh ng mô già hoặc mô ch t, s d ng chúng làm n n t ng để từ đó xâm nh p vào nh ng mô khoẻ). N m Trichoderma s d ng nh ng mô già và mô ch t của cây chủ, bằng cách đó n m Trichoderma c nh tranh và tri t tiêu đ ng xâm nhi m của n m Botrysis spp. và Sclerotina spp.. Không nh ng th , Trichoderma còn c nh tranh d ch ti t của cây với n m Phytium spp. do d ch ti t của cây kích thích sự n y m m, mọc thành khuẩn ty của nh ng túi bào t Phytium spp. (gây b nh cho cây) và lây nhi m vào cây. Trichoderma làm gi m sự n y m m của n m Phytium spp. bằng cách s d ng d ch ti t đó vì th mà các bào t Phytium spp. không thể n y m m. Trichoderma còn đối kháng với các n m gây b nh bằng cách chi m gi vùng xâm nhi m của m m b nh vào nh ng v trí b th ng, do đó ngăn c n sự xâm nhi m của m m b nh. Ngoài ra, Trichoderma còn có kh năng c i t o đ t tr ng, làm tăng độ phì nhiêu cho đ t vì th làm tăng năng su t cây tr ng nh kh năng phân gi i phospho khó tan có r t nhi u trong đ t mà cây không h p th đ c và kh năng ti t các enzyme phân hủy ch t h u c nh cellulase, glucanase thành các d ng d h p thu. Bên c nh đó, Trichoderma cũng tác động trực ti p lên vùng r nh lo i bỏ m m b nh, làm tăng sự sinh tr ng và phát triển của r hoặc từ nh ng điểm mà Trichoderma tác động đ n s kích thích cây tr ng tăng s n xu t các enzyme b o v và các h p ch t kháng sinh nh đó giúp cây đ kháng tốt với m m b nh. 2.2. C u t o t bào Trichoderma N m mốc nói chung (trong đó có Trichoderma) có thành t bào c u t o chủ y u là chitin (là polymer của n – acetylglucosamine) và chitosan (chitin b deacetyl hóa) và các thành ph n khác g m β – glucan, α – glucan, mannoprotein (Siu-Wai Chiu và David Moore, 2001), ch t màu, lipid (8 – 33%) (Lâm Thanh Hi n, 1999) . Màng 6 t bào d y kho ng 7 µm thành ph n chủ y u là lipid (40%) và protein (38%). Nhân phân hóa, th ng hình tròn, đôi khi kéo dài, đ ng kính kho ng 2 – 3 µm. Ty thể hình elip, luôn di động để tham gia vào quá trình hô h p của t bào (Lâm Thanh Hi n, 1999). Nh ng hiểu bi t c b n v c u t o t bào Trichoderma chính là c s để chúng tôi lựa chọn và c i ti n các ph ng pháp ly trích DNA t ng số cho phù h p với nghiên cứu của đ tài. 2.3. Các ph ng pháp đ nh danh tên loài của Trichoderma Đên th p niên 1990, vi c đ nh danh và phân nhóm Trichoderma ch dựa vào đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý (đánh giá các isoenzyme). Năm 1969, Rifai đ a ra các đặc điểm hình thái của t t c các loài Trichoderma. Sau đó, Bisett (1984, 1991a, 1991b, 1991c, 1992, 1998 (Gams và Bissett)) b sung các đặc điểm hình thái của Hypocrea và Gliocladium, là teleomorphs của Trichoderma. Ph ng pháp đ nh danh ch dựa vào hình thái không hoàn toàn chính xác do một vài loài Trichoderma có đặc điểm hình thái r t giống nhau, ch khác nhau một vài đặc điểm r t khó nh n th y và xác đ nh nh T. asperellum T. viride Chlamydospore nhìn th y rõ trên đám bào t non Bào t mặt sau đĩa petri. Chlamydospore ít th y hoặc th y không rõ ràng. (conidia) có d ng hình c u Bào t có hình tròn hoặc bán c u. hoặc hình oval. Không có mùi dừa Có mùi dừa T. longibrachiatum Trên môi tr tăng tr T. sinensis ng PGA khuẩn l c v n ng m nh 40 0C. Không phát triển tr Cành bào t mọc vuông góc. 40 0C trên môi ng PGA. Cành bào t mọc không vuông góc (nhỏ h n 900). T. atroviride T. koningii Không có pustule (c m bào t ). Có pustule. 7