Tài liệu Khaỏ sát hoạt ddính chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn và độc tính tế bào của polyphenol có trong dịch chiết rau sam

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA, KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN VÀ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA POLYPHENOL CÓ TRONG DỊCH CHIẾT CÂY RAU SAM (Portulaca oleracea) Ngành : Công nghệ sinh học SV : Trần Nguyễn Hương Trang Lớp : 10060301 GVHD : TS.Trần Thị Dung Thành phố Hồ Chí Minh tháng 09 năm 2014 MỤC LỤC CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU.....................................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề.................................................................................................................1 1.2 Mục đích và phạm vi đề tài......................................................................................1 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................2 2.1 Giới thiệu về cây rau sam.........................................................................................2 2.1.1 Vị trí phân loại...................................................................................................2 2.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố..................................................................................2 2.1.3 Đặc điểm hình thái.............................................................................................2 2.1.4 Thành phần hóa học...........................................................................................2 2.1.5 Công dụng..........................................................................................................2 2.1.6 Dược tính...........................................................................................................2 2.2 Quá trình oxy hóa trong cơ thể và chất chống oxy hóa...........................................2 2.2.1 Quá trình oxy hóa trong cơ thể sống.................................................................2 2.2.2 Gốc tự do và quá trình chống oxy hóa trong cơ thể sống.................................2 2.3 Chất chống oxy hóa..................................................................................................2 2.3.1 Khái quát về chất chống oxy hóa......................................................................2 2.3.2 Một số chất chống oxy hóa phổ biến................................................................2 2.3.3 Một số thực vật có tác dụng chống oxy hóa.....................................................2 2.4 Phương pháp trích ly polyphenol.............................................................................2 2.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trích ly polyphenol.................................................2 2.4.2 Các phương pháp trích ly polyphenol và sản xuất cao chiết thô......................2 2.5 Giới thiệu nấm, vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu...............................................2 2.5.1 Phân loại và đặc điểm sinh học của nấm Aspergillus niger (A.niger)..............2 2.5.2 Phân loại khoa học và đặc điểm sinh học vi khuẩn Escherichia coli (E.coli). 2 2.5.3 Phân loại khoa học và đặc điểm sinh học vi khuẩn Staphylococus Aureus (S.Aureus)......................................................................................................................2 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP....................................................................3 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm............................................................3 3.1.1 Địa điểm.............................................................................................................3 3.1.2 Thời gian............................................................................................................3 3.2 Nội dung nghiên cứu................................................................................................3 3.3 Vật liệu thí nghiệm...................................................................................................3 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu........................................................................................3 3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm...................................................................................3 3.3.3 Hóa chất và môi trường thí nghiệm..................................................................3 3.4 Phương pháp thí nghiệm..........................................................................................3 3.4.1 Bố trí thí nghiệm................................................................................................3 3.4.1 Định tính thành phần bột cây rau sam khô.......................................................3 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của cây rau sam.....................................................................4 3.4.3 Khảo sát hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của cao chiết polyphenol từ cây rau sam...........................................................................................................................8 3.4.4 Khảo sát độc tính tế bào cây rau sam trên ấu trùng tôm Atermia salina........10 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................11 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................11 PHỤ LỤC.............................................................................................................................11 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................................11 1 CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 1.2 Đặt vấn đề Dược thảo là nguồn nguyên liệu quý giá thiên nhiên đã ban tặng cho con người. Ngày nay đã có rất nhiều nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp trong thực vật có các hoạt tính có ích như chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn, có khả năng điều trị các bệnh ở người. Đóng góp vào kho nguyên liệu dược thảo đa dạng ấy, cây rau sam (Portulaca oleracea) cũng là loài cây có nhiều dược tính, được sử dụng nhiều trong đời sống. Ngoài ra P. oleracea còn có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, ngăn chặn sự nhiễm độc gan, chống lại các tế bào ung thư… Trong đời sống hằng ngày, cây cây rau sam cũng luôn mang lại nhiều công dụng rất hữu ích Trong đề tài này, tôi thực hiện trích ly và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn và khảo sát độc tố của polyphenol có trong dịch chiết cây rau sam. Mục đích và phạm vi đề tài - Trích ly các hợp chất polyphenol từ cây rau sam. - Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình trích ly hợp chất polyphenol từ cây rau sam - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết cây rau sam. - Khảo sát hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của dịch chiết cây rau sam. - Khảo sát độc tính tế bào dịch chiết lá cây rau sam. CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây rau sam 2.1.1 Vị trí phân loại 2.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố 2 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.1.4 Thành phần hóa học 2.1.5 Công dụng 2.1.6 Dược tính 2.2 Quá trình oxy hóa trong cơ thể và chất chống oxy hóa 2.2.1 Quá trình oxy hóa trong cơ thể sống 2.2.2 Gốc tự do và quá trình chống oxy hóa trong cơ thể sống 2.3 Chất chống oxy hóa 2.3.1 Khái quát về chất chống oxy hóa 2.3.2 Một số chất chống oxy hóa phổ biến 2.3.3 Một số thực vật có tác dụng chống oxy hóa 2.4 Phương pháp trích ly polyphenol 2.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trích ly polyphenol 2.4.2 Các phương pháp trích ly polyphenol và sản xuất cao chiết thô. 2.5 Giới thiệu nấm, vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu 2.5.1 Phân loại và đặc điểm sinh học của nấm Aspergillus niger (A.niger) 2.5.1.1 Phân loại khoa học 2.5.1.2 Đặc điểm sinh học 2.5.2 Phân loại khoa học và đặc điểm sinh học vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) 2.5.2.1 Phân loại khoa học 2.5.2.2 Đặc điểm sinh học 2.5.3 Phân loại khoa học và đặc điểm sinh học vi khuẩn Staphylococus Aureus (S.Aureus). 2.5.3.1 Phân loại khoa học 2.5.3.2 Đặc điểm sinh học CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 3.1.1 Địa điểm Phòng Công Nghệ Sinh Học – Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học – Khoa Khoa Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Tôn Đức Thắng TP Hồ Chí Minh. 3.1.2 Thời gian Đề tài được thực hiện từ tháng /201 đến tháng /201 3.2 Nội dung nghiên cứu - Khảo sát thành phần hóa học của cây rau sam - Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của cây rau sam - Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa và kháng nấm, kháng khuẩn của dịch chiết polyphenol từ cây rau sam. 3 - Thử nghiệm độc tính tế bào dịch chiết cây rau sam trên ấu trùng tôm 3.3 Vật liệu thí nghiệm 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu Lá và thân cây rau sam (Portulaca oleracea). 3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm 3.3.3 Hóa chất và môi trường thí nghiệm 3.4 Phương pháp thí nghiệm 3.4.1 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Định tính thành phần bột cây rau sam khô  Thí nghiệm 1: Khảo sát sự hiện diện các thành phần hợp chất hữu cơ trong bột cây rau sam khô bằng phương pháp hóa học. Mục đích: Định tính một số loại hợp chất hữu cớ có trong bột cây rau sam khô như: flavonoid, tannin, saponin, alkaloid, steroid và terpenoid, glycoside. Phương pháp thực hiện: 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của cây rau sam 3.4.2.1 Xác định thành phần khối lượng của cây rau sam 3.4.2.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu - Nguyên tắc: Mẫu được cân rồi sấy ở 105oC, nước sẽ bốc hơi, làm giảm khối lượng. Cân rồi suy ra độ ẩm - Tiến hành: Sấy trong chén sứ đến khối lượng không đổi, Cân chính xác 10g mẫu sấy ở 105oC trong 2h, sau đó lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 15 phút. Sau đó cân thu khối lượng còn lại và tính độ ẩm theo công thức: Độ ẩm = (10-a) x 100 3.4.2.3 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số của cây rau sam và các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tách chiết  Xác định hàm lượng PP tổng số ở cây rau sam  Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng PP tổng số và hoạt tính chống oxy hóa. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Nghiệm thức 1: Dung môi ethanol 96% Nghiệm thức 2: Dung môi methanol 50%. Nghiệm thức 3: Dung môi aceton 50%. Nghiệm thức 4: Nước Phương pháp thực hiện: 2g mẫu bột cây rau sam được ngâm trong 200ml dung môi theo các nghiệm thức. Sau 60 phút, đem mẫu lọc qua giấy lọc Whatman. Dịch lọc được ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút. Đun cách thủy sau ly tâm ở nhiệt độ 100oC đến thể tích 10% so với ban đầu. Dịch chiết được pha 4 loãng với nước cất đúng bằng thể tích dung môi chiết ban đầu, ta được dịch chiết thô. Chỉ tiêu: Xác định dung môi thích hợp để trích ly được lượng PP cao nhất Phương pháp theo dõi: Dựa vào việc đo mật độ quang của dịch trích ly.  Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng PP tổng số và hoạt tính chống oxy hóa. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Nghiệm thức 1: 60 phút Nghiệm thức 2: 120 phút Nghiệm thức 3: 180 phút Nghiệm thức 4: 240 phút Phương pháp thực hiện: 2g mẫu bột cây rau sam được ngâm trong 200ml dung môi tối ưu vừa xác định. Sau một khoảng thời gian theo các nghiệm thức, đem mẫu lọc qua giấy lọc Whatman. Dịch lọc được ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút. Đun cách thủy sau ly tâm ở nhiệt độ 100oC đến thể tích 10% so với ban đầu. Dịch chiết được pha loãng với nước cất đúng bằng thể tích dung môi chiết ban đầu, ta được dịch chiết thô. Chỉ tiêu: Xác định thời gian chiết tốt nhất cho ra hàm lượng PP cao nhất Phương pháp theo dõi: Dựa vào việc đo mật độ quang của dịch trích ly.  Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng PP tổng số và hoạt tính chống oxy hóa Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Nghiệm thức 1: Nhiệt độ 20oC. Nghiệm thức 2: Nhiệt độ 30oC. Nghiệm thức 3: Nhiệt độ 40oC. Nghiệm thức 4: Nhiệt độ 50oC. Phương pháp thực hiện: 2g mẫu bột cây rau sam được ngâm trong 200ml dung môi và thời gian tối ưu vừa xác định. Đem mẫu lọc qua giấy lọc Whatman. Dịch lọc được ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút. Đun cách thủy sau ly tâm ở nhiệt độ 100oC đến thể tích 10% so với ban đầu. Dịch chiết được pha loãng với nước cất đúng bằng thể tích dung môi chiết ban đầu, ta được dịch chiết thô. Chỉ tiêu: Xác định nhiệt độ chiết tốt nhất cho ra hàm lượng PP cao nhất Phương pháp theo dõi: Dựa vào việc đo mật độ quang của dịch trích ly.  Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết đến hàm lượng PP tổng số và hoạt tính chống oxy hóa Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Nghiệm thức 1: Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/5. Nghiệm thức 2: Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10. Nghiệm thức 3: Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 5 Nghiệm thức 4: Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/30 Phương pháp thực hiện: 2g mẫu bột cây rau sam được ngâm trong tỉ lệ nguyên liệu/dung môi theo các nghiệm thức với loại dung môi, thời gian tối ưu và nhiệt độ vừa xác định. Đem mẫu lọc qua giấy lọc Whatman. Dịch lọc được ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút. Đun cách thủy sau ly tâm ở nhiệt độ 100oC đến thể tích 10% so với ban đầu. Dịch chiết được pha loãng với nước cất đúng bằng thể tích dung môi chiết ban đầu, ta được dịch chiết thô. Chỉ tiêu: Xác định tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết tốt nhất cho ra hàm lượng PP cao nhất Phương pháp theo dõi: Dựa vào việc đo mật độ quang của dịch trích ly. 3.4.2.4 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết ở điều kiện tối ưu.  Thí nghiệm 6: Xác định hoạt tính chống oxy hóa – khả năng quét gốc tự do 2,2 – diphenyl – 1- picrylhydrazyl (DPPH). Phương pháp tiến hành: Lấy 50 l mẫu trộn với 1.95 ml thuốc thử DPPH. Lắc mạnh hỗ hợp rồi để yên trong tối ở nhiệt độ phòng. Phương pháp theo dõi: Sau 45 phút đo độ hấp thu ở bước sóng 515 nm. Kết quả được báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dịch chiết khử được 50% gốc tự do DPPH ở điều kiện. Chỉ tiêu: Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao. Mẫu đối chứng: làm tương tự mẫu thí nghiệm, thay mẫu bằng nước cất. Hoạt tính chống oxy hóa, đo bằng % quét gốc tự do DPPH được tính theo công thức sau [4], [24]: % quét DPPH = Trong đó: A 0− A x A0 . 100% A0 : độ hấp thụ của mẫu đối chứng Ax : độ hấp thụ của mẫu thí nghiệm  Thí nghiệm 7: Xác định tổng năng lực khử Nghiệm thức 1: 0.05 ml. Nghiệm thức 2: 0.15 ml. Nghiệm thức 3: 0.1 ml. Nghiệm thức 4: 0.2 ml. Phương pháp tiến hành: Cho vào 4 ống nghiệm, mỗi ống với các thể tích khác nhau dịch chiết cây rau sam và đệm pH 6.6 để đạt thể tích 1.5 ml trước khi thêm 0.5 ml K3[Fe(CN)6] 1%. Lắc đều và hỗn hợp được ủ 50oC trong 20 phút. Sau đó thêm 0.5 ml TCA 10% và 2 ml nước cất, cuối cùng, 0.4 ml AlCl3 0.1% được thêm vào. Lắc đều. 6 Mẫu đối chứng: Cho vào ống nghiệm 0.5 ml K3[Fe(CN)6] 1%, 0.2 ml nước cất, 0.8 ml dung dịch đệm phosphate 6.6. Lắc đều rồi ủ ấm ở 50oC trong 20 phút. Lấy ra, cho 0.5 ml TCA 10%, 2 ml nước cất và 0.4 ml AlCL3 0.1%. Lắc đều. Phương pháp theo dõi: Sau 45 phút, đem mẫu đi đo ở bước song 700nm. Chỉ tiêu: Độ hấp thụ càng cao thì tổng năng lực khử càng mạnh. Kết quả tính toán qua giá trị IC50.  Thí nghiệm 8: Xác định khả năng hạn chế sự oxy hóa chất béo trên mô hình -carotene – linoleic Phương pháp tiến hành: -carotene được hòa tan trong 10 ml CHCl3. Loại bỏ phần dung dịch nổi. Thêm vào 40 mg acid linoleic và 400 mg Tween 40. Cho bốc hơi Chloroform ở nhiệt độ 40oC trong 5 phút. Rửa cặn bằng nước cất trong 30 phút. Thêm từ từ 50 ml nước cất vào, lắc đều tạo ra hệ nhũ tương, đem ủ ở 50 oC trong 120 phút. Phương pháp theo dõi: Đo quang phổ ở 470 nm mỗi 15 phút trong vòng 1h.  Thí nghiệm 9: Xác định khả năng hạn chế sự hình thành hydroperoxide (HPO) trong mô hình dầu – nước Phương pháp tiến hành: 2ml dịch chiết được trộn đều với 10 ml hệ nhũ tương dầu – nước chứa trong ống nhựa 50 ml có nắp đậy, đặt trong tủ ổn nhiệt ở 50oC. Phương pháp theo dõi: Hàm lượng HPO được xác định theo phương pháp của Mark và Herbert (2002). 3.4.3 Khảo sát hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của cao chiết polyphenol từ cây rau sam. 3.4.3.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Escheria coli và Staphilocuccus aureus của cao chiết cây rau sam.  Thí nghiệm 10: Khảo sát hoạt tính khuẩn cao chiết PP cây rau sam đối với Escheria coli và Staphilocuccus aureus Phương pháp tiến hành: Môi trường: Môi trường cao thịt - pepton sau khử trùng, cho vào đĩa petri có đáy phằng, đặt trên bề mặt phẳng để có bề dày đồng nhất (khoảng 4mm), để nguội ở nhiệt độ phòng. Dịch chuẩn: Lấy một ít khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 10 ml muối sinh lý đã hấp khử trùng, lắc đều, đem so độ đục với ống Mc.Farland ( có độ đục tương đương 108 CFU/ml) Trải vi khuẩn lên mặt thạch: Dùng que cấy tam giác trang đều huyền phù dịch vi khuẩn lên đĩa petri, đợi mặt thạch khô. Cao PP: Cân 0.363g cao PP cho vào 4 ml nước cất được dung dịch PP gốc có nồng độ 80 mg/ml. Sau đó lọc vô trùng. 7 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn: Dùng kẹp gắp giấy lọc hình tròn đường kính 5mm (được gọi là đĩa kháng sinh) đã hấp khử trùng đặt lên bề mặt đĩa petri đã trải khuẩn, cách thành đĩa petri 1cm. Nhỏ trực tiếp 30 l dịch chiết lên đĩa kháng sinh. Đem ủ các đĩa petri ở 28 – 30oC, sau 24h tiến hành thu nhận kết quả. Phương pháp theo dõi: Theo dõi đường kính vòng kháng sinh (Ampicillin hoặc Amoxcillin) sau 1 ngày ủ.  Thí nghiệm 11: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MCI) của cao PP Nghiệm thức 1: Nồng độ 40 mg/ml. Nghiệm thức 2: Nồng độ 20 mg/ml. Nghiệm thức 3: Nồng độ 10 mg/ml. Nghiệm thức 4: Nồng độ 5 mg/ml. Nghiệm thức 5: Nồng độ 2.5mg/ml. Nghiệm thức 6: Nồng độ 1.25 mg/ml. Nghiệm thức 7: Nồng độ 0.65 mg/ml. Phương pháp tiến hành: Pha dung dịch gốc có nồng độ 80 mg/ml. Pha loãng dung dịch gốc thành các nồng độ theo các nghiệm thức. Thực hiện tương tự thí nghiệm 10. Phương pháp theo dõi: Theo dõi đường kính vòng kháng sinh sau 1 ngày. 3.4.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng nấm Aspergiluss niger của cao chiết PP từ cây rau sam  Thí nghiệm 12: Khảo sát hoạt tính kháng nấm Aspergiluss niger của cao chiết PP từ cây rau sam Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Nghiệm thức 1: Dung môi ethanol 70% (đối chứng) Nghiệm thức 2: Dịch cao PP 10 mg/ml Nghiệm thức 3: Dịch cao PP 20 mg/ml Nghiệm thức 4: Dịch cao PP 30 mg/ml Nghiệm thức 5: Dịch cao PP 40 mg/ml Nghiệm thức 6: Dịch cao PP 50 mg/ml Phương pháp thực hiện: Cấy tơ nấm ở giữa đĩa thạch môi trường (PGA), để ở nhiệt độ phòng cho tơ nấm lan tỏa. Phương pháp theo dõi: Theo dõi đường kính tơ nấm lan tỏa sau 2 -3 ngày cấy. 3.4.4 Khảo sát độc tính tế bào cây rau sam trên ấu trùng tôm Atermia salina  Thí nghiệm 13: Khảo sát độc tính tế bào cây rau sam trên ấu trùng tôm (Atermia salina) Nghiệm thức 1: 10 g/ml Nghiệm thức 2: 100 g/ml Nghiệm thức 3: 1000 g/ml 8 Phương pháp thực hiện: chuẩn bị môi trường nước biển nhân tạo nuôi cấy ấu trùng tôm. Ấu trùng được sử dụng sau 2 - 3 ngày nở. Thêm vào 10 ml nước biển có chứa ấu trùng tôm vào 3 lọ khác nhau. Bổ sung dung môi theo các nghiệm thức vào 3 lọ. Ủ ở 37 oC trong 24h. Phương pháp theo dõi: Dùng kính lúp quan sát sự sống sót của các ấu trùng tôm ở mỗi lọ CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ PHỤ LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 9