Tài liệu đánh giá tính khả dụng của vắc xin bạch hầu đông khô rd6 dự tuyển mẫu chuẩn quốc gia

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- ĐỖ KHÁNH LINH ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA VẮC XIN BẠCH HẦU ĐÔNG KHÔ RD6 DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- ĐỖ KHÁNH LINH ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA VẮC XIN BẠCH HẦU ĐÔNG KHÔ RD6 DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHẠM VĂN HÙNG TS. TRẦN THỊ THANH HUYỀN Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của rất nhiều người. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Văn Hùng, Phó Viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, TS. Trần Thị Thanh Huyền, Bộ môn Vi sinh vật học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQG Hà Nội, những người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ trong bộ môn Vi sinh vật học và khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội đã có nhiều chỉ dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tài trợ kinh phí để tôi có thể thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Trần Văn Bé, Viện trưởng Viện vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tạo điều kiện vềphòng thí nghiệm và cung cấp lượng lớn động vật thí nghiệm giúp tôi hoàn thành luận văn này. Để hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các bạn đồng nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Lan Phương, CN.Nguyễn Lan Anh, các anh chị đồng nghiệp của phòng QC,Viện vắc xin và Sinh phẩm Y tếvà Ths. Lê Thị Hoàng Yến, CN. Nguyễn Phương Liên cùng các anh chị đồng nghiệp trong Khoa Vi khuẩn – Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Học Viên Đỗ Khánh Linh MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................3 1.1.VI KHUẨN BẠCH HẦU VÀ BỆNH BẠCH HẦU .........................................3 1.1.1 Những nét chung về vi khuẩn bạch hầu ......................................................3 1.1.2Độc tố bạch hầu ............................................................................................4 1.1.3 Bệnh sinh .....................................................................................................4 1.1.4 Dịch tễ học...................................................................................................5 1.2VẮC XIN BẠCH HẦU ......................................................................................7 1.3MẪU CHUẨN ....................................................................................................9 1.3.1Về thuật ngữ .................................................................................................9 1.3.2 Về phƣơng pháp điều chế .............................................................................9 1.3.3Tiêu chuẩn chất lƣợng ................................................................................11 1.3.4Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn quốc tế .........................................................13 1.3.5Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia ......................................................14 1.4YÊU CẦU ĐỐI VỚI VIỆC CHUẨN ĐỊNH MẪU CHUẨN QUỐC GIA ......16 1.5 ĐỘNG VẬT DÙNG TRONG KIỂM ĐỊNH VẮC XIN BẠCH HẦU ................17 1.6PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU BẠCH HẦU .............................19 1.6.1Phƣơng pháp thử thách trên chuột lang ......................................................20 1.6.2 Phƣơng pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt ..........................................21 1.7ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN ..............................................23 1.7.1Đánh giá độ ổn định dài hạn (Long- term Stability Studies) .....................23 1.7.2Đánh giá độ ổn định cấp tốc (Accelerated Stability Testing) ....................23 1.7.2.1 Điều kiện tiến hành phƣơng pháp cấp tốc ............................................23 1.7.3 Dự đoán tuổi thọ sản phẩm theo nguyên lý Vant-Hoff [1, 16]......................23 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG,VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...25 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .....................................................................25 2.2.Vật liệu nghiên cứu – trang thiết bị sinh phẩm và vật tƣ tiêu hao ...................25 2.2.1.Động vật thí nghiệm ..................................................................................25 2.2.2.Sinh phẩm –hóa chất .................................................................................25 2.2.3.Vật tƣ trang thiết bị ...................................................................................25 2.3.THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU .............................................................................26 2.4.THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................................26 2.5.CỠ MẪU NGHIÊN CỨU ...............................................................................26 2.6.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................26 2.6.1 Đánh giá cảm quan ....................................................................................27 2.6.2Đánh giá vô trùng .......................................................................................27 2.6.3Đánh giá đô ̣ ẩ m tồ n dƣ ...............................................................................27 2.6.4Đánh giá đô ̣ chân không .............................................................................28 2.6.5Đánh giá nhận dạng ....................................................................................28 2.6.6 Đánh giá tính đồng nhất về khối lƣợng .....................................................30 2.6.7Đánh giá công hiệu và tính đồ ng nhấ t về công hiệu ..................................30 2.6.8Dƣ̣ đoán ha ̣n dùng của vắ c xin mẫu chuẩ n .................................................32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................34 3.1. ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ TIÊU SAU XUẤT XƢỞNG.....................................34 3.1.1. Đánh giá cảm quan ...................................................................................34 3.1.2. Đánh giá chỉ tiêu vô trùng ........................................................................35 3.1.3. Đánh giá độ chân không ...........................................................................36 3.1.4. Đánh giá độ ẩm tồn dƣ .............................................................................36 3.1.5. Đánh giá nhận dạng ..................................................................................38 3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỒNG NHẤT .................................................................39 3.2.1. Đánh giá tính đồng nhất về trọng lƣợng khô............................................39 3.2.2. Đánh giá tính đồng nhất về công hiệu ......................................................40 3.3DỰ ĐOÁN TUỔI THỌ CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN ...............................43 KẾT LUẬN ..............................................................................................................46 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................47 Tài Liệu Tham Khảo ...............................................................................................48 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Hình ảnh vi khuẩn bạch hầu 3 1.2 Cấu trúc độc tố bạch hầu 4 1.3 Màng giả ở hầu họng do độc tố bạch hầu 5 1.4 Nhãn của vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ tƣ. 11 2.1 Sơ đồ nhỏ mẫu của phƣơng pháp nhận dạng bạch hầu. 29 3.1 Sự nguyên vẹn của ống mẫu RD6 34 3.2 3.3 Đồ thị biểu diễn độ chụm của các kết quả độ ẩm tồn dƣ của mẫu RD6 Kết quả nhận dạng thành phần bạch hầu trong mẫu RD6 37 38 Biểu đồ biểu thị trọng lƣợng khô của mẫu RD6 thực hiện tại NICVB 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 và IVAC. Đồ thị biểu diễn độ chụm của các kết quả trọng lƣợng khô của mẫu RD6 Biểu đồ biểu thị kết quả công hiệu của RD6 thực hiện bởi NICVB và IVAC Đồ thị biểu diễn độ chụm của các kết quả công hiệu của mẫu RD6 Đồ thị biểu diễn Sự phụ thuộc công hiệu bạch hầu của RD6 bảo quản ở nhiệt độ 500C theo các tháng. 39 40 41 42 44 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên Bảng Trang 2.1 Công thức pha loãng vắc xin 31 2.2 Công thức pha các mẫu RD6 pha loãng 34 3.1 Kết quả kiểm tra cảm quan mẫu chuẩn RD6 tại NICVB và IVAC 35 3.2 Kết quả kiểm tra vô trùng tại NICVB và IVAC 36 3.3 Kết quả kiểm tra chân không của mẫu chuẩn RD6 36 3.4 Kết quả độ ẩm tồn dư thực hiện tại NICVB và tại IVAC 37 3.5 Kết quả công hiệu RD6 (trên chuột lang) tại các thời điểm ủ mẫu ở nhiệt độ 500C/ độ ẩm 75% 43 ́ ́ DANH MỤC CHƢ̃ VIÊT TĂT STT Chƣ̃ viế t tắ t Chú giải 1. ATCC American Type Culture Collection (Ngân hàng chủng chuẩn Hoa Kỳ) 2. ĐTBH Độc tố bạch hầu 3. DTP Diphtheria- Tetanus- Pertussis (Bạch hầu –Uốn ván – Ho gà ) 4. ED50 Effective dose (Liều bảo vệ 50% động vật thí nghiệm). 5. IU International Unit (Đơn vị quốc tế) 6. KĐTBH Kháng độc tố bạch hầu 7. LD50 Lethal dose 50 (Liều gây chết 50 % động vật thí nghiệm sau 96 giờ) 8. Lf Limes flocculation: Đơn vị lên bông quốc tế 9. MCQG Mẫu chuẩn quốc gia 10. MCQT Mẫu chuẩn quốc tế 11. NIBSC National Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc gia về Sinh phẩm chuẩn và chuẩn sinh học) 12. NICVB National Instistute for Control of Vaccines and Biologicals. (Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế) 13. NMSL Nƣớc muối sinh lý 14. SSI Staten Serum institiute (Viện huyết thanh quốc gia Đan Mạch) 15. IVAC Institute of vaccine and biological (Viện vắc xin và chế phẩm sinh học) MỞ ĐẦU Bạch hầu là một bệnh nhiễm khuẩn , nhiễm đô ̣c do vi khuẩ n Gram (+) Corynebacterium diphtheriae gây ra. Bê ̣nh ba ̣ch hầ u đã gây ra nhiề u vu ̣ dich lớn và ̣ nguy hiể m ở nhiề u quố c gia trên thế giới . Và hiện nay sử dụng vắc xin là biện pháp quan tro ̣ng nh ất để phòng bệnh bạch hầu . Chấ t lƣơ ̣ng vắ c xin ba ̣ch hầ u đƣ ợc đánh giá qua các tiêu chí: an toàn và hiệu quả. Thƣ̉ nghiê ̣m kiể m tra công hiê ̣ u là thƣ̉ nghiê ̣m cầ n thiế t đ ể đánh giá hiệu quả của vắc xin. Thƣ̉ nghiê m này cầ n có mẫu ̣ chuẩ n do công hiê ̣u của vắ c xin mẫu thƣ̉ đƣơ ̣c xác đinh qua so sánh tƣơng quan với ̣ vắ c xin mẫu chuẩ n đã biế t trƣớc giá tri ̣công hiê ̣u. Để thống nhất kết quả kiểm định vắc xin bạch hầu trên toàn thế giới, Tổ chƣ́c y tế thế giới (WHO) đã thiết lập mẫu chuẩ n ba ̣ch hầ u quố c tế , do NIBSC sản xuất và hiện đang sử dụng mẫ u chuẩ n lầ n th ứ tƣ với hàm lƣợng 213 IU/ống. Do số lƣợng mẫu chuẩn Quốc tế có hạn nên WHO khuyến cáo các quốc gia nên có mẫu chuẩn tại địa phƣơng cho kiểm định từng lô vắc xin ngoài vắc xin DTP sản xuất trong nƣớc nhiề u nƣớc để phu ̣c vu ̣ nhu cầ u [40]. Ở Việt Nam , , chúng ta còn nhập vắc xin DTP của phòng bệnh của nhân dân , do đó viê ̣c kiể m tra công hiê ̣u thành phầ n ba ̣ch hầ u có tầ n suấ t khá lớn . Nhà sản xuất cần vắ c xin mẫu chuẩ n quố c gia đ ể kiểm định công hiệu của vắc xin trong quá trình sản xuất, còn Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế cần mẫu chuẩn Quốc gia để kiểm định các vắc xin xuấ t xƣởng và đăng ký . Hiê ̣n nay , chúng ta chƣa có vắ c xin m ẫu chuẩn quốc gia bạch h ầu, thêm vào đó mẫu chuẩn Quốc tế chỉ có đơn vị trên chuột lang. Vì vậy, mẫu chuẩn Quốc gia đƣợc thiết lập và nối chuẩn với MCQT theo đơn vị miễn dịch trên chuột lang. Phƣơng pháp này có chi phí rất tốn kém và khả năng có đƣợc lƣợng chuột lang lớn để làm thƣờng quy là không khả thi với nhiều phòng thí nghiệm. Do vậy, việc chuyển đổi sang phƣơng pháp dùng chuột nhắt và sử dụng đơn vị trên chuột nhắt là rất cần thiết. Việc chuyển đổi này đƣợc thực hiện ở từng Quốc gia. Song chƣa có bất cứ phòng thí nghiệm nào công bố. Tƣ̀ nhƣ̃ng lý do đó Viê ̣n kiể m đinh Quố c gia Vắ c ̣ 1 xin và Sinh phẩ m y tế đã phố i hơ ̣p với Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) sản xuất vắc xin ba ̣ch hầ u d ự tuyển mẫu chuẩ n Quố c gia và ti ến hành: “Xác định tính khả dụng của Vắc xin bạch hầu đông khô RD6 dự tuyểnmẫu chuẩn Quốc gia” với mục tiêu sau: Xây dựng một quy trình chuẩn định chất lượng Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia Bạch hầu đông khô để làm thước đo đánh giá, kiểm định các vắc xin xuất xưởng phục vụ cho sức khỏe cộng đồng. Mục tiêu cụ thể: 1. Đánh giácác chỉ tiêu sau xuất xƣởng 2. Xác định giá trị công hiệu bạch hầu trên chuột lang của Vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển. 3. Dự đoán tuổi thọ của vắc xin mẫu chuẩn. 4. Đánh giá tính đồng nhất của vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. VI KHUẨN BẠCH HẦU VÀ BỆNH BẠCH HẦU 1.1.1 Những nét chung về vi khuẩn bạch hầu Vi khuẩn Bạch hầu ( tên La tinh: Corynebacterium diphtheriae) hay còn có tên “vi khuẩn Klebs-Loefler”, thuộc chi Corynebacterium, là những trực khuẩn Gram (+), hình chùy, thƣờng đứng thành đám nhƣ chữ nho. Loại trực khuẩn này thƣờng gặp trong tự nhiên. Chúng là những trực khuẩn thẳng hoặc hơi cong, có thể chứa các hạt nhiễm sắc. Hạt nhiễm sắc thƣờng ở hai đầu trực khuẩn làm cho vi khuẩn phình ra nhƣ hình chùy. Loài trực khuẩn này không có vỏ, không có lông và không có nha bào. Vi khuẩn bạch hầu là loài hiếu kỵ khí tùy tiện, chúng chuyển hóa glucose theo cả hai con đƣờng (Embden-MeyenhofParnas và Pentose phospahte). Chúng ƣa môi trƣờng có máu, huyết thanh và pepton, thích hợp với pH trung tính hoặc hơi kiềm, nhiệt độ 370C. Nuôi cấy vi khuẩn bạch hầu cần môi trƣờng chọn lọc có chứa tellurite. Vì vậy trong sản xuất vắc xin ngƣời ta thƣờng dùng môi trƣờng tổng hợp từ acid amin và một số yếu tố khác, khi đó trực khuẩn bạch hầu phát triển tốt và thu đƣợc ngoại độc tố thuận lợi hơn[5]. Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn bạch hầu. Độc tố đƣợc tạo ra chỉ khi trực khuẩn này sản sinh ra loại vi rút đặc hiệu, vi rút mang gen độc, có khả năng giết chính nó. Chỉ những loại mang gen độc mới gây bệnh nghiêm trọng. Vi khuẩn bạch hầu có bốn tuýp sinh học là Gravis, intermedius, mitis và belfanti. Tất cả các chủng này đều có khả năng sản xuất 3 độc tố gây bệnh nghiêm trọng. Và đặc tính để phân biệt với các loài Corynebacterium khác là vi khuẩn bạch hầu thƣờng sống ở vùng họng miệng và da. 1.1.2 Độc tố bạch hầu Năm 1888, Roux và Yersin đã phát hiện: khi lấy dịch lọc trong canh khuẩn vi khuẩn bạch hầu tiêm cho động vật thì gây bệnh giống nhƣ tiêm vi khuẩn bạch hầu. Điều này đã chứng minh Corynebacterium diphtheriae gây ra bệnh bạch hầu, do vi khuẩn này sản sinh ra một ngoại độc tố có độc lực rất cao[2, 5]. Ngoại độc tố bạch hầu là những glycoprotein có trọng lƣợng phân tử khoảng 63.000 dalton, gồm hai tiểu phần A và B. Tiểu phần B, trọng lƣợng phân tử 41.000 dalton, chƣa biết về hoạt tính enzym, nhƣng có nhiệm vụ bám vào màng tế bào cảm thụ giúp tiểu phần A (trọng lƣợng phân tử 22.000 dalton) chui vào tế bào và ngăn cản giải phóng các ARN vận chuyển, sau khi nó đã đƣa các acid amin đến các polyribosom trong việc tổng hợp protein nên sự tổng hợp protein bị ngăn cản và làm tế bào chết. Độc tố bạch hầu chịu đƣợc nhiệt đun sôi trong 5 phút và khá ổn định trong môi trƣờng acid hoặc kiềm mạnh. Các chủng vi khuẩn bạch hầu không độc có thể biến đổi thành chủng độc bằng việc chuyển phage mang gen độc Toxt[2]. Hình 1.2: Cấu trúc độc tố bạch hầu 1.1.3 Bệnh sinh Bạch hầu là một bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm độc do vi khuẩn bạch hầu 4 Corynebacterium diphtheriae gây ra. Trực khuẩn bạch hầu sinh sản tại nơi tổn thƣơng và sản xuất ra ngoại độc tố. Ngoại độc tố thâm nhập vào cơ thể và gây ra tổn thƣơng ở nhiều cơ quan. Màng giả ở họng miệng là dấu hiệu đầu tiên của nhiễm khuẩn bạch hầu có thể thấy ở ngƣời. Biểu hiện chính của bệnh là gây viêm đƣờng hô hấp trên, thƣờng là ở vùng họng nhƣng đôi khi lan truyền đến mũi, thanh quản và khí quản. Nguy hiểm hơn là ngoại độc tố của vi khuẩn có thể lan truyền đến các cơ quan nhƣ cơ tim, hệ thần kinh, thận… khiến ngƣời bệnh có những biến chứng nguy hiểm nhƣ liệt, biến chứng tim và có thể tử vong[5, 20]. Hình 1.3: ( ) Màng giả ở hầu do độc tố bạch hầu 1.1.4 Dịch tễ học Ngƣời ta đã ghi nhận rằng, bệnh bạch hầu lây lan bằng những giọt nƣớc bọt từ bệnh nhân hoặc ngƣời mang trực khuẩn bạch hầu. Nó lây trực tiếp tới những ngƣời cảm nhiễm. Do đó dịch bệnh bạch hầu có thể xảy ra ở nhiều mức độ khác nhau: các trƣờng hợp tái phát, các vụ dịch bé hoặc các vụ dịch lớn có tính chất vùng. Bệnh bạch hầu thƣờng xuất hiện trong những tháng lạnh ở vùng ôn đới. Bệnh có tính mùa, thƣờng tản phát, có thể phát triển thành dịch, nhất là ở trẻ dƣới 15 tuổi chƣa có miễn dịch đầy đủ[14]. Bệnh bạch hầu lƣu hành rộng rãi ở mọi nơi trên thế giới và đã gây nên các vụ dịch nghiêm trọng, nhất là ở trẻ em trong thời kỳ chƣa có vắc xin dự phòng. Năm 1923 vắc xin giải độc tố bạch hầu ra đời và từ đó đến nay tính nghiêm trọng của bệnh dịch đã thay đổi trên toàn thế giới[2]. 5 Bệnh bạch hầu chỉ xảy ra ở những cá thể nhạy cảm (thiếu miễn dịch). Trong vùng dịch bạch hầu lƣu hành, bệnh bạch hầu xuất hiện ở những ngƣời không tiêm vắc xin hoặc có tiêm nhƣng không đầy đủ. Tỷ lệ chết cao của bệnh bạch hầu thƣờng ở vùng kinh tế thấp, phát hiện bệnh chậm và không đƣợc điều trị kịp thời. Sự khó khăn về kinh tế, xã hội là điều kiện tốt cho các bệnh nhiễm trùng trong đó có bệnh bạch hầu. Vậy nên trong chiến tranh bạch hầu là bệnh nhiễm trùng phổ biến nhất[15]. Theo thông báo của nhiều nƣớc, tỷ lệ mắc bạch hầu liên quan chặt chẽ với việc tiêm vắc xin bạch hầu. Ở Anh và Wales, từ năm 1915-1942, số lƣợng bệnh nhân bạch hầu hàng năm là 50.000 và số chết khoảng 4000 ngƣời vào những năm đầu và 2500 ở những năm cuối. Sau đó ngƣời ta thực hiện tiêm chủng toàn dân. Năm 1950, số lƣợng mắc bạch hầu giảm xuống 962 và tử vong khoảng 49 trƣờng hợp; đến năm 1965, số mắc là 25 và không có tử vong. Đại chiến thế giới thứ 2 đã cản trở việc tiêm phòng, dẫn đến khoảng 3 triệu ngƣời bị bệnh bạch hầu ở châu Âu trong thời gian này[5, 25]. Một sự kiện đáng lƣu ý là do những biến động xã hội ở một số nƣớc nhƣ Nga, Ucraina…đã làm gián đoạn việc tiêm chủng vắc xin bạch hầu cho trẻ em trong những năm 80 của thế kỷ trƣớc. Do đó bệnh bạch hầu đã phát triển và bùng nổ thành dịch lớn ở những nƣớc này trong những năm đó. Ví dụ năm 1994, ỏ Nga đã có hơn 39.000 ngƣời mắc bệnh bạch hầu với 1.100 ngƣời chết và ở Ucraina có hơn 3000 ngƣời mắc. Tuổi mắc bệnh là trên 15 tuổi[12, 26]. Ở khu vực Tây Thái Bình Dƣơng, hiện nay số mắc bệnh bạch hầu hàng năm đã giảm rõ rệt do hiệu quả của việc tiêm phòng vắc xin bạch hầu cho trẻ em đƣợc thực hiện có kết quả ở các nƣớc trong khu vực. Những năm đầu thập kỷ 80 của thế kỷ trƣớc, hàng năm ở đây có trên 13.000 trƣờng hợp bạch hầu, đến năm 1990 giảm xuống còn 1130 trƣờng hợp và năm 1994 chỉ còn 614 trƣờng hợp[28]. Ở Việt Nam, thời kỳ chƣa thực hiện tiêm vắc xin bạch hầu trong chƣơng trình tiêm chủng mở rộng thì bệnh bạch hầu thƣờng xảy ra và gây dịch ở hầu hết các tỉnh, đặc biệt là ở các thành phố có mật độ dân cƣ cao. Bệnh xuất hiện nhiều 6 vào các tháng 8, 9, 10 trong năm. Do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ mắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống 0,14/100.000 dân năm 2000 và 0,009/100.000 dân năm 2009. So với tỷ lệ mắc bệnh 0,14/100.000 dân của ho gà, 6,2/100.000 dân của bệnh sởi (năm 2009), có thể thấy hiệu quả phòng bệnh bạch hầu do tiêm vắc xin này khá cao[4]. Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, tất cả các nƣớc nên ƣu tiên tiêm phòng cho trẻ dƣới một tuổi đủ 3 liều vắc xin DTP, đạt ít nhất 90% và tiêm nhắc lại để có miễn dịch lâu dài. Lịch tiêm phòng đƣợc xem xét cụ thể ở từng nƣớc, tùy theo tình hình dịch tễ bệnh. 1.2 VẮC XIN BẠCH HẦU Vắc xin bạch hầu là vắc xin giải độc tố. Loại vắc xin này đƣợc sản xuất từ ngoại độc tố của vi khuẩn đã đƣợc làm mất tính độc nhƣng vẫn giữ đƣợc tính kháng nguyên. Vắc xin giải độc tố kích thích cơ thể sản xuất ra kháng độc tố, loại kháng thể có khả năng trung hòa ngoại độc tố. Vắc xin này nhằm phòng chống các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây bệnh chủ yếu bằng ngoại độc tố. Năm 1923, Ramon nhận thấy độc tố bạch hầu khi xử lý bằng formalin thì sẽ mất độc tính nhƣng vẫn giữ đƣợc tính kháng nguyên, có khả năng tạo kháng thể chống lại bệnh, từ đó vắc xin bạch hầu ra đời. Với những tiến bộ của miễn dịch học và các ngành khoa học khác, việc sản xuất vắc xin bạch hầu đã đƣợc cải tiến qua nhiều giai đoạn và tập trung vào các vấn đề sau: 1. Thay đổi phương pháp sản xuất: Từ thủ công (nuôi cấy tĩnh) sang nuôi cấy theo quy trình công nghệ sinh học (nuôi cấy chìm trong nồi lên men). 2. Thay đổi các phương pháp giải độc: Dùng hóa chất nhƣ ICl3, formalin hoặc các biện pháp chọn chủng giống đột biến để thu thẳng giải độc tố. 3. Cải tiến khâu tinh chế: Cô đặc bằng phƣơng pháp thủ công đến phƣơng pháp hiện đại với hệ thống siêu lọc. Ngày nay hệ thống lọc tách nhƣ Metafilter, TFF đƣợc dùng rộng rãi trong sản xuất các vắc xin vi khuẩn. 7 4. Phối hợp tá dược: Giải độc tố ban đầu dùng gel hấp phụ để tăng và kéo dài hoạt tính miễn dịch. Thƣờng dùng gel của nhôm hydroxyd Al(OH)3 hoặc Al(PO) 4 để hấp phụ. Hoặc dùng các oligonucleotid chứa CpG demetyl hóa đƣa vào vắc xin khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hƣớng dịch thể (tạo kháng thể) thay vì tế bào. 5. Phối hợp kháng nguyên: Phối hợp thành vắc xin đa giá để có hiệu quả kinh tế, tăng hiệu quả từng thành phần trong kháng nguyên và giảm bớt số mũi tiêm chủng hoặc làm giảm bớt số lần tổ chức tiêm chủng. Các vắc xin bạch hầu phối hợp 3 thành phần (Bạch hầu- Ho gà- Uốn ván), 4 thành phần (Bạch hầu- ho gà vô bào- Uốn ván- Bại liệt), 5 thành phần (Bạch hầu- ho gà vô bào- Uốn ván- Bại liệt-Viêm gan B), 6 thành phần (Bạch hầu- ho gà vô bào- Uốn ván- Bại liệt-Viêm gan B- Hib) đã ra đời[2, 36]. Ở Việt Nam, vắc xin bạch hầu đƣợc nghiên cứu sản xuất từ những năm 60 tại Viện Vệ sinh dịch tễ Hà Nội bằng phƣơng pháp nuôi cấy tĩnh, phối hợp với thành phần uốn ván để tạo vắc xin nhị liên DT (Bạch hầu- Uốn ván). Năm 1986, Viện Vắc xin (IVAC) chính thức sản xuất phối hợp DTP tinh chế cô đặc và hấp phụ bằng AlPO4 theo tiêu chuẩn WHO. Vắc xin này đã đƣợc dùng trong chƣơng trình tiêm chủng mở rộng Quốc gia nên tỷ lệ mắc bệnh bạch hầu ở Việt Nam đã giảm từ 1187 trƣờng hợp (năm 1984) xuống còn 188 trƣờng hợp (năm 1991). Hiện nay IVAC vẫn đang tiếp tục sản xuất vắc xin này và đang có dự án với Cuba để sản xuất vắc xin phối hợp 5 thành phần (Bạch hầu- Ho gà - Uốn ván- Bại liệt-Hib)[2, 24]. Ở Việt Nam, vắc xin DTP nằm trong chƣơng trình tiêm chủng mở rộng và tiêm ba mũi cho trẻ em với phác đồ 3, 4, 5 tháng tuổi. Mũi thứ tƣ tiêm nhắc lại sau mũi thứ ba là một năm. Theo khuyế n cáo của tổ chƣ́c y tế thế giới WHO TRS No .980 và Dƣợc điển Viê ̣t Nam IV, vắ c xin ba ̣ch hầ u trƣớc khi sƣ̉ du ̣ng phải đƣơ ̣c kiể m tra các tiêu chuẩ n nhƣ: Cảm quan, nhâ ̣n da ̣ng thành ph ần bạch hầu, công hiê ̣u b ạch hầu, tính chất vật lý, an toàn chung , an toàn đă ̣c hiê ̣u ba ̣ch hầ u , vô khuẩ n và m ột số chỉ tiêu lý hóa khác[4, 28]. 8 1.3 MẪU CHUẨN Đối với mẫu chuẩn WHO có những khuyến cáo sau: 1.3.1 Về thuật ngữ Chuẩn quốc ( IS): Mẫu chuẩn quốc tế (International biological measurement standards, WHO International Standards, IS) là chế phẩm sinh học đƣợc cung cấp để đảm bảo kết quả của các thử nghiệm sinh học hoặc miễn dịch học đƣợc biểu thị theo cùng một cách trên toàn thế giới. Giá trị đƣa ra bởi WHO theo đơn vị quốc tế (IU) hoặc đơn vị phù hợp khác. ISS đƣợc coi là mẫu chuẩn gốc cao nhất (primary) để chuẩn định mẫu chuẩn quốc gia/mẫu chuẩn thứ cấp khác [35]. Chuẩn chính (Reference standards): Là những chất đƣợc sử dụng nhƣ thƣớc đo trong các thử nghiệm. Nó cung cấp một đơn vị cơ sở hằng định cho việc xác định công hiệu hoặc định lƣợng [35]. Chuẩn chính thứ cấp (Secondary reference standards): Là những chất chuẩn chính đƣợc xây dựng bởi một khu vực hoặc một quốc gia hoặc bởi các tổ chức khác. Chuẩn này đƣợc xác định dựa vào việc nối tới chuẩn ban đầu của WHO. Những chất chuẩn này đƣợc sử dụng trong những thử nghiệm kiểm tra công hiệu hoặc định lƣợng thƣờng quy [35]. 1.3.2 Về phƣơng pháp điều chế Trong sản xuất mẫu chuẩn yếu tố quan trọng hàng đầu là tính đồng nhất ổn định và sự tƣơng đồng về thành phần với mẫu để thử nghiệm. Mẫu chuẩn có thành phần càng tƣơng đồng với mẫu thử thì độ chính xác càng cao. Merthiolate là chất thƣờng đƣợc sử dụng làm chất bảo quản vì nó không ảnh hƣởng đến chế phẩm hoặc không bị thăng hoa khi làm khô chế phẩm. Những tá dƣợc khác lựa chọn theo tiêu chí không làm giảm và không ảnh hƣởng đến hoạt tính cũng nhƣ độ ổn định của sản phẩm. Quá trình đông khô: Mẫu chuẩn có thể đƣợc sản xuất dƣới dạng lỏng hoặc đông khô. Mẫu dạng đông khô cho thấy độ ổn định và tuổi thọ cao hơn rất nhiều so với dạng nƣớc, thông thƣờng khoảng hơn 10 năm trong khi dạng nƣớc chỉ tính theo tháng hoặc 9 vài năm. Dạng đông khô dễ vận chuyển hơn dạng nƣớc do yêu cầu về dây truyền lạnh đơn giản hơn. Chính vậy hiện nay các nhà sản xuất đều ƣu tiên sản xuất mẫu chuẩn ở dạng đông khô. Nguyên lý: Sự thăng hoa phần nƣớc ở trạng thái rắn sang hơi hầu nhƣ không gây hại cho sự sống cũng nhƣ các hệ thống enzym và tế bào khi quá trình xảy ra nhanh ở nhiệt độ thấp và chân không. Tá dƣợc có tác dụng nhũ hóa và đông lạnh không làm vỡ tế bào đồng thời ở điều kiện chân không đã loại gần hết oxy nên chủng giống hoặc tế bào vi sinh vật không bị biến tính trong thời gian dài bảo quản sau đó. Cơ chế: Lạnh đông. Giai đoạn làm đông là cho phản ứng hóa học bị ức chế không xảy ra, đồng thời làm ngƣng hẳn các hoạt động xúc tác của enzyme. Kỹ thuật làm đông không chỉ tạo thể rắn cho sinh phẩm mà quan trọng hơn là hình thành một trạng thái kết tinh tối ƣu có thể tránh đƣợc sự hủy hoại sinh phẩm trong giai đoạn chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn. Khi các tinh thể nƣớc đƣợc tạo nên sẽ loại các phân tử khác (NaCl, đƣờng, protein…) và lớn dần lên cho tới khi đông cứng toàn bộ. Thời điểm đó là điểm đông băng. Bằng máy hút chân không tinh thể sẽ chuyển sang dạng hơi thoát ra ngoài đọng lại trong khoang condenser. Đốt nóng ở 300C ở áp lực chân không trong ít nhất 1 giờ. Sản phẩm sau đông khô dễ hút ẩm và hấp thụ oxy trở lại do đó cần hút chân không hoặc dùng khí trơ lấp đầy khoang ống và hàn kín. Hàn và đóng ống Sản phẩm sau khi đông khô xong đƣợc nạp bằng khí trơ (nitơ) vô khuẩn vào ống. Hàn sản phẩm dƣới ngọn đèn gas có nhiệt độ cao. Quá trình đóng ống phải đảm bảo tính đồng nhất của mẫu do vậy các ống nên đƣợc đóng từ một lọ đồng nhất và trong điều kiện thao tác nhƣ nhau. Nhiệt độ và tốc độ khuấy trong khi đóng ống phải ổn định.Tránh nhiễm vi sinh vật, hóa chất hoặc các tiểu phân trong không khí. Do đó, quá trình này phải đƣợc thực hiện trong phòng vô trùng. Có thể sử dụng dạng ống hoặc lọ thủy tinh có nút cao su và hàn kín 10 bên ngoài bằng nắp nhôm để sản xuất mẫu chuẩn . Hiện nay các đơn vị thƣờng dùng dạng ống để sản xuất do độ hàn kín của ống tốt hơn giúp cho viêc bảo quản sản phẩm đƣợc lâu hơn. Tuy nhiên, khi chọn dạng ống cần lƣu ý hình dạng, kích thƣớc ống sao cho dễ bảo quản, dễ mở, dễ lấy hết sản phẩm [2, 21, 27]. Dán nhãn: Nhãn ghi đầy đủ các thông tin sau:  Tên đơn vị sản xuất: Nếu là mẫu chuẩn Quốc tế thì sẽ là WHO.  Tên mẫu chuẩn.  Năm thiết lập.  Mã số.  Số đơn vị Quốc tế  Điều kiện bảo quản.  Tên và địa chỉ nơi cấp phát. Phải ghi “Không được dùng cho người”. Ví dụ, nhãn của vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế nhƣ sau: Năm thiết lập xuNămất Tên mẫu chuẩn Tên đơn vị sản xuất Mã số Số đơn vị Quốc tế Điều kiện bảo quản Hình 1.4: Nhãn của vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ tƣ. 1.3.3 Tiêu chuẩn chất lƣợng Mẫu chuẩn cần đạt đƣợc các yêu cầu về tính đồng nhất, tính đặc trƣng và tính ổn định. Đồng nhất là sự giống nhau giữa các ống mẫu chuẩn. Tính đồng nhất cao cho thấy quy trình sản xuất ổn định, chất lƣợng giữa các ống mẫu nhƣ nhau làm 11 giảm thiểu sai số khi làm thử nghiệm đồng thời các mẫu lấy để kiểm tra cũng có tính đại diện tốt, phản ánh đƣợc chất lƣợng của cả lô vắc xin. Với vắc xin đông khô, tính đồng nhất thể hiện ở hai chỉ tiêu: độ đồng đều về trọng lƣợng khô và công hiệu.Trọng lƣợng khô thể hiện sự phân liều có đồng đều hay không. Công hiệu thể hiện quá trình pha vắc xin lỏng có đồng đều hay không. Tính đặc trƣng cho thấyloại thử nghiệm mà mẫu chuẩn đƣợc sử dụng, từ đó cho thấy các đặc tính cần quan tâm của mẫu chuẩn. Ví dụ: Mẫu chuẩn cho thử nghiệm công hiệu thì đặc tính cần quan tâm hàng đầu là giá trị công hiệu. Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia Bạch hầu đƣợc sử dụng trong kiểm định công hiệu của thành phần bạch hầu nên kiểm tra tính đặc trƣng của mẫu chuẩn chính là kiểm tra chỉ tiêu công hiệu [32, 35]. Tính ổn định: Vắc xin mẫu chuẩn là thƣớc đo cho vắc xin mẫu thử nên phải ổn định trong một khoảng thời gian nhất định (tối thiểu là 5 năm). Để vắc xin đƣợc ổn định, sản phẩm phải đạt yêu cầu về độ ẩm tồn dƣ, cảm quan, vô khuẩn và độ chân không.Sự ổn định công hiệu của vắc xin cũng cần đƣợc kiểm tra trong quá trình sử dụng. Đáp ứng các tiêu chí trên cần kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ đồng đều khối lƣợng, nhận dạng, vô khuẩn, độ ẩm tồn dƣ, độ chân không và công hiệu. Trong đó: Công hiệu (potency):Công hiệu là thử nghiệm đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin. Công hiệu đƣợc thể hiện bằng đơn vị miễn dịch hay hàm lƣợng các chất tạo miễn dịch trong một đơn vị đo lƣờng. Công hiệu cần đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp phù hợp. Nên sử dụng các phƣơng pháp đã đƣợc khuyến cáo bởi WHO hoặc các Dƣợc điển. Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia cần đƣợc nối với chuẩn quốc tế của WHO (chuẩn gốc cao nhất) [8],[10]. Phƣơng pháp xác định giống nhƣ phƣơng pháp sử dụng cho mẫu chuẩn Quốc tế. Trong trƣờng hợp sử dụng phƣơng pháp khác cần có sự chuyển đổi đơn vị phù hợp. Độ chân không, cảm quan:Đây là chỉ tiêu quan trọng cần đƣợc kiểm tra vì bất kỳ sự nứt, vỡ dù rất nhỏ của ống đông khô sẽ khiến độ ẩm tồn dƣ trong ống tăng lên. 12