Tài liệu Xây dựng phương pháp định tính và định lượng alisol a & alisol b 23 acetat trong dược liệu trạch tả (alisma plantago aquatica) trồng tại việt nam​.

NU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Ph ar m ac y ,V KHOA Y DƢỢC an d ĐỖ THỊ THU TRANG ho ol of Me dic ine XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ALISOL A & ALISOL B 23 – ACETAT TRONG DƢỢC LIỆU TRẠCH TẢ (Alisma plantago – aquatica) TRỒNG TẠI VIỆT NAM Co py ri gh t@ Sc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội 2018 NU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Ph ar m ac y ,V KHOA Y DƢỢC an d ĐỖ THỊ THU TRANG ho ol of Me dic ine XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ALISOL A & ALISOL B 23 – ACETAT TRONG DƢỢC LIỆU TRẠCH TẢ (Alisma plantago – aquatica) TRỒNG TẠI VIỆT NAM Sc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa: QH.2013.Y 2. Ths. Nguyễn Thúc Thu Hƣơng Co py ri gh t@ Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Thị Phƣơng Hà Nội 2018 NU LỜI CẢM ƠN Ph ar m ac y ,V Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến T.S Nguyễn Thị Phƣơng (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) và Ths. Nguyễn Thúc Thu Hƣơng (Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, ĐHQGHN) là những người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo, góp ý và đưa ra những ý kiến quý báu để em hoàn thiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Dược liệu và PGS.TS. Phƣơng Thiện Thƣơng đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận. ine an d Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân và anh Lê Ngọc Duy – là những người đã luôn theo sát, hướng dẫn cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. dic Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Y – Dược đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường. of Me Sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh, ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2018 Sinh viên Co py ri gh t@ Sc ho ol Em xin chân thành cảm ơn! Đỗ Thị Thu Trang NU MỤC LỤC ,V DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG ac y DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Co py ri gh t@ Sc ho ol of Me dic ine an d Ph ar m ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 2 1.1. Tổng quan về cây Trạch tả (Alisma orientale (Sam.) Juzep.) ................ 2 1.1.1. Tên khoa học ..................................................................................... 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố .......................................................... 2 1.1.3. Bộ phận dùng .................................................................................... 3 1.1.4. Thành phần hóa học. ......................................................................... 3 1.1.5. Một số tác dụng dược lý ................................................................... 7 1.2. Tổng quan về alisol A và alisol B 23 – acetat ........................................ 9 1.2.1. Tổng quan về alisol A ....................................................................... 9 1.2.2. Tổng quan về alisol B 23 – acetat ................................................... 11 1.3. Một số nghiên cứu định tính, định lượng AA và AB23 trong Trạch tả ..... 13 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ........................................................... 13 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ............................................................. 14 1.3.3. Tiêu chuẩn về dược liệu Trạch tả trong một số Dược điển ............ 14 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 16 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu ..................................................... 16 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu. .................................................................... 16 2.1.2. Hóa chất và dung môi ..................................................................... 17 2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu....................................................... 17 2.2. Nội dung nghiên cứu. ............................................................................ 17 2.2.1. Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng.............................. 17 2.2.2. Định lượng AA bằng HPLC. .......................................................... 17 2.2.3. Phân tích mẫu thực.......................................................................... 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 18 2.3.1. Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng............................... 18 2.3.2. Định lượng AA bằng HPLC ........................................................... 19 Co py ri gh t@ Sc ho ol of Me TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC dic ine an d Ph ar m ac y ,V NU 2.3.3. Phân tích mẫu thực.......................................................................... 22 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................... 23 3.1. Định tính AA và AB23 bằng TLC ........................................................ 23 3.1.1. Định tính AB23 ............................................................................... 23 3.1.2. Định tính AA................................................................................... 24 3.1.3. Định tính AA và AB23 trên một số mẫu Trạch tả bằng sắc ký lớp mỏng.......................................................................................................... 25 3.2. Định lượng AA bằng HPLC ................................................................. 27 3.2.1. Lựa chọn pha tĩnh ........................................................................... 27 3.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu.......................................................... 28 3.2.4. Thẩm định phương pháp định lượng .............................................. 30 3.3. Ứng dụng phương pháp ........................................................................ 35 3.4. Bàn luận ................................................................................................ 35 3.4.1. Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Trạch tả ở Việt Nam 35 3.4.2. Xây dựng phương pháp định tính ................................................... 36 3.4.4. Phương pháp định lượng................................................................. 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 39 Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Alisol A Acetonitril Alisol B 23 - acetat AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội phân tích EtOH Ethanol Ethanol HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao ac y Alisol A Acetonitrile Alisol B 23 - acetate nhà Giới hạn phát hiện Limid of Detection LOQ Limid of Qualification MeOH Methanol MS Mass Spectrometry Phổ khối RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối S/N Signal/Noise dic Me of ho ol Methanol Tín hiệu/nhiễu đường nền Số thứ tự Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng Phổ tử ngoại - khả kiến Ultraviolet Visible t@ gh py ri Giới hạn định lượng Sc STT UVVIS v/v ine LOD TLC Hóa an d Ph ar m các Khối lượng/ khối lượng kl/kl Co Tên tiếng Việt ,V Từ viết tắt AA ACN AB23 NU DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Volume/volume Thể tích/thể tích Tên bảng 1 Bảng 1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới về định lượng AA và AB23 trong Trạch tả 2 Bảng 1.2 Chương trình dung môi theo Dược điển Hồng Kông 3 Bảng 2.1 Mẫu Trạch tả 4 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết 28 5 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 29 6 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát thời gian chiết 29 7 Bảng 3.4 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống 31 8 Bảng 3.5 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của AA 32 9 Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại 33 10 Bảng 3.7 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp 34 11 Bảng 3.8 Kết quả định lượng AA trên một số mẫu Trạch tả 35 ine an d Ph ar m ac y 13 dic Me of ho ol Sc t@ gh py ri Co Trang ,V STT NU DANH MỤC BẢNG 14 16 ,V STT Tên hình vẽ Trang Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Trạch tả 2 Hình 1.2 Thân rễ và thân rễ thái lát Trạch tả 3 Hình 1.3 Công thức một số triterpenoid trong thân rễ Trạch tả 4 4 Hình 1.4 Công thức một số diterpenoid trong thân rễ Trạch tả 5 5 Hình 1. 5 Công thức một số sequiterpenoid trong thân rễ Trạch tả 6 6 Hình 1.6 Công thức cấu tạo của AA 9 7 Hình 1.7 Công thức cấu tạo của AB23 11 8 Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Trạch tả lưu trữ tại Viện Dược liệu 16 9 Hình 3.1. Khảo sát định tính AB23 23 10 Hình 3.2 Khảo sát định tính AA 24 11 Hình 3.3 Sắc ký đồ định tính AA trên một số mẫu Trạch tả Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính AB23 trên một số mẫu Trạch tả 26 Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động 28 Ph ar m an d ine dic Me of ho ol Sc t@ 13 2 ac y 1 12 3 26 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được lựa chọn 30 15 Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp HPLC - UV 31 16 Hình 3.8 Sắc ký đồ nền mẫu thử tại LOD 32 17 Hình 3.9 Đường chuẩn của AA 33 gh 14 py ri Co NU DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ NU ĐẶT VẤN ĐỀ Ph ar m ac y ,V Trạch tả có tên khoa học là Alisma orientale (Sam.) Juzep., tên đồng danh (Alisma plantago – aquatica). Thuộc họ Trạch tả Alismataceae. Bộ phận dùng làm thuốc là thân rễ khôn đã cạo sạch vỏ. Trạch tả là một trong những vị thuốc quý đã được sử dụng lâu đời trong nền Y học cổ truyền Việt Nam và Trung Hoa với các tác dụng: lợi tiểu, hạ mỡ máu, tăng cường miễn dịch, kháng viêm, giảm đường huyết… ine an d Nhóm chất có hoạt tính sinh học chính trong Trạch tả là các hợp chất triterpenoids, trong đó có alisol A và alisol B 23 - acetat. AB23 đã được chứng minh có tác dụng lợi tiểu, chống viêm gan nhiễm mỡ không do rượu, giảm ung thư buồng trứng, chống dị ứng… Alisol A ngoài hướng tác dụng chủ yếu trên tế bào viêm gan còn có tác dụng khác như kháng khuẩn, tăng cường miễn dịch… Sc ho ol of Me dic Ở Việt Nam, việc đánh giá chất lượng dược liệu Trạch tả thường được sử dụng theo Dược điển Việt Nam IV, tuy nhiên các tiêu chuẩn còn hạn chế, chưa đáp ứng được yêu cầu đánh giá nên chất lượng dược liệu Trạch tả trên thị trường chưa được đảm bảo. Các nghiên cứu về phân tích thành phần hóa học trên thế giới hầu hết đều sử dụng alisol B 23 - acetat làm tiêu chí đánh giá chất lượng dược liệu Trạch tả. Tuy nhiên, ngoài alisol B 23 - acetat thì alisol A cũng chiếm hàm lượng lớn, có nhiều tác dụng quý với tiềm năng nghiên cứu, phát triển để ứng dụng trong điều trị. Vì vậy, alisol A cũng là một thành phần quan trọng, có thể sử dụng làm ―maker‖ trong kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Trạch tả. t@ Từ những thực tiễn trên, nhằm xây dựng một phương pháp đánh giá chất lượng dược liệu Trạch tả, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng gh phƣơng pháp định tính và định lƣợng alisol A và alisol B 23 - acetat trong dƣợc liệu Trạch tả (Alisma plantago – aquatica) trồng tại Việt Nam” với mục tiêu: Co py ri - Xây dựng phương pháp định tính và định lượng alisol A và alisol B 23 – acetat trong dược liệu Trạch tả trồng tại Việt Nam. - Áp dụng phương pháp phân tích trên một số mẫu Trạch tả. 1 1.1. Tổng quan về cây Trạch tả (Alisma orientale (Sam.) Juzep.) NU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ac y ,V 1.1.1. Tên khoa học Trạch tả có tên khoa học là Alisma orientale (Sam.) Juzep., thuộc họ Alismataceae, chi Alisma, có tên khoa học đồng nghĩa khác là Alisma plantago – aquatica. Ở Việt Nam, Trạch tả còn được gọi là thủy đề, mã đề nước [4]. Co py ri gh t@ Sc ho ol of Me dic ine an d Ph ar m 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố Cây thảo, cao 40-50 cm. Thân rễ hình cầu hoặc hình con quay, nạc, màu trắng, lá có cuống dài, bẹ to mọc ốp vào nhau, xòe ra như hình hoa thị, phiến lá hình trái xoan hay hình trứng, mép nguyên lượn sóng, gân lá 5-7 hình cung. Cụm hoa mọc trên một cán thẳng dài có khi đến 1m thành chùy có nhiều vòng hoa xếp thành tầng nhỏ dần về phía ngọn, mỗi tầng phân nhánh thành những chùy nhỏ; hoa lưỡng tính, màu trắng hay hồng, đài có 3 răng màu lục, tồn tại đến khi thành quả; tràng hoa 3 cánh có 1 cựa màu vàng nhạt rất mỏng và rụng sớm; nhị 6 – 9, dẹt, bầu nhiều ô xếp thành một vòng, mỗi ô có một noãn, vòi nhụy mảnh dễ rụng. Quả bế dẹp, dạng màng, có đài tồn tại. Mùa hoa quả: tháng 10 – 12. Chi Alisma L. có khoảng 10 loài, phân bố rải rác từ vùng nhiệt đới đến vùng cận nhiệt đới và ôn đới ẩm. Trạch tả có nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Việt Nam... Hiện đã biết có hai loài được dùng làm thuốc là Trạch tả (A. plantago – aquatica L.) và loài A. canaliculatum. Ở Việt Nam, Trạch tả chỉ thấy trồng ở các tỉnh như Thái Bình, Hà Nam, Hải Dương, Hưng Yên [4]. Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Trạch tả [57,58] 2 NU ine an d Ph ar m ac y ,V 1.1.3. Bộ phận dùng Dược liệu Trạch tả là thân rễ của cây Trạch tả: Thân rễ thu hoạch vào tháng 4-5 khi cây chuyển sang màu vàng. Loại bỏ rễ con, cạo vỏ ngoài và rửa sạch, phơi hay sấy khô. Khi dùng, ủ thân rễ cho mềm, thái lát, phơi khô (dùng sống) hoặc tẩm muối (100 g Trạch tả với 2 g muối ăn hòa trong 60 ml nước), sao vàng [4]. Hình 1.2 Thân rễ và thân rễ thái lát Trạch tả [56] Co py ri gh t@ Sc ho ol of Me dic 1.1.4. Thành phần hóa học. Ở Trạch tả, thân rễ là bộ phận truyền thống được sử dụng trong Y học cổ truyền nên hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào các thành phần hóa học ở thân rễ. Theo các nghiên cứu đã được công bố trước đây, các terpenoid được coi là thành phần chính trong Trạch tả [17]. Với hợp chất đặc trưng là triterpenoid protostane (alisol A – F và dẫn xuất) và sesquiterpenoid guaiane (alismol, alismoxide, orientalols A – F và orientalols sulfat). Ngoài ra, Trạch tả cũng chứa một lượng nhỏ diterpenoid, flavonoid, alkaloid, asparagine, phytosterol, acid béo và nhựa. Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học trong thân rễ Trạch tả còn ít. Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006) với mẫu Trạch tả thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, bằng các phương pháp sắc ký kết hợp đã phân lập được bảy chất: alismoxid, (+) pinoresinol, octadeca 9,12 – dienoic acid và octadeca – 9,12 – dienoic acid methyl ester, AA, AA 24 – acetat và alisol G [2]. 3 R3 OH OH OH ine R2 OH OH OH R4 OH OH OH R5 H O H R6 O O O Hợp chất R1 R2 R3 R4 R5 R6 alisol B AB23 alisol C 23 – acetat O O O H H H OH OH OH H H H H H O OH OAc OAc Co py ri gh t@ Sc (3) (4) (6) ho ol of Me (1) (2) (5) R1 OH OH OH dic Hợp chất AA alisol A 24 – acetat alisol E an d Ph ar m ac y ,V NU 1.1.4.1. Các triterpenoid Các triterpenoid được coi là thành phần chính có hoạt tính sinh học trong rễ Trạch tả. Đến nay, 55 triterpenoid đã được phân lập và xác định cấu trúc. Ngay từ năm 1968, Murata và cộng sự đã phân lập được AA (1), alisol A 24 – acetat (2), alisol B (3), AB23 (4) và alisol E (5) từ thân rễ Trạch tả [30]. Sau đó, 4 hợp chất đã biết và hợp chất mới là alisol C 23 – acetat (6) được tách ra từ chiết xuất methanol của thân rễ [31]. Alisol O (7) và alisol P (8) được phân lập năm 2008 [53]. Gần đây, năm 2012 Jin và cộng sự đã phân lập được một triterpenoid mới là alisol Q 23 – acetat (9) [18]. (7) alisol O (8) alisol P (9) alisol Q 23 – acetat Hình 1.3 Công thức một số triterpenoid trong thân rễ Trạch tả 1.1.4.2. Các diterpenoid 4 Ph ar m ac y ,V NU Cho đến nay, mới chỉ có 3 diterpenoid được phân lập và xác định. Năm 1994, kaurane-2,12-dione (10) được phân lập từ thân rễ Trạch tả bởi Nakajima và cộng sự [32]. Sau đó, Peng và cộng sự phân lập được hai diterpenoid mới là oriediterpenol (11) và oriediterpenoside (12) từ thân rễ Trạch tả [13]. (11) oriediterpenol dic ine an d (10) kaurane-2,12-dione (12) oriediterpenoside Me Hình 1.4 Công thức một số diterpenoid trong thân rễ Trạch tả 1.1.4.3. Các sequiterpenoid ho ol of Có khoảng 36 sequiterpenoid đã được xác định, chia thành 4 nhóm: guaiane, germaraerane, eudesmane và oplopanane. Co py ri gh t@ Sc Alismol (13) và alismoxide (14) thuộc nhóm guaiane là các sequiterpenoid đầu tiên được phân lập, bởi Yoshiteru và cộng sự (1983) [33]. Hai germaraerane sequiterpenes (germaraerane C (15) và germaraerane D (16)) và dẫn chất của alismol (orientalol A (17), B, C và sulfoorientalol A, B (18), C, D) [45] [46]. Năm 1994, Nakajima và cộng sự đã phân lập được hai sesquiterpenes là 10-O-methyl-alismoxit (19) và eudesma-4(14)-en-1,6-diol (20) trong Trạch tả đã qua chế biến [32]. Năm 2001, orientalol E (21) thuộc nhóm oplopanane được phân lập bởi Peng và cộng sự [34]. 5 NU ,V ac y (14,17,18,19) Hợp chất R1 (14) Alismoxide CH3 (17) Orientalol A OH (18) Sulfoorientalol B (19) 10-O-methyl-alismoxit R2 R3 Ph ar m (13) alismol R4 OH CH3 OH OH CH3 HSO3 OH OH CH3 OCH3 OH OH OCH3 an d OH ine Hợp chất (16) Germaraerane D of Me dic (15) Germaraerane C ho ol (20) eudesma-4(14)-en-1,6-diol (21) orientalol E Hình 1. 5 Công thức một số sequiterpenoid trong thân rễ Trạch tả Co py ri gh t@ Sc 1.1.4.4. Các hợp chất khác Có khoảng 9 flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc từ Trạch tả: robustaflavon, amentoflavon, 2,20,4 – trihydroxylchalcone, daidzein, calycosin, 7 – hydroxyl – coumarin, apigene, luteolin, emodin [15,24]. Năm 1993, Tomoda và cộng sự phân lập được alisman PIIIF thuộc dẫn chất polysaccharides [39]. Sau đó, 2 polysacchrides khác được phân lập là alisman PII và alisman SI [37,40]. Ngoài ra, trong Trạch tả còn xác định được một số chất khác như: dulcitol, daucosterol [44], alismin [36]. 6 of Me dic ine an d Ph ar m ac y ,V NU 1.1.5. Một số tác dụng dƣợc lý  Lợi tiểu Trạch tả đã được sử dụng lâu đời trong Y học cổ truyền Trung Hoa với mục đích điều trị thiểu niệu. Nghiên cứu trên chuột cho thấy dịch chiết EtOH Trạch tả và alisol A 24-acetat ở liều 20 mg/kg làm tăng đáng kể lượng nước tiểu nhưng thấp hơn hydroclothiazid [40,41]. Nghiên cứu trên chuột SpragueDawley cho thấy dịch chiết ethanol Trạch tả có tác dụng lợi tiểu ở liều thấp (2,5 mg/kg; 5 mg/kg; 10 mg/kg) nhưng ở liều cao (20, 40 và 80 mg/kg) lại làm giảm đáng kể lượng nước tiểu [9]. Tương tự, khi khảo sát với các dịch chiết khác, cho thấy: Dịch chiết nbutanol (12,5; 25 và 50 mg/kg) và ethyl acetat (100; 400 mg/kg) làm tăng lượng nước tiểu. Dịch chiết n-butanol (75; 100 mg/kg) và ethyl acetat (800 mg/kg) làm giảm lượng nước tiểu [7]. Điều đó cho thấy tác động sinh học trên thận của các dịch chiết Trạch tả ở các hàm lượng khác nhau là khác nhau, nên liều lượng sử dụng cần được chú ý nhiều hơn trong các ứng dụng lâm sàng. Gần đây, nghiên cứu bởi Zhang và cộng sự (2017) nhằm đánh giá tính tương thích giữa năm triterpen chính trong Trạch tả với tác dụng lợi tiểu. Kết quả cho thấy tỷ lệ thành phần thích hợp nhất trong hoạt động lợi tiểu là: AB23 : alisol B : alisol A 24-acetate : AA : alisol C 23-acetate (7.2: 0.6: 2.8: 3.0: 6.4) [52]. Co py ri gh t@ Sc ho ol  Hạ Lipid máu. Từ năm 1970, các thí nghiệm trên chuột Sprague-Dawley cho thấy tác dụng hạ lipid máu khi dùng alisol A 24-acetat liều 425 mg/kg [16]. Nghiên cứu gần đây trên chuột tăng lipid máu cho thấy Trạch tả liều 2,26 g/kg/ngày làm giảm nồng độ cholesterol và triglyceride trong huyết thanh và gan, nhưng làm tăng nồng độ HDL huyết thanh. Từ đó, người ta cho rằng Trạch tả làm giảm sự tổng hợp cholesterol ở gan thay vì làm tăng quá trình chuyển hóa cholesterol [10]. Một nghiên cứu khác trên chuột gây đột biến gen apoE và làm tăng sự biểu hiện heparan sulfate proteoglycan ở gan cho thấy Trạch tả và simvastatin 7 ac y ,V NU ở liều 10 lần so với liều sử dụng trên người có ý nghĩa điều trị với chứng xơ vữa động mạch, khi làm giảm đồng thời cholesterol toàn phần và LDL [35]. Nhìn chung, Trạch tả có thể làm giảm cholesterol trên chuột để dự phòng tăng lipid máu. Tuy nhiên các nghiên cứu còn hạn chế để ứng dụng trong điều trị lâm sàng. an d Ph ar m  Hạ đƣờng huyết. Từ lâu đời, Trạch tả đã được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị tiểu đường. Nghiên cứu cho thấy các triterpenes loại protostane có hoạt tính hạ đường huyết thông qua cơ chế ức chế hoạt động αglucosidase và thúc đẩy sự hấp thu glucose, mà không làm tăng adipogenesis như thiazolidinediones [23]. Tuy nhiên, các thử nghiệm mới được thực hiện trên in vitro và cần được nghiên cứu sâu hơn trên cơ thể người để ứng dụng trong lâm sàng. ho ol of Me dic ine  Ức chế hình thành sỏi thận Tác dụng ức chế sự hình thành sỏi thận đã được chứng minh bằng các nghiên cứu dược lý hiện đại trên chuột. Nghiên cứu cho thấy khi cho một nhóm chuột được điều trị trong 4 tuần với 0,5 mL/kg triterpenoids thì hàm lượng canxi trong mô thận, lượng canxi bài tiết trong nước tiểu 24h, creatinin huyết thanh và nồng độ ure trong máu giảm rõ rệt so với nhóm đối chứng [6,29]. Nghiên cứu bởi Cao và cộng sự cũng cho thấy, khi sử dụng 1 mL/ngày các thành phần có hoạt tính của Trạch tả trong 28 ngày có thể làm giảm sự hình thành canxi oxalate ở thận [5].  Tăng cƣờng miễn dịch Sc Tác động của Trạch tả trên hệ miễn dịch đã được đánh giá trên chuột bởi Kubo và cộng sự từ năm 1997. Nghiên cứu cho thấy dịch chiết methanol t@ Trạch tả liều 50 mg/kg, 200 mg/kg có tác động tích cực trên bệnh nhân có hiện tượng arthus. Những kết quả chỉ ra rằng dịch chiết Trạch tả có ảnh gh hưởng trên các phản ứng dị ứng khác nhau, đặc biệt là dị ứng loại III [20]. Nghiên cứu bởi Lee và cộng sự (2012) cho thấy dịch chiết EtOH 70% py ri của Trạch tả ức chế đáng kể 5 – lipoxygenase, chất xúc tác quá trình sản xuất Co leukotriene từ bạch cầu ưa base ở chuột và sự giải phóng β-hexosaminidase 8 NU bởi các tế bào kháng nguyên RBL-2H3. Nó cũng làm suy yếu phản ứng quá mẫn muộn ở chuột [21]. ,V  Chống viêm Hoạt động chống viêm của Trạch tả mới được nghiên cứu trong thời ac y gian gần đây. Khi cho chuột uống dịch chiết Trạch tả liều 0,3 g/kg hoặc 1,2 g/kg trong 14 ngày, sau đó gây tồn thương phổi bằng cách tiêm Ph ar m lipopolysaccharide (0,01 g/kg). Nhận thấy có sự cải thiện tổn thương phổi cấp đáng kể do tác động ức chế sự xâm nhập của bạch cầu trung tính, ức chế sự biểu hiện gen COX – 2, IL – 1B [14]. Nghiên cứu khác bởi Kim và cộng sự (2013) cũng cho kết quả, chiết xuất Trạch tả giúp tăng tỷ lệ sống sót ở chuột an d ngay cả với liều độc lipopolysaccharide [19].  Chống khối u Trong nghiên cứu của Fong và cộng sự (2007) cho thấy tác dụng ức ine chế hiệp đồng tăng lên khi kết hợp dịch chiết Trạch tả 25 mg/mL với thuốc dic chống ung thư: actinomycin D, puromycin, paclitaxel, vinblastine và doxorubicin, trên quá trình biểu hiện P-glycoprotein [12]. AB23 được coi Me như ứng cử viên tiềm năng cho việc đảo ngược hiện tượng đa kháng thuốc trên bệnh nhân ung thư [41]. Tổng quan về alisol A và alisol B 23 – acetat of 1.2. t@ Sc ho ol 1.2.1. Tổng quan về alisol A 1.2.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất Co py ri gh Hình 1.6 Công thức cấu tạo của AA Công thức phân tử: C30H50O5 Tên khoa học (IUPAC): (5R, 8S, 9S,10S, 11S, 14R) – 11 – hydroxy – 4,4,8,10,14 – pentamethyl – 17 – [(2R, 4S, 5R) – 4,5,6 – trihydroxy – 6 – 9 ac y ,V NU methylheptan – 2 – yl] – 1,2,5,6,7,9,11,12,15,16 – decahydrocyclopentan [a] phenathren – 3 – one. Tên thông thường: alisol A Tính chất: - Dạng bột, màu trắng, không mùi, nóng chảy ở 90 - 910C. - Trọng lượng phân tử: 490,725 g/mol. of Me dic ine an d Ph ar m 1.2.1.2. Tác dụng dược lý.  Chống virus viêm gan B. Nghiên cứu sơ bộ đã chứng minh rằng những thay đổi đơn giản trong cấu trúc gốc AA có thể tạo ra một số dẫn xuất tiềm năng chống lại HBV. 40 dẫn xuất của AA được tổng hợp và khảo sát trong ảnh hưởng chống virus viêm gan B in vitro. Và thu được 14 chất tiềm năng [50]. Hợp chất 6a cho hoạt tính cao chống lại sự biểu hiện của kháng nguyên HBV bề mặt (IC50= 0,024 mM), kháng nguyên HBV e (IC50=0,028 mM) (SIHBsAg >108, SIHBeAg > 93) [49]. 6a ho ol AA Co py ri gh t@ Sc Thử nghiệm khác trên 32 dẫn xuất tetra-acyl hóa của AA cho thấy các hợp chất A1, A23, A24 có hoạt tính cao chống lại sự tiết kháng nguyên bề mặt HBV với giá trị IC50 tương ứng là 0,0048, 0,0044, 0,014 mM, kháng nguyên HBV e với giá trị IC50 tương ứng 0,011, 0,012, 0,018 mM; SIHBsAg > 333, SIHBeAg > 145; SIHBsAg = 209, SIHBeAg = 77; SIHBsAg > 200, SIHBeAg > 156. Nghiên cứu bổ sung trên chuột cho thấy hợp chất A1 có lợi ích về dược động học (t1/2=1,63h) (F=40,9%) [51]. 10 Ph ar m ac y A23: R = A24: R = NU ,V A1: R = Ac  Kháng khuẩn. an d Nghiên cứu gần đây bởi Ma và cộng sự (2016) cho thấy AA có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các chủng Gram dương Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus với giá trị MIC là 12,5-100mg/mL [25].  Tăng cƣờng miễn dịch. dic ine Nghiên cứu đánh giá trên chuột bởi Kubo và cộng sự từ năm 1997 cho thấy AA hàm lượng 0,05mmol/kg, 0,2mmol/kg có tác động tích cực trên bệnh nhân có hiện tượng arthus [20]. Me 1.2.2. Tổng quan về alisol B 23 – acetat Sc ho ol of 1.2.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất Hình 1.7 Công thức cấu tạo của AB23 Co py ri gh t@ Công thức phân tử: C32H50O5 Tên khoa học (IUPAC): [(1S,3R)-1-[(2R)-3,3-dimethyloxiran-2-yl]-3[(5R,8S,9S,10S,11S,14R)-11-hydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-3-oxo1,2,5,6,7,9,11,12,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl] acetate. Tên thông thường: alisol B 23 - acetat Tính chất: Dạng bột, màu trắng. Trọng lượng phân tử: 514,747 g/mol. 11 ,V NU 1.2.2.2. Một số tác dụng dƣợc lý.  Trên thận. Nghiên cứu bởi Chen và cộng sự cho thấy trên những bệnh nhân thận mãn tính có sự kích hoạt các trục RAS/Wnt/ -catein dẫn đến tổn thương các ac y tế bào biểu mô ống thận, đã được cải thiện khi sử dụng AB23 [8]. Me dic ine an d Ph ar m  Chống viêm gan. Năm 2017, một nghiên cứu thực hiện nhằm đánh giá tác động bảo vệ của AB23 với bệnh viêm gan nhiễm mỡ không do rượu (NASH) ở chuột. NASH được gây ra bằng cách cho chuột ăn chế độ thiếu methionine và choline trong 4 tuần. Sau đó mẫu máu và gan được thu thập. Kết quả chỉ ra khi điều trị với AB23 làm giảm đáng kể sự tích lũy triglycerid ở gan, từ đó làm giảm nguy cơ viêm, xơ gan [28]. Một nghiên cứu khác chứng minh tác dụng bảo vệ của AB23 chống lại độc tính gan và ứ mật gây ra bởi 17α-ethinylestradiol (EE). AB23 làm giảm tổng hợp acid mật thông qua việc ức chế biểu hiện gen Cyp7a1 và Cyp8b1, làm tăng chuyển hóa acid mật qua việc kích thích biểu hiện gen Sult2a1 [26]. AB23 cũng giúp tăng sinh tế bào gan, có tiềm năng trở thành lựa chọn điều trị mới ở những bệnh nhân cắt gan [27], kháng virus viêm gan B [17]. t@ Sc ho ol of  Kháng tế bào ung thƣ buồng trứng. Năm 2016, Zhang và cộng sự đã tiến hành xét nghiệm MTT cùng với việc phân tích chu trình tế bào để đánh giá khả năng tồn tại của tế bào ung thư buồng trứng sau khi điều trị với AB23. Kết quả cho thấy AB23 ức chế đáng kể biểu hiện của cả ba dòng tế bào ung thư buồng trứng, giảm mức độ biểu hiện của các protein CDK4, CDK6 và cyclin D, ngăn chặn chu trình tế bào ở pha G1. AB23 ức chế quá trình tăng sinh, di căn và xâm lấn của các tế bào ung thư buồng trứng [48]. Co py ri gh  Các tác dụng khác: Ngoài ra, AB23 còn có tác dụng kháng khuẩn [18], chống dị ứng [21], ức chế miễn dịch [47], ức chế quá trình kháng thuốc qua trung gian Pglycoprotein [41]… 12