Tài liệu Xác định hàm lượng crystial violet & leuco crystal violet trong sản phẩm thủy sản

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN NGUYỄN TUẤN THÀNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CRYSTIAL VIOLET & LEUCO CRYSTAL VIOLET TRONG SẢN PHẨM THỦY SẢN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN 2010 i TÓM TẮT Trong tình hình hiện nay, xuất khẩu thủy sản của nước ta phải đối mặt với một vấn đề khó khăn rất lớn, đó là vấn đề dịch bệnh và dư lượng hóa chất, kháng sinh trong thủy sản. Dư lượng các hóa chất, kháng sinh còn tồn đọng trong thủy sản rất có hại đối với sức khỏe con người và nền kinh tế nước nhà,trong đó có Crystal Violet & Leuco Crystal Violet . Phương pháp thử hấp thu miễn dịch dùng enzym liên kết (ELISA) được sử dụng để “Xác định hàm lượng Crystial Violet & Leuco Crystal Violet trong sản phẩm thủy sản” có ưu điểm độ nhạy cao, xử lý mẫu đơn giản, cho kết quả nhanh chóng và đặc biệt đầu tư thiết bị tương đối rẻ tiền. Vì vậy, việc “Xác định hàm lượng Crystial violet & Leuco crystal violet trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp miễn dịch” được thực hiện nhằm mục đích xác định giá trị sử dụng của phương pháp “Xác định hàm lượng Crystal Violet & Leuco Crystal Violet trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp miễn dịch” trên nền mẫu cá tra theo các tiêu chí quy định trong Quyết định 657/2002/EC của Liên Minh Châu Âu. Đề tài bao gồm các phần sau: Xác định độ tuyến tính, khoảng làm việc của phương pháp Ruggedness: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích Xác định giới hạn phát hiện CCbeta. Xác định độ lặp lại và độ tái lặp. Các kết quả thu được trong quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp đều đáp ứng các yêu cầu đối với phương pháp sàng lọc, định lượng theo Quyết định 657/2002-EC. Do đó, phương pháp này thích hợp để sử dụng làm phương pháp sàng lọc trong phòng kiểm nghiệm. Tuy nhiên, khi phương pháp này cho kết quả dương tính cần kiểm tra khẳng định lại bằng phương pháp sắc ký. ii LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành tốt luận văn và có được kết quả như ngày hôm nay. Trước hết, em xin được chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Thủy Sản, quí thầy cô trong Bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thủy Sản đã tạo mọi điều kiện giúp em có thể hoàn thành tốt luận văn này và quí thầy cô trường Đại học Cần Thơ đã trang bị những kiến thức vô cùng quý giá trong suốt quá trình học tập tại trường. Xin gửi lòng biết ơn sâu sắc nhất, chân thành nhất đến chị Huỳnh Thị Ngọc Liên trưởng phòng kiểm hóa Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 6 (NAFIQAD 6) đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn một cách tốt nhất. Bên cạnh đó, em cũng chân thành cảm ơn thầy Phạm Văn Hùng phó giám đốc Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 6 (NAFIQAD 6), anh Hồ, và các anh chị khác ở phòng kiểm nghiệm Hóa Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 6 đã tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập tại cơ quan. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Cần Thơ, tháng 05 năm 2010 Sinh viên thực hiện Nguyễn Tuấn Thành iii MỤC LỤC TÓM TẮT ...................................................................................................................i LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................... iii MỤC LỤC.................................................................................................................iv DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................vi DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.................................................................................. viii Phần 1 GIỚI THIỆU ...................................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề .........................................................................................................1 1.2 Mục tiêu của đề tài ............................................................................................2 1.3 Nội dung của đề tài............................................................................................2 1.4 Thời gian thực hiện: ..........................................................................................2 Phần 2 TỔNG QUAN .................................................................................................3 2.1 Giới thiệu về đối tượng thủy sản làm nghiên cứu (cá tra)...................................3 2.1.1 Phân loại ....................................................................................................3 2.1.2 Đặc điểm ....................................................................................................3 2.1.3 Tình hình nuôi cá Tra ở ĐBSCL .................................................................3 2.1.4 Tình hình sử dụng hóa chất và kháng sinh trong ao nuôi cá Tra ..................4 2.2 Giới thiệu về Crystial violet...............................................................................5 2.2.1 Sơ lược về Crystial violet ...........................................................................5 2.2.2 Các ứng dụng của Crystal violet .................................................................6 2.2.3 Tác hại của Crystal violet ...........................................................................7 2.2.4 Tình hình sử dụng Crystal violet .................................................................7 2.2.5 Chất thay thế Crystal violet.........................................................................8 2.3 Giới thiệu về phương pháp thử hấp thu miễn dịch dùng enzym liên kết (ELISA) ...............................................................................................................................8 2.3.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển .................................................................8 2.3.2 ELISA là gì?...............................................................................................9 2.3.3 Phân loại ..................................................................................................10 2.3.4. Ứng dụng ................................................................................................11 2.3.5. Ưu khuyết điểm .......................................................................................11 2.3.5.1 Ưu điểm ................................................................................................11 2.4 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích (định lượng, có tính sàng lọc cho hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng)............................................................11 2.4.1 Giải thích thuật ngữ ..................................................................................11 2.4.2 Các thông số đánh giá...............................................................................12 Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................................14 3.1 Địa điểm thực hiện để tài.................................................................................14 3.2 Phạm vi nghiên cứu.........................................................................................14 3.3 Vật liệu ...........................................................................................................14 3.3.1 Mẫu thí nghiệm ........................................................................................14 3.3.2 Hóa chất sử dụng ......................................................................................14 3.3.3 Thiết bị - dụng cụ .....................................................................................15 3.4 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................16 3.4.1 Nguyên tắc của phương pháp....................................................................16 iv 3.4.2 Tính đặc hiệu của kit thử sử dụng .............................................................17 3.4.3 Phương pháp phân tích mẫu......................................................................17 3.4.4 Chuẩn bị hóa chất chất chuẩn....................................................................18 3.4.5 Chuẩn bị mẫu ...........................................................................................19 3.4.6 Tiến hành phát hiện tổng CV/LCV bằng kĩ thuật miễn dịch dùng enzyme liên kết. .............................................................................................................20 3.4.7 Đọc kết quả ..............................................................................................21 3.5 Tiến hành xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp.......................................21 3.5.1 Xác định độ tuyến tính, khoảng làm việc của phương pháp.......................21 3.5.2 Ruggedness (Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích):......21 3.5.3 Xác định giới hạn phát hiện CCβ ..............................................................22 3.5.4 Xác định độ lặp lại và độ tái lặp................................................................22 3.6 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu ............................................................22 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................26 4.1 Độ đặc hiệu : ...................................................................................................26 4.2. Khảo sát độ tuyến tính của đường chuẩn, khoảng làm việc của kit thử............26 4.3 Ruggedness: (Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích):............28 4.4 Xác định giới hạn phát hiện CCβ.....................................................................28 4.4.1. Khảo sát độ nhiễu của của nền mẫu cá tra, xác định CCα và CCβ ............28 4.4.2. Thẩm tra sai số β: ....................................................................................29 4.5 Xác định độ lặp lại và độ tái lặp ......................................................................30 4.6 Tổng hợp kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp “Xác định hàm lượng Crystal violet và Leuco Crystal violet trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp miễn dịch” ....................................................................................................32 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..........................................................................33 5.1 Kết luận ..........................................................................................................33 5.2 Đề xuất............................................................................................................33 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................34 PHỤ LỤC 1 ..............................................................................................................35 PHỤ LỤC 2: Hình ảnh một số thiết bị dùng trong quá trình thực hiện đề tài..............36 PHỤ LỤC 3 ..............................................................................................................37 v DANH SÁCH BẢNG Bảng.4.1: Bảng hệ số hồi quy tuyến tính của đuờng chuẩn ........................................27 Bảng 4.2 : Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của pH dung dịch đệm trích C .................28 Bảng 4.3 : Kết quả khảo sát độ nhiễu của của nền mẫu cá tra, xác định CCα và CCβ .................................................................................................................................29 Bảng 4.4: Kết quả khảo sát giá trị CCbeta thực tế......................................................30 Bảng 4.5: Kết quả khảo sát giá trị độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn nội bộ phòng (SDW/L). ....................................................................................................................31 Bảng 4.6: Tổng hợp kết quả ......................................................................................32 vi DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1:Biểu đồ diễn biến diện tích và sản lượng cá tra ở vùng ĐBSCL giai đoạn 1997-7T/2008 và quy hoạch đến năm 2020 (nguồn Dương Công Chinh, Đồng An Thụy,2009-TT. Nghiên cứu Môi trường & XLN-Viện Khoa học Thủy lợi miền Nam). ...................................................................................................................................4 Hình 2.2 Công thức cấu tạo của CV ............................................................................6 Hình 2.3: Công thức cấu tạo của LCV.........................................................................6 Hình 4.1: Đồ thị đường chuẩn với nồng độ thêm vào 1 µg/kg....................................27 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CV: Crystal Violet LCV: Leuco Crystal Violet MG: Malachit Green LMG: Leuco Malachit Green ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long KN: Kháng nguyên KT: Kháng thể ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ACN: acetonitril DCM: dichloromethane viii Phần 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Đất nước Việt Nam có lợi thế là có bờ biển dài với nhiều cửa sông, đảo lớn nhỏ, nhiều eo biển, hồ, đầm lầy, kênh gạch ... Hơn nữa, Việt Nam nằm trong khu vực sinh thái nhiệt đới và có diện tích mặt nước lớn nên nguồn lợi thuỷ sản rất phong phú và đa dạng. Ngành thuỷ sản nước ta nói chung và xuất khẩu thuỷ sản nói riêng đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể, trở thành một trong những ngành xuất khẩu chủ lực của đất nước. Trong đó, mặt hàng cá tra, cá ba sa chiếm tỷ trọng khá lớn trong tổng lượng hàng thủy sản xuất khẩu . Tuy nhiên, việc tăng trưởng một cách nhanh chóng của các vùng nuôi trồng thủy sản nhưng không theo quy hoạch và các quy định về thực hành nuôi tốt (GAP) cũng như việc nuôi mật độ cao để gia tăng sản lượng dẫn đến môi trường nước bị ô nhiễm, dịch bệnh xảy ra. Khi đó, vấn đề thuốc và hoá chất để phòng và trị bệnh trở nên cần thiết và quan trọng. Bên cạnh những thuận lợi về trị và phòng chống dịch bệnh, dư lượng hóa chất, kháng sinh còn tồn lưu trong sản phẩm thuỷ sản rất có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng. Hiện nay xuất khẩu thuỷ sản nước ta đang gặp nhiều khó khăn do các rào cản kinh tế từ các thị trường nhập khẩu như Châu Âu (EU), Mỹ, Bắc Mỹ, Úc… đó là vấn đề dịch bệnh và tồn lưu dư luợng hóa chất - kháng sinh trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản…Sự kiện một số lớn container sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu từ Việt Nam bị từ chối ở thị trường Châu Âu, Mỹ, Canada,...trong thời gian qua do phát hiện có dư lượng hóa chất, kháng sinh đã gây ảnh hưởng không nhỏ cho ngành xuất khẩu thủy sản và đời sống người dân lao động nước ta. Crystial violet (CV) và Leuco crystal violet (LCV) là hai hóa chất trong nhiều loại hóa chất, kháng sinh đã bị các nước nhập khẩu như Liên minh Châu Âu và Canada phát hiện có trong sản phẩm cá tra/cá basa vượt mức giới hạn cho phép. Theo quy định của các thị trường EU, Mỹ và Bắc Mỹ đây là hai hoạt chất không được phép có trong sản phẩm thủy sản. Hai hoạt chất này cũng nằm trong Danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dung trong sản xuất kinh doanh thủy sản (Thông tư số 15/2009/TT-BNN , ngày 17 tháng 3 năm 2009 Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn). Tuy nhiên, Crystial violet & Leuco crystal violet vẫn còn lạm dụng tại các cơ sở sản xuất giống và nuôi thủy sản (đặc biệt tại các cơ sở sản xuất giống cá tra). Vấn đề đặt ra là phải xác định được hàm lượng Crystial violet & Leuco crystal violet trong sản phẩm thủy sản nuôi, đặc biệt là kiểm soát nguồn nguyên 1 liệu tại nhà máy chế biến thủy sản một cách nhanh chóng và hiệu quả. Phương pháp thử hấp thu miễn dịch dùng enzym liên kết (ELISA) được sử dụng để Xác định hàm lượng Crystial violet & Leuco crystal violet trong sản phẩm thủy sản có ưu điểm độ nhạy cao, xử lý mẫu đơn giản, cho kết quả nhanh chóng và đặc biệt đầu tư thiết bị tương đối rẻ tiền. Trên cơ sở đó, đề tài “Xác định hàm lượng Crystial violet & Leuco crystal violet trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp miễn dịch” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu của đề tài Xác định giá trị sử dụng của phương pháp “Xác định hàm lượng Crystal violet và Leuco Crystal violet trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp miễn dịch” trên nền mẫu cá tra theo các tiêu chí quy định trong Quyết định 657/2002/EC của Liên Minh Châu Âu. 1.3 Nội dung của đề tài Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp “Xác định hàm lượng Crystal violet và Leuco Crystal violet bằng phương pháp miễn dịch” trên nền mẫu cá Tra bằng kit thử của hãng Bioo Scientific. 1.4 Thời gian thực hiện: Từ tháng 1/2010 đến tháng 5/2010. 2 Phần 2 TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về đối tượng thủy sản làm nghiên cứu (cá tra) 2.1.1 Phân loại Theo hệ thống phân loại của G.V. Lindberg (1974), cá tra thuộc:lớp cá Pisces, Bộ cá Nheo Siluriforms, Họ cá Tra Pangasidae, Giống cá Tra Pangasius, Loài cá Tra Pangasisus hypophthalmus (Sauvage 1878). Tên tiếng Anh của cá tra: Shutchi Catfish. Tên khoa học: Pangasius hypophthalmus. 2.1.2 Đặc điểm Cá Tra là loại cá thuộc loại cá da trơn, sống vùng nước ngọt, phần đầu và phần thân chiếm phần lớn tỉ trọng cá Tra, trong đó phần thân có giá trị thương phẩm và kinh tế nhất. Cá có thể thích nghi trong điều kiện rất khắc nghiệt như: mật độ thả nuôi cao, chất lượng nước không đảm bảo. Là loài cá bản địa nên thích hợp với điều kiện tự nhiên ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL), vì thế quy mô diện tích nuôi rộng lớn. Cá Tra là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, dễ nuôi và đánh bắt nên có khả năng đưa vào chế biến với khối lượng và quy mô lớn. 2.1.3 Tình hình nuôi cá Tra ở ĐBSCL Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp-Phát triển nông thôn, tính đến ngày 14/8/2009, diện tích thả nuôi cá tra của 9 tỉnh ĐBSCL là 5.154ha, tăng 2,7 lần so với đầu năm 2009. Cũng đến giữa tháng 8, sản lượng cá tra thu hoạch toàn vùng là 457.000 tấn, gấp 8,2 lần so với đầu năm. Sản lượng cá thu hoạch trong 8 tháng đầu năm tăng liên tục với mức tăng bình quân là 13,5%/tháng. Cá tra hiện được nuôi nhiều nhất ở 3 tỉnh, thành Đồng Tháp, Cần Thơ và An Giang. Theo thống kê của Cục Hải Quan, hiện nay thị trường nhập khẩu cá tra lớn nhất của Việt Nam là Nga, Hoa Kỳ, Chi Lê, Pê-ru và các nước Đông Âu. Tổng sản lượng cá tra xuất khẩu 7 tháng qua là 326.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt hơn 737,1 triệu USD. Tuy sản lượng và giá trị xuất khẩu đều giảm so với cùng kỳ 2008 nhưng trong 3 tháng, từ tháng 5 đến tháng 7, sản lượng và giá trị xuất khẩu cá tra của Việt Nam đều tăng. 3 Theo dự báo của Hiệp Hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam, tình hình xuất khẩu cá tra những tháng cuối năm 2009 sẽ có triển vọng tốt hơn do xu hướng lên giá của đồng euro so với đồng USD, trong khi EU là thị trường xuất khẩu chính, chiếm gần một nửa kim ngạch xuất khẩu của cá tra. Hình 2.1:Biểu đồ diễn biến diện tích và sản lượng cá tra ở vùng ĐBSCL giai đoạn 1997-7T/2008 và quy hoạch đến năm 2020 (nguồn Dương Công Chinh, Đồng An Thụy,2009-TT. Nghiên cứu Môi trường & XLN-Viện Khoa học Thủy lợi miền Nam). 2.1.4 Tình hình sử dụng hóa chất và kháng sinh trong ao nuôi cá Tra Con cá Tra đang là mặt hàng xuất khẩu tiềm năng đối với ĐBSCL hiện nay, vì thế việc người dân mở rộng diện tích nuôi và thả cá với qui mô lớn là điều tất yếu. Mật độ thả cá cao, cho ăn, xử lý nước…không phù hợp dẫn đến việc sử dụng thuốc và kháng sinh trong quá trình xử lý nước và trị bệnh cho cá là điều không thể tránh khỏi. Mặc dù, ngày 17/3/2009 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ban hành DANH MỤC HOÁ CHẤT, KHÁNG SINH CẤM SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT, KINH DOANH THỦY SẢN (Thông tư số 15/2009/TTBNN) nhưng ở một số vùng nuôi vẫn còn tồn tại tình trạng người nuôi lạm 4 dụng hóa chất – kháng sinh cấm trong quá trình nuôi. Việc lạm dụng hóa chất – kháng sinh dẫn tới tồn lưu dư lượng trong sản phẩm thủy sản nói chung và cá Tra nói riêng, từ đó ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng các mặt hàng thủy sản cũng như cá Tra xuất khẩu, mặt khác cũng ảnh hưởng không nhỏ đến sức khỏe người tiêu dùng. Do đó, vấn đề đặt ra là kiểm soát được dư lượng hóa chất, kháng sinh sử dụng nhằm đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng và nâng cao chất lượng và uy tín của hàng thủy sản cũng như cá Tra trên thị trường Thế giới. 2.2 Giới thiệu về Crystial violet 2.2.1 Sơ lược về Crystial violet Crystal Violet (CV) (còn gọi là tím crystal) là chất thuộc họ Triphenylmethane có khả năng gây ung thư nên đã bị cấm sử dụng trong chăn nuôi ở một số quốc gia như Hoa Kỳ, New Zealand, EU… Tại Việt Nam, Crystal Violet là chất không có trong Danh mục thuốc thú y thủy sản, sản phẩm xử lý cải tạo môi trường trong nuôi trồng thủy sản được phép lưu hành tại Việt Nam. CV thường ở dạng bột mịn, có màu tím, hay dùng để nhuộm các nguyên vật liệu như da, sợi và giấy trong ngành sản xuất công nghiệp. Ngoài ra CV cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi khuẩn và bào tử của nó. Từ lâu, CV đươc xem là chất diệt nấm (loại saprolegnia ssp) và diệt kí sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa). Leuco Crystal violet(LCV) được sinh ra từ sự khử Crystal violet bởi các enzyme trong cá, một hợp chất chuyển hoá rất bền của CV. LCV được tích luỹ bên trong, tồn trữ lâu dài trong cơ thịt của cá. Tính chất vật lý và hóa học của CV/LCV: Hòa tan trong rượu, cloroform-tan, tan trong nước, không tan trong ête. Độ hòa tan trong nước: 16 g/L (25 ºC) 5 Hình 2.2 Công thức cấu tạo của CV Hình 2.3: Công thức cấu tạo của LCV 2.2.2 Các ứng dụng của Crystal violet 2.2.2.1 Trong công nghiệp Trong ngành công nghiệp CV hay dùng để nhuộm các nguyên vật liệu như da, tơ, sợi và giấy. Ngoài ra CV cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để làm dung dịch nhuộm vi khuẩn, và bào tử của nó. CV còn là chất được sử dụng như một loại thuốc thử trong ngành hóa phân tích. 2.2.2.2 Trong thủy sản Bản thân CV có khả năng sát trùng cho nên được sử dụng trong ngành thủy sản để xử lý nước và để sát nấm cũng như để sát kí sinh trùng ngoài da. Đó 6 là một loại thuốc trừ nấm rất công hiệu và thường được dùng để tẩy trùng trong các hồ gây cá giống và trong các mô hình nuôi trồng thủy sản. 2.2.3 Tác hại của Crystal violet Khi vào cơ thể cá, CV sẽ bị phân hủy thành chất chuyển hóa (metabolite) là LCV. Thời gian đào thải của CV nhanh, ngược lại chất LCV có thể tồn tại trong thời gian rất lâu trong thịt và nhất là trong mỡ của cá đã bị nhiễm CV. 2.2.3.1 Tác hại đối với con người Gần đây đã cho thấy rằng CV là rất độc đối với các tế bào động vật có vú và có liên quan trong vấn đề làm biến đổi tuyến giáp và ung thư gan. Điều này dẫn tới việc cấm sử dụng CV để điều trị cho cá và tôm. 2.2.3.2 Thiệt hại về kinh tế Nếu sản phẩm thủy sản xuất khẩu có chứa các lượng tồn dư chất độc hại và bị cấm sử dụng như CV thì toàn bộ lô hàng sẽ bị trả về và có thể bị nước sở tại kiện, dẫn đến những thiệt hại về kinh tế là không nhỏ. 2.2.4 Tình hình sử dụng Crystal violet 2.2.4.1 Tình hình sử dụng CV trên thế giới Trong các thập niên qua ngành nuôi trồng thủy sản trên thế giới có những bước tiến vượt bậc. Do việc áp dụng kĩ thuật nuôi mới, nuôi thâm canh mật độ cao để gia tăng năng suất, sản lượng, nạn dịch bùng phát, ô nhiễm môi trường làm cho thủy sản chết hàng loạt, vì thế người nuôi luôn tìm biện pháp khắc phục và việc sử dụng thuốc, hóa chất trong công việc phòng và trị bệnh là rất hữu hiệu. CV đã được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới trong ngành công nghiệp nuôi cá như một thuốc trừ nấm, thuốc trị ký sinh ngoài da và thuốc tẩy uế. 2.2.4.2 Tình hình sử dụng CV ở Việt Nam Sau khi hàng loạt lô hàng thủy sản của Việt Nam bị các nước nhập khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh cấm đã gây thiệt hại lớn về tài chính cũng như uy tín hàng thủy sản Việt Nam. Nhà nước và cơ quan chức năng ngành thủy sản Việt Nam đã đưa ra các qui định tương đối chặt chẽ về việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng cũng như chế biến thủy sản, nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng, ổn định và phát triển xuất khẩu. Tuy nhiên, việc chấp hành các qui định của nhà nước là chưa triệt để vì thỉnh thoảng vẫn còn một số lô hàng thủy sản Việt Nam xuất khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh 7 cấm hoặc vượt quá giới hạn đối với những kháng sinh cho phép sử dụng có giới hạn, trong chương trình kiểm soát dư lượng các chất độc hại trong thủy sản nuôi do Nafiqaved thực hiện năm 2003 và 2008 thỉnh thoảng vẫn phát hiện mẫu thủy sản nhiễm thuốc hoặc hoá chất bị cấm sử dụng, MG và CV là một điển hình. 2.2.5 Chất thay thế Crystal violet Để giải quyết tạm thời vấn đề cần phải có những chất khác thay thế CV/LCV trong công tác phòng trị bệnh trên các loài thủy sản. BRONOPOL là chất có tác dụng diệt kí sinh trùng trên cá thay thế CV. Đây là chất được EU cho phép sử dụng trị bệnh cho cá từ năm 2001 và không qui định giới hạn về dư lượng. Theo đánh giá của cơ quan bảo vệ Môi Trường Hoa Kì (EFA) thì Bronopol không là chất gây ung thư, có thể làm chất tẩy trùng, diệt khuẩn. Chất bronopol có công thức hóa học: C3H6BrNO4. Tên hóa học của chất này là 2-Bromo-2-Nitropropane-1,3-Diol. Bronopol được cung cấp ra thị trường với các tên thương mại như: Pyceze, Onyxide 500…. Nhằm mục tiêu phát triển xuất khẩu thủy sản ổn định trong thời gian tới, thiết nghĩ các hộ nuôi thủy sản cần tuân thủ nghiêm các qui định của nhà nước và các cơ quan chuyên môn trong việc sử dụng hóa chất và kháng sinh trong thủy sản để đảm bảo uy tín, chất lượng và giữ vững thương hiệu, đồng thời tránh ra các thiệt hại lớn về kinh tế do bị phát hiện có dư lượng cá hóa chất và kháng sinh có hại trong các lô hàng thủy sản xuất khẩu. (Sở Nông Nghiệp An Giang, 2/2/2005). 2.3 Giới thiệu về phương pháp thử hấp thu miễn dịch dùng enzym liên kết (ELISA) 2.3.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển Vào năm 1960, Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Berson Prior mô tả phương pháp miễn dịch có gắn chất phóng xạ (radioimmunoassay) dùng để xác định KN, KT. Trong phương pháp này, KT hay KN có gắn chất đánh dấu phóng xạ và sự hiện diện của chúng được xác định thông qua tín hiệu phóng xạ. Tuy vậy, các chất phóng xạ lại tiềm ẩn mối nguy hiểm vì vậy người ta nghĩ đến một phương pháp mới trong đó tín hiệu được phát ra không phải nhờ phóng xạ. Khi đó người ta đã biết rằng một số loại enzyme như các peroxidase phản ứng với một số cơ chất nhất định như Tetramethylbenzidine hay 3-ethylbenzthiazoline6-sulphonic acid sẽ phát màu. Màu sinh ra từ các phản ứng này có thể được sử dụng làm tín hiệu nhận biết (tín hiệu chỉ thị). Tuy nhiên, để tín hiệu này được sử dụng như chất phóng xạ trong radioimmunoassay, tín hiệu màu phát ra phải đồng nghĩa với sự có mặt của KT hay KN. Chính vì vậy, giải pháp được đưa ra là enzyme sẽ được gắn với KN 8 hay KT. Kỹ thuật gắn kết enzyme với KN hay KT được phát triển bởi Stratis Avrameas và G.B. Pierce2. Tiếp sau đó, vào năm 1966, Wide và Porath phát triển phương pháp gắn KN và KT trên bề mặt rắn (bề mặt của các vi phiếm hay các đĩa) nhờ đó mà KN hay KT không được gắn kết sẽ dễ dàng được rửa trôi . Peter Perlmann và Eva Engvall (Thụy Điển) cùng với nhóm Anton Schuurs và Bauke van Weemen (Hà Lan) công bố phương pháp được đặt tên ELISA (EIA) dựa trên tất cả những bước phát triển nói trên. Phương pháp chính thức ra đời vào năm 1971. 2.3.2 ELISA là gì? ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau: - Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt. - Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme. - Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. - Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa KN-KT. Sự hiện diện của phức hợp KN-KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu. Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một KT đặc hiệu cho KN chưa biết. Thông thường KN được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate). - Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa. - Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): KN được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra KT đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp KT-KN có thể sảy ra. 9 Nếu KT được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện KN cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng KT thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), KN cần xác định sẽ được nhận biết qua KT thứ cấp này. Giữa các bước của ELISA, các protein và các KT không đặc hiệu, KT không gắn với KN sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn KT liên kết với KN được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với KT trong phức hợp KTKN. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra. Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. 2.3.3 Phân loại 2.3.3.1 Dạng cạnh tranh Nguyên tắc chung: Kit phân tích dựa vào phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Nó dựa trên sự cạnh tranh giữa enzyme conjugate và dư lượng chất phân tích trong mẫu để gắn kết với kháng thể cố định trong well. Trong tiến trình phản ứng, mẫu và enzyme conjugate được tiêm vào well chứa kháng thể cố định. Nếu chất phân tích tồn tại trong mẫu nó sẽ cạnh tranh với enzyme conjugate để kết hợp với lượng kháng thể cố định trong well. Khi lượng chất phân tích đủ nó sẽ kết hợp hết với kháng thể. Vì thế, enzyme conjugate không kết hợp được với kháng thể và không phản ứng được với chất tạo màu. Đo cường độ màu để cho ra kết quả chính xác. 2.3.3.2 Dạng không cạnh tranh Nguyên tắc chung Chất phân tích được gắn cố định trong well. Khi cho mẫu và Antibody 1 vào well, chất phân tích có trong mẫu và chất phân tích cố định trong well sẽ cạnh tranh vị trí gắn với Antibody 1. Chất phân tích có trong mẫu được ưu tiên gắn với Antibody 1. Antibody 1 khi còn dư sẽ gắn với chất phân tích cố định trong well. Sau khi rửa, Antibody 1 gắn với chất phân tích có trong mẫu sẽ bị loại bỏ. Sau đó, cho Antibody 2 (enzyme conjugate) vào nó sẽ gắn kết với Antibody 1 còn lại trong well. Sau thao tác rửa, Antibody 2 nào không gắn kết được sẽ bị loại bỏ. Khi cho cơ chất tạo màu vào, Antibody 2 sẽ phản ứng với cơ 10 chất tạo màu. Sau khi cho chất dừng phản ứng, đo cường độ màu để cho kết quả chính xác. 2.3.4. Ứng dụng - Xác định nồng độ của KT trong huyết thanh. - Kiểm tra sự có mặt của KN. - Phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm. - Xác định sự có mặt của dược phẩm. - Xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học 2.3.5. Ưu khuyết điểm 2.3.5.1 Ưu điểm - Phương pháp xử lý mẫu nhanh. Có tính chọn lọc cao. - Chi phí thiết bị khá rẻ so với các phương pháp khác. 2.3.5.2 Khuyết điểm - Chi phí mua kit thử đắt. - Là phương pháp định lượng sàng lọc, khi mẫu dương thì phải khẳng định lại bằng phương pháp sắc ký. 2.4 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích (định lượng, có tính sàng lọc cho hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng) 2.4.1 Giải thích thuật ngữ Sai số Alpha (α) Là khả năng mẫu thật sự âm (compliant), cho dù kết quả thu được là dương (non-compliant). Trường hợp này gọi là mẫu dương tính giả (Fasle positive result). Sai số beta (β) Là khả năng mẫu thật sự dương (non-compliant), cho dù kết quả thu được là âm (compliant). Trường hợp này gọi là mẫu âm tính giả (Fasle negative result). Độ lặp lại (repeatability) Là giá trị đạt được khi tiến hành các thí nghiệm khác nhau trong cùng điều kiện. Độ tái lặp (within-lab reproducibility) 11 Là giá trị đạt được khi tiến hành các thí nghiệm khác nhau trong các điều kiện khác nhau trong cùng 1 phòng thí nghiệm. Độ thu hồi (recovery) Là tỷ lệ phần trăm của giá trị nồng độ chất phân tích đo được trên giá trị thực của chất phân tích. Độ ổn định (stability) Là giá trị đạt được khi tiến hành phân tích kiểm tra điều kiện bảo quản và thời gian bảo quản của thuốc thử, dung dịch chuẩn vv… Độ đặc hiệu (specificity) Là khả năng phân biệt của phương pháp giữa chất cần phân tích và các tạp chất (các chất gây nhiễu). Ruggedness Sự biến thiên của kết quả khi thay đổi các điều kiện thực nghiệm của phương pháp (The susceptibility of a method to minor changes in experimental conditions). Giới hạn quyết định (CCα) Là giới hạn nồng độ mà trên nồng độ đó sẽ quyết định mẫu không đạt với sai số α (=5%). Giới hạn phát hiện (CCβ) Là nồng độ nhỏ nhất của chất cần phân tích có trong mẫu mà phương pháp có thể phát hiện được với sai số β (=5%). Khoảng tuyến tính Là khoảng nồng độ mà cường độ của tín hiệu thu được tỉ lệ tuyến tính với nồng độ của chất phân tích. Mẫu trắng Là mẫu không chứa dư lượng của chất phân tích. Mẫu thêm chuẩn Là mẫu trắng được thêm chuẩn của chất phân tích vào. 2.4.2 Các thông số đánh giá Các thông số đánh giá trong quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp được thực hiện theo Quyết định 2002/657/EC ngày 12 tháng 08 năm 2002 của Liên Minh Châu Âu. 12