Tài liệu Ứng dụng của sắc ký lọc gel (GFC) trong phân tích thực phẩm - Báo cáo khoa học

HCM UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FACULTY OF CHEMICAL ENGINEERING BÁO CÁO KHOA HỌC ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM Đề tài: Ứng dụng của sắc ký gel (GF) trong phân tích thực phẩm Thực hiện: Nguyễn Văn Tú - PhD Student (51301915) TPHCM, 2017 NỘI DUNG 1 GIỚI THIỆU SẮC KÝ GEL 2 NGUYÊN LÝ SẮC KÝ GEL 3 PHÂN LOẠI GEL 4 ỨNG DỤNG SẮC KÝ GEL 2 GIỚI THIỆU SẮC KÝ GEL Sắc kí gel dùng để tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước của các phân tử. Những phân tử không bị giữ lại bằng liên kết hóa học nên thành phần của dung môi giải li (buffer) không ảnh hưởng trực tiếp đến độ giải li (resolution). 3 GIỚI THIỆU SẮC KÝ GEL Thường được sử dụng để tinh chế proteins, enzymes, polysaccharides, nucleic acids và các đại phân tử trong lĩnh vực sinh học. 4 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng này được phủ đầy dung môi dùng làm pha động. 5 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL 6 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL - Gel được nhồi vào cột tạo thành đệm, đệm là mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu bền vật lý, bền hóa học và trơ. Lớp gel cân bằng với dung dịch đi qua và dung dịch điền đầy vào mạng lưới lỗ xốp và khoảng không giữa các hạt. - Chất lỏng bên trong lỗ xốp được xem là pha tĩnh, chất lỏng bên ngoài lỗ xốp là pha động. - Mẫu được đưa vào cột, Pha động kéo mẫu di chuyển qua cột. - Phân tử khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp, những phân tử nhỏ đi vào sâu trong lỗ xốp và bị giữ lại trong cột lâu hơn. - Pha động qua cột liên tục, các phân tử lớn không thể chui vào các lỗ xốp nên sẽ đi ra khỏi cột trước. Những phân tử nhỏ khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp nên ra khỏi cột sau. 7 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL 8 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL Kết quả của quá trình sắc kí gel thường được biểu diễn trên giản đồ giải li hay phổ đồ sắc ký cho thấy sự khác nhau về nồng độ (liên quan đến mức độ hấp thu tia UV ở vùng 280 nm) của các thành phần trong mẫu khi chúng được giải li khỏi cột dựa trên trật tự về kích thước phân tử. Trên giản đồ chia ra làm 3 loại phân tử. Những phân tử không vào mạng lưới đệm mà được giải li thẳng ra khỏi cột với cùng tốc độ cùa dòng lưu chất của pha động (buffer) ở thể tích Vo (xét trên 1 đơn vị thể tích cột), gọi là thể tích khoảng trống (void volume). Những phân tử có một phần đi vào mạng lưới đệm silicagel, rồi mới giải li ra khỏi cột theo trật tự kích thước nhỏ hơn sẽ ra trước. Và còn lại là những phân tử được giữ hoàn toàn trong mạng lưới lỗ xốp và đi ra khỏi cột trước giá trị tổng thể tích cột Vt (total column volume) của pha động đi qua cột. 9 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL Trạng thái của mỗi cấu tử được biểu diễn liên quan đến thể tích giải li của chúng được đo trực tiếp từ phổ đồ sắc ký. Có 3 cách: Cách xác định thể tích Ve (elution volume) trên sắc ký đồ: Khi thể tích của mẫu quá nhỏ so với thể tích rửa giải (Ve) thì Ve được xác định từ vị trí ban đầu đến vị trí cao nhất 10 của mũi sắc ký NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL Khi thể tích của mẫu lớn không thể bỏ qua so với thể tích rửa giải (Ve) thì Ve được xác định từ vị trí ½ thể tích mẫu đến vị trí cao nhất của mũi sắc ký. 11 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL Khi thể tích của mẫu quá lớn tạo nên mũi sắc ký có vùng phẳng ngang, thể tích Ve được xác định từ vị trí ban đầu của mẫu đến vị trí của điểm uốn ở phần đang tăng lên của mũi giải li. 12 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL K av Kd  Ve  Vo  Vt  Vo Ve  Vo Ve  Vo  Vi Vt  Vo  V gelmatrix 13 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL K av Kd  Ve  Vo  Vt  Vo Ve  Vo Ve  Vo  Vi Vt  Vo  V gelmatrix - Vo là thể tích khoảng trống, cột được nhồi tốt thì thể tích Vo xấp xỉ 30% thể tích cột. - Vi là thể tích pha động bên trong mạng lưới, trong thực tế Vi rất khó xác định do phải xác định thể tích mạng lưới gel, do đó để thuận tiện thì Vi= Vt-Vo. 14 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL Đường cong chọn lọc và lựa chọn phương pháp 15 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL Đường cong chọn lọc và lựa chọn phương pháp - Hệ số phân bố Kav liên quan đến kích thước của phân tử. Tỷ trọng và kích thước giống nhau của các phân tử mô tả mối quan hệ giữa giá trị Kav và logMr . - Bằng cách vẽ đường cong đi qua những điểm giá trị Kav ứng với logMr của các protein chuẩn có thể xây dựng được đường cong chọn lọc. - Phương pháp lọc gel được chọn lựa sao cho khối lượng phân tử lớn được giải li ở thể tích khoảng trống Vo với mũi giãn rộng ít nhất và thời gian là tối thiểu. - Những hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ nhất được giải li gần giá trị Vt 16 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL Độ phân giải (độ giải li) uf 17 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL Độ phân giải (độ giải li) Độ giải li là độ phân tách giữa các peak, chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: tỷ lệ thể tích mẫu với thể tích cột, tốc độ chảy, kích thước cột, kích thước hạt gel, độ phân bố kích thước hạt gel, tỷ trọng cột nhồi, độ xốp của hạt và độ nhớt của pha động. Thành công của phương pháp phân tích sắc ký gel lựa chọn điều kiện sao cho độ chọn lọc cao và khống chế sự của ngoại cảnh trong quá trình tách. Vr1 và Vr2 là thể tích lưu chất ra khỏi cột của 2 peak liền kề tính ở tâm peak W1 và W2 độ rộng của các peak (Vr2 – Vr1) là khoảng cách giữa các peak và 1/2 (W1 + W2) độ rộng trung bình của các peak 18 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL Độ phân giải 19 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL Độ phân giải Phân tách với độ giải li cao (High resolution fractionation): Phân tách nhiều cấu tử trong một mẫu dựa trên sự khác nhau về kích thước. Mục đích là phân lập một hoặc nhiều cấu tử để xác định khối lượng phân tử hoặc phân tích sự phân bố khối lượng phân tử. 20