Tài liệu Ứng dụng của sắc ký bản mỏng (TLC) trong phân tích thực phẩm - Báo cáo khoa học

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TPHCM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC --&&&-- BÁO CÁO ỨNG DỤNG SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM Đề tài: Ứng dụng của sắc ký bản mỏng (TLC) trong phân tích thực phẩm GVHD: TS. Nguyễn Thị Lan Phi Ho Chi Minh City, 2016 TABLE OF CONTENTS MỞ ĐẦU....................................................................................................................................................3 NỘI DUNG................................................................................................................................................4 1. TỔNG QUAN VỀ LÝ THUYẾT SẮC KÍ LỚP MỎNG [2]............................................................4 1.1. HIỆU QUẢ PHÂN TÁCH (separation efficiency)...................................................................4 1.2. HỆ SỐ PHÂN BỐ.......................................................................................................................5 1.3. HỆ SỐ LƯU................................................................................................................................6 1.4. HỆ SỐ CHỨA.............................................................................................................................7 1.5. NĂNG SUẤT VẾT CHẤM ( CHỈ SỐ PHÂN TÁCH)..............................................................7 1.6. CHIỀU CAO ĐĨA.......................................................................................................................8 1.7. ĐỘ PHÂN GIẢI..........................................................................................................................9 II. ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ LỚP MỎNG TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM....................10 2.1. KỸ THUẬT SẮC KÍ.................................................................................................................10 2.1.1 Chuẩn bị mẫu......................................................................................................................10 2.1.2. Chấm mẫu..........................................................................................................................12 2.1.3. Bản mỏng và pha động......................................................................................................12 2.1.4. Khai triển với dung môi....................................................................................................12 2.1.5. Phát hiện vết.......................................................................................................................14 2.1.6. Định lượng bằng đo mật độ quang...................................................................................14 2.2. ỨNG DỤNG CỦA TLC TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM............................................14 2.2.2.Đường trong thức uống [1].................................................................................................15 2.2.3. Phân tích amino acid [3,6].................................................................................................15 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................................................19 2 MỞ ĐẦU Sắc ký lớp mỏng (TLC) được dùng trong phòng thí nghiệm trên sắc kí khí cho phân tích thực phẩm và quản lý chất lượng. Nhiều ứng dụng của TLC đã được báo cáo trong phân tích thành phần thực phẩm, phụ gia, chất nhiễm bẩn, và định lượng amino acid (chất lượng của protein), lipid và các acid béo ( chất lượng và sự pha trộn của chất béo, đường (chất lượng của thức uống), các amine có nguồn gốc sinh học (độ ổn định tồn trữ), vitamin (được thêm vào như những chất dinh dưỡng, màu và chất chống oxi hóa) và các acid hữu cơ (như chất bảo quản). TLC được dùng rộng rãi để phân tích các sản phẩm nông nghiệp. HPTLC (sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao) là một phương pháp định lượng hiệu quả được thực hiện trên lớp mỏng được cấu tạo từ các hạt có đường kính nhỏ hơn (5m so với các hạt đường kính 20 m của sắc kí lớp mỏng truyền thống). Sự phân phối kích thước hạt thì hẹp hơn, lớp mỏng thì mỏng hơn và khoảng cách khai triển thì ngắn hơn. Kết quả là dẫn đến khả năng phân tách nhanh, hiệu quả phân tách cao và cải thiện giới hạn phát hiện. HPTLC định lượng bằng máy quét đo mật độ quang có thể cho kết quả có thể so sánh được với GC, HPLC. TLC có nhiều lợi điểm sau: - Thao tác phân tích đơn giản, cần ít thiết bị - Các thuốc thử có độ chọn lọc và độ nhạy cao được dùng để phát hiện các hợp chất mà không bị ảnh hưởng bởi pha động -Khả năng lặp lại các kết quả định tính và định lượng cao ngay cả khi các thông số được thay đổi bởi vì các phân đoạn đại diện cho mẫu đều được hiện trên bản mỏng -Chi phí thấp do có nhiều mẫu chỉ cần sử dụng một bản mỏng và ít dung môi khai triển. Một nghiên cứu [5] so sánh chi phí của phương pháp đa dẫn xuất HPLC và phương pháp kết hợp dùng TLC trước sau đó là HPLC để định lượng sulfonamides trong các sản phẩm thịt. Kết quả cho thấy, mẫu được xác định nhiễm bẩn bằng TLC trước, sau đó được khẳng định lai lần nữa bằng HPLC cho chi phí chiếm khoảng 20% so với HPLC đa dẫn xuất. 3 NỘI DUNG 1. TỔNG QUAN VỀ LÝ THUYẾT SẮC KÍ LỚP MỎNG [2] Sắc ký là phương pháp hóa lý dùng để tách hỗn hợp chất mà trong đó các thành phần hỗn hợp được phân bố vào pha tĩnh và pha động. Sắc ký bản mỏng là loại sắc kí mà trong đó pha tĩnh được trải trên bề mặt phẳng. TLC là phương pháp quan trọng để phân tích nhanh hỗn hợp đơn giản với chi phí thấp. Độ phân giải tốt nhất đạt được khi Rf là 0.25, ứng với hệ số chứa bằng 3 là khoảng tốt nhất trong sắc kí cột. 1.1. HIỆU QUẢ PHÂN TÁCH (separation efficiency) Dung môi trong TLC di chuyển bằng lực mao quản được mô tả bằng : Trong đó: Zf: Khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ vị trí chấm mẫu hằng số tốc độ, hằng số tốc độ này phụ thuộc vào mức độ bão hòa của pha hơi tiếp xúc với pha tĩnh. Hằng số này cũng liên quan đến tính chất của pha tĩnh và pha động qua phương trình: Ko: hằng số thẩm thấu Dp: đường kính hạt trung bình : sức căng bề mặt của pha động : độ nhớt của pha động : là góc tiếp xúc Nếu giả sử với kích thước hạt đồng nhất, hằng số tốc độ tăng tuyến tính với kích thước trung bình của hạt , hạt càng thô thì tốc độ dung môi càng lớn. Hằng số tốc độ còn phụ thuộc tuyến tính vào tỉ lệ sức căng bề mặt với độ nhớt. Dung môi giúp tăng tối đa tỉ lệ 4 này sẽ được ưa dùng trong TLC. Với pha tĩnh là silicagel, thì góc tiếp xúc cho hầu hết các dung môi thì gần bằng 0 với dung môi được thấm ướt hoàn toàn. Với pha đảo thì góc tiếp xúc của dung môi tăng nhanh với sự tăng nồng độ nước trong pha động. Ở nồng độ nước 30-40%, cos thì nhỏ hơn 0.2-0.3. Pha động hầu như không thể đi lên bản mỏng, khi đó TLC không thể thực hiện được. Để tăng khả năng của dung môi, bản mỏng pha đảo hiện đại được chuẩn bị với kích thước hạt lớn hơn (10-15m) hoặc cải thiện chất hấp phụ trên pha tĩnh. Những chất hấp phụ có chứa liên kết phân cực như 3-aminopropylsilanized và 3-cyanopropylsilanized được thấm ướt bởi hầu hết dung môi bao gồm cả nước. Thông thường, pha động có độ nhớt và sức căng bề mặt cao sẽ di chuyển chậm, vì vậy, cần phản trộn dung môi có hằng số di chuyển thấp với dung môi có hằng số di chuyển cao nhưng phải bảo đảm chúng hòa tan lẫn nhau và có độ phân cực phù hợp Vận tốc pha động cho những hạt có kích thước mịn giảm nhanh theo khoảng cách di chuyển, và khi đó sẽ gây ra sự lan rộng của chấm mẫu. Hạt có kích thước thô có khả năng thẩm thấu tốt hơn so với hạt có kích thước mịn, và vì vậy, vận tốc và hiệu quả dung môi sẽ tăng khi tăng chiều dài của mỏng. Với hạt có kích thước mịn, chiều dài bản mỏng dài từ 5-7 cm, với số đĩa lý thuyết khoảng 5000 đĩa. Đối với hạt có kích thước thô đường kính 15m, để đạt được số đĩa lý thuyết tương tự khoảng 5000 đĩa thì chiều dài bản mỏng phải cần 15 cm. Khi chiều dài bản mỏng đủ dài, thì hiệu năng tách giữa TLC và HPTLC không có sự khác nhau. 1.2. HỆ SỐ PHÂN BỐ Trong hệ thống sắc ký, pha động di chuyển qua pha tĩnh thì các cấu tử mẫu sẽ phân bố giữa 2 pha động và tĩnh, khi đó sẽ gây ra sự phân bố khác nhau giữa các cấu tử vào 2 pha tùy thuộc vào khả năng hấp phụ trên pha tĩnh. Quá trình hấp phụ, khử hấp xảy ra liên tục khi cấu tử di chuyển qua pha tĩnh, và tỉ lệ nồng độ cân bằng trong pha tĩnh trên nồng độ cân bằng trong pha động được mô tả bằng hằng số phân bố Ka và được mô tả bằng phương trình Cs: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh CM: nồng độ cấu tử trong pha động 5 Tỉ lệ này điều khiển tốc độ di chuyển của cấu tử, một cấu tử có Ka lớn sẽ có ái lực lớn với pha tĩnh và sẽ di chuyển chậm qua bản mỏng. Vì vậy, khi hỗn hợp chứa 2 chất A và B, thì nếu A có Ka lớn hơn sẽ di chuyển chậm chậm hơn. Trong trường hợp lí tưởng, thì tỉ lệ giữa Cs và CM là hệ số tuyến tính, tuy nhiên nếu nồng độ của mẫu chấm trên bản mỏng quá lớn thì khi đó tỉ lệ này không còn tuyến tính nữa. Nồng độ mẫu quá lớn có thể làm tăng nhẹ Rf và gây ra hiện tượng kéo đuôi ảnh hưởng đến độ phân tách 1.3. HỆ SỐ LƯU Vị trí của bất kì chấm mẫu nào trên TLC được mô tả bằng hệ số lưu R f, Rf là nền tảng định tính và được mô tả bằng: Rf= Khoảng cách di chuyển của chất phân tích (Zs) /khoảng cách di chuyển của dung môi (Zf) Rf có giá trị nằm trong khoảng [0,1] Đôi khi hệ số lưu được biểu diễn bằng Rf x 100. Sự lặp lại giá trị của Rf dựa trên nhiều yếu tố, như chất lượng của chất hấp phụ, độ ẩm, chiều dày pha tĩnh, khoảng cách khai triển, và nhiệt độ môi trường. Khi nồng độ mẫu quá lớn thì làm tăng nhẹ giá trị R f. Để đạt được Rf đúng thì cần đảm bảo không có bất cứ sự thay đổi nào xảy ra trong quá trình phân tách, pha động không được thất thoát và vị trí đường dung môi khai triển (solvent front) không được sai số. Trong sắc kí bản mỏng truyền thống và đặc biệt là trong sắc kí bản mỏng được khai triển nhiều lần thì khi đó đường chạy của dung môi sẽ không đo được, khi đó thông số R x sẽ được sử dụng, Rx được mô tả bằng phương trình: Rx= Khoảng cách di chuyển của chất phân tích /khoảng cách di chuyển của chất chuẩn Không giống như Rf, Rx có thể lớn hơn 1. Cần lưu ý rằng cả Rf hay Rx thì không phài là một hằng số, nhưng Rx có độ lặp lại cao hơn so với Rf và được ưa dùng khi phân tích định tính Phương pháp tốt nhất để định tính một hợp chất là chấm mẫu và một loạt các chất chuẩn trên cùng bản sắc ký. Khi đó, sự di chuyển các chất được so sánh trong cùng một điều 6 kiện thí nghiệm và giá trị của mẫu và chuẩn được dùng cho việc định tính. Điều kiện thí nghiệm nên được chọn sao cho Rf của cấu tử cần xác định khoảng 0.5 (cấu tử nằm khoảng giữa bản), nếu giá trị của Rf trên silicagel cao hơn giá trị mong muốn thì cần giảm độ phân cực của pha động. Với giá trị của Rf quá thấp thì cần tăng sự phân cực của pha động. 1.4. HỆ SỐ CHỨA Hệ số chứa của một chất được định nghĩa như là tỉ lệ giữa thời gian lưu trong pha tĩnh và thời gian lưu trong pha động Đây là công thức nền tảng và đơn giản nhất cho sắc kí định tính. Việc đo hệ số chứa sẽ giúp xác định việc dịch chuyển thời gian lưu là do pha tĩnh (hệ số chứa thay đổi khi thời gian lưu thay đổi) hay do pha tĩnh (hệ số chứa vẫn là hằng số khi thời gian lưu thay đổi) Hệ số chứa liên quan với Rf bởi công thức: Hệ số chứa k có thể được mô tả bằng tổng số mol của chất phân tích trong mỗi pha. Hệ số chứa được điều khiển bởi độ mạnh của pha động, bản chất của pha tĩnh, và nhiệt độ khi quá trình phân tách được thực hiện. Nếu một chất không di chuyển, có nghĩa là không có một chất nào được phát hiện trong pha động, khi đó Rf sẽ bằng 0. Nếu thời gian lưu trong pha động bằng với thời gian lưu trong pha tĩnh khi đó k=ts/tm=1. Nếu hệ số lưu k <1 thì khi đó chất phân tích sẽ di chuyển quá nhanh và khi đó việc xác định chính xác thời gian lưu sẽ rất khó. Nếu hệ số chứa lớn (>20) thì có nghĩa sự rửa giải cần thời gian quá lâu. Thông thường, một cách lý tưởng, hệ số chứa nằm giữa 1 và 5 1.5. NĂNG SUẤT VẾT CHẤM ( CHỈ SỐ PHÂN TÁCH) Chỉ số phân tách được định nghĩa là số tối đa các chất phân tích mà có thể phân tách hoàn toàn giữa Rf=0 và Rf=1. Trong sắc kí định tính, chỉ số phân tách được định nghĩa là số chất tối đa có thể phân tách được nằm giữa k=0 và k=10. Hai chất được phân tách hoàn toàn khi khoảng cách giữa 2 peak là lớn nhất. 7 Chỉ số phân tách được xác định bằng: Zf: khoảng cách di chuyển của dung môi Bo: bề rộng ngoại suy của vết chấm ở Rf=0 B1: bề rộng ngoại suy của vết chấm ở Rf=1 1.6. CHIỀU CAO ĐĨA Đại lượng phổ biến nhất để đo hiệu năng của hệ thống sắc kí là số đĩa, số đĩa lý thuyết được tính bằng Zf: đường di chuyển của pha động Zs: đường di chuyển của chất Ws: bề rộng của vết chấm sắc kí N cũng có thể được tính theo công thức: Số đĩa lý thuyết này chỉ dùng để xác định hiệu năng cột cho những chất khác nhau trên cùng một đĩa, số đĩa lý thuyết này sẽ rất khác trên các loại đĩa khác nhau. Vì vậy, N có thể xem như một cách đo hiệu năng tách của các đĩa sắc kí. N tỉ lệ với chiều dài di chuyển của pha động Zf. Khi tỉ số Zs/Ws là một hằng số, tăng Zf làm tăng N và hiệu quả phân tách tốt hơn H là giá trị chiều cao tương đương cảu đĩa lý thuyết 8 Hình 1.1: Tính số đĩa lý thuyết Mục đích chính để tăng hiệu năng của sắc kí lớp mỏng là giảm H và tăng N, vì vậy cần giảm kích thước pha tĩnh, giảm tốc độ di chuyển của pha động, giảm độ nhớt pha động, và pha6nt ử của chất hòa tan nhỏ hơn. Sự ảnh hưởng của các thông số này biễu diễn qua phương trình Van Demeter u: tốc độ dòng pha động A, B, C, D là hằng số của phương trình, trong đó: A: ảnh hưởng của khuếch tán Eddy và truyển khối trên pha động B: thể hiện khuếch tán của phân tử C, D: ảnh hưởng của truyền khối trên pha động và tĩnh Hệ số A, B, C, D phụ thuộc chủ yếu vào thông số hạt, bản chất của chất hòa tan và pha động và nhiệt độ của hệ thống sắc kí 1.7. ĐỘ PHÂN GIẢI Mục đích chính của sắc ký là tách các thành phần trong hỗn hợp. Hệ số phân tách giữa 2 vết trên bản mỏng được xác định bằng: 9 Hình 1.2: Độ phân giải của 2 vết sắc kí trên bản mỏng II. ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ LỚP MỎNG TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM 2.1. KỸ THUẬT SẮC KÍ 2.1.1 Chuẩn bị mẫu Bước chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị mẫu dùng cho chạy HPLC, GC. Tuy nhiên, bước chuẩn bị mẫu đơn giản hơn do lớp mỏng của TLC chỉ dùng 1 lần, thậm chí có một số mẫu có thể chấm trực tiếp trên bản mỏng hoặc chỉ cần pha loãng với dung môi rồi chấm trên bản mỏng. Lợi điểm khác của TLC trong quá trình chuẩn bị mẫu là mẫu ít khi cần phải tạo dẫn xuất như mẫu chuẩn bị cho HPLC (đặc biệt là mẫu dùng cho GC) ngoại trừ kkhi phân amino acid trong protein hay phân tích đường trong tinh bột thì cần thủy phân mẫu bằng enzyme, acid hoặc base. Mẫu có thể được chuẩn bị bằng các phương pháp sau: Chiết bằng dung môi : Là sự phân tách cấu tử từ pha lỏng này sang một pha lỏng khác dựa vào khả năng hòa tan của cấu tử vào 2 pha lỏng không trộn lẫn vào nhau, thường là giữa pha nước và pha hữu cơ. Trích bằng dung môi thường dùng để phân tách hỗn hợp, hoặc tách cấu tử ra khỏi hỗn hợp, hoặc làm giàu hợp chất. Tính solvate hóa của CO2 siêu tới hạn có thể cải thiện bằng cách thêm ethanol, tuy nhiên sau khi đuổi CO2 nhận thấy có sự tồn dư của ethanol lama ảnh hưởng đến ‘sạch” của mẫu 10 Trích bằng phương pháp siêu tới hạn (SFE) [5] Phương pháp thường dùng để tách các chất phân tích ra khỏi nền mẫu. Yêu cầu của quá trình trích ly: - Nhanh, đơn giản, ít tốn kém -Chất cần phân tích không bị phân hủy và không bị mất đi trong quá trình trích ly -Cho nồng độ chất cần phân tích đủ đậm đặc cho quá trình định lượng tiếp theo - Quá trình trích ly cần cho ít chất thải Vì vậy, kỹ thuật chiết tách bằng dung môi siêu tới hạn ra đời, trong đó quan trọng nhất là ứng dụng CO2 siêu tới hạn trong trích ly. Tỷ trọng của CO2 siêu tới hạn ở khoảng áp suất 200 bar thì gần với hexane, và đặc tính solvate hóa cũng giống với hexane, và hoạt động như dung môi không phân cực. Ưu điểm của phương pháp là chỉ cần một sự thay đổi nhỏ trong áp suất, nhiệt độ thì sẽ phá vỡ tính siêu tới hạn của CO2 và các chất cần phân tích sẽ chuyển từ trạng thái hòa tan sang lỏng hoặc rắn và không có dấu vết của dung môi còn sót lại. - Trích pha rắn (SPE) [4], Nguyên tắc của SPE thì giống với trích ly lỏng -lỏng, bao gồm sự phân bố chất phân tích vào 2 pha. Tuy nhiên, thay vì 2 pha lỏng không hòa tan vào nhau, SPE bao gồm sự phân phối giữa một pha lỏng (hệ mẫu và dung môi) với một pha rắn. Trong đó, chất cần phân tích sẽ hấp phụ hoặc hấp thụ lên trên pha rắn, sau đó cột SPE sẽ được rửa giải với dung môi để loại các chất không gắn lên cột. Sau cùng, cột được rửa giải để thu chất cần phân tích. Cơ chế hấp phụ hoặc hấp thụ của chất phân tích lên SPE chủ yếu là do lực VanderWaals (tương tác không phân cực), liên kết Hydro, tương tác lưỡng cực, tương tác giữa cation và anion. 11 2.1.2. Chấm mẫu Mẫu với thể tích nl và l được chấm lên bản mỏng bằng micropipette. Việc chấm lên bản mỏng là vấn đề quan trọng để cho kết quả định lượng được đúng và chính xác. 2.1.3. Bản mỏng và pha động Lớp mỏng bao gồm nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion được dùng trong phân tích thực phẩm. Tuy nhiên, đa số sự phân tách được thực hiện trên sắc kí pha thuận với bản mỏng được phủ silicagel, alumina và cellulose. Sắc kí pha đảo thường thực hiện trên C18, C2, C8 và bản mỏng có diphenyl Lớp mỏng được tẩm bột bắp, bột gạo, talc…dùng để định lượng mật độ quang của acid hữu cơ, carbohydrate, vitamin tan trong dầu, amino acid và anthocyanin trong thực phẩm. Lớp mỏng chứa liên kết diol ưa nước (sắc kí điều chế) được dùng để định tính và định lượng đo mật độ quang của 2-hydroxycinnamaldehyde trong hạnh nhân. Việc tẩm lên đĩa thuốc thử cũng làm tăng độ phân giải cho một số hợp chất nhất định. Ví dụ như việc định lượng mật độ quang trên lớp mỏng silicagel có tẩm ion Ag+ dùng để xác định petroselinic, cis-vaccenic, oleic acid phenacyl esters trong dầu hạt Umbelliferae [19] Để có kết quả tốt, đĩa thường được làm sạch bằng cách rửa với một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi trước khi dùng. Để thực hiện, có thể cho bản mỏng khai triển với dung môi dichloromethane-methanol (1:1) hoặc nhúng bản mỏng vào methanol 2.1.4. Khai triển với dung môi 12 TLC thường được triển khai dưới tác dụng của trọng lực và đơn dung môi trong bình bão hòa hơi dung môi. Ngoài ra còn có các kỹ thuật khác như: - Triển khai nhiều lần 1 chiều với một hoặc nhiều pha động có thể làm tăng độ phân giải. Lấy ví dụ như cyanogenic glycoside linamarin có thể được định lượng bằng HPTLC trên silicagel bằng cách triển khai 2 lần : lần 1 với hỗn hợp dung môi ethyl acetate–acetone– water (4:5:1) đến 3 cm, lần 2 triển khai với hỗn hợp dung môi ethyl acetate–formic acid– water (6:1:1) đến 8.5 cm, sau đó được phát hiện với thuốc thử aniline diphenylamine– phosphoric acid và đo mật độ quang ở bước sóng 525 nm [24] - Khai triển nhiều lần tự động (AMD): kỹ thuật này thường được dùng trong HPTLC. Trong kỹ thuật này, có sự thay đổi gradient dung môi từ 20-25 bước cho hỗn hợp dung môi có độ rửa giải từ mạnh tới yếu Nguyên tắc của AMD: - Đĩa HPTLC được khai triển lặp lại nhiều lần cùng 1 chiều - việc khai triển dung môi nhiều lần kéo khoảng cách di chuyển của dung môi dài hơn trước đó -Giữa các lần khai triển, dung môi được đuổi hoàn toàn khỏi buồng khai triển và lớp mỏng được sấy khô dưới áp suất chân không -với sự kết hợp giữa hiệu ứng tập trung và rửa giải gradient cho các vệt sắc kí hẹp hơn (khoảng 1mm). Điều này có nghĩa với khoảng cách phân tách 80 mm, có thể có tới 40 cấu tử được phân tách 13 - Khai triển 2 chiều: làm tăng sự phân giải của hỗn hợp phúc tạp bằng cách khai triển dung môi theo 2 chiều vuông góc nhau. - Khai triển cưỡng bức (OPLC) : lớp mỏng được kẹp giữa một đĩa cứng và một màng membrane linh động, dung môi được qua lớp mỏng dưới tác dung của bơm hút. OPLC cho dung tích điểm chấm lớn, thới gian khai triển nhanh, và trong quá trình có thể sử dụng gradient dung môi. 2.1.5. Phát hiện vết Nhiều vết sắc kí không thể thấy dưới ánh sáng tự nhiên hay huỳnh quang tự nhiên mà được hiện màu bằng cách chiếu UV hoặc phun thuốc thử 2.1.6. Định lượng bằng đo mật độ quang Phân tích định lượng được thực hiện đồng thời bằng cách đo cùng lúc mật độ quang của mẫu và của chuẩn trên bản mỏng bằng công cụ quét ảnh, hoặc video hoặc camera CCD. Máy quét đo mật độ quang - Đo độ phản xạ ngay trong chế độ huỳnh quang - hình dạng vật thể tới 20x20 cm -Khoảng bước sóng từ 190-900nm - Sử dụng đèn deuterium, halogen-tungsten, đèn thủy ngân cao áp Hình: máy quét đo mật độ quang - Tốc độ quét: 1–100 mm/s 2.2. ỨNG DỤNG CỦA TLC TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM 2.2.1. Phân tích lipid (neutral lipid) trong trứng [1] Điều chế mẫu: trích lòng đỏ trứng với chloroform- methanol ( 2: 1) Lớp mỏng: silicagel HPTLC ( silicagel có tính acid yếu, và là chất hấp phụ phân cực) Pha động: petroleum nhẹ (có Tos=37.5-52oC) –diethyl ether–acetic acid (80:20:2) để xác định cholesterol, triacylglycerols, và các acid béo tự do. Thuốc thử : PMA (5% trong ethanol), đốt nóng ở 100-120oC, trong 5-10 phút 14 Định lượng: máy quét mật độ quang ở 700nm [172] 2.2.2.Đường trong thức uống [1] Điều chế mẫu: sodas và iced teas được pha loãng với ethanol–nước(7:3), sau đó chấm trực tiếp lên bản mỏng Lớp mỏng: HPTLC silicagel được phun xịt sodium hydrogen sulfite, đệm citrate với pH=4.8 Pha động: khai triển 7 cm với acetonitrile–water (85:15). Hiện màu: tím với thuốc thử 1-napthol (5g) –ethanol (160mL)-sulfuric acid (20ml)-nước (13ml), được đun nóng ở 110oC trong 5-10 phút Định lượng: đo mật độ quang ở 515nm, độ hồi phục của glucose, fructose, scrose là 94% và RSD là 2,5% [179]. 2.2.3. Phân tích amino acid [3,6] Amino acid là thành phần cấu tạo của protein. Amino acid được dùng nhiều trong các sản phẩm công nghiệp như trong công nghệ thực phẩm làm chất tăng mùi cũng như dùng trong sản xuất các loại nhựa phân huỷ sinh học, thuốc và các xúc tac có tính triền quang. Định lượng các amino acid là vấn đề quan trọng do nó làm sáng tỏ một số bất thường liên quan đến sự trao đổi chất. Trích ly mẫu: Amino acid thường được trích với : 5% NaCl dung dịch, 75% ethyl alcohol, 0.25% NaOH, 0.25M HCl, metasiliconic acid hay hỗn hợp CH3COOH : HCl : H2O (18:1:1 v:v:v). Hodisan và cộng sự [6] trích 0.5g thực vật trong 1% HCl. Protein sau đó được loại khỏ dịch chiết bằng cách kết tủa với dung dịch Na3P(W3O10)4 . Sau khi ly tâm, dung dịch được cho qua cột trao đổi ion Amberlite IR 120H. Cột được rửa giải với dung dịch NH3 10%. Dung dịch thu được cho hoá hơi tới cắn và hoà tan trong dung dịch nước iso-propanol 30% (v:v). Chất phân tích L-tryptophan Pha tĩnh Silica gel Dung môi rửa giải 2-propanol-25% NH3 (7:3) 15 Ghi chú Định lượng L-tryptophan trong nước thịt luộc lên men . Hiện màu amino acid bằng cách nhúng bản mỏng vao dung dịch chứa 300mg ninhydrin trong acetone: acid acetic =97:3. Phát hiện L-tryptophan bằng cách xử lý với 4dimethylaminobenzaldehyde và đốt nóng ở 110 oC trong 7-10 phút. Định lượng bằng cách đo mật độ quang ở 625nm [24] Lysine, threonine, Silica gel 1-propanol-25% NH3 (11:9), Định lượng các amino acid quan trọng trong homoserine, 2-propanol-acetone-nước- tryptophan, and 25% NH3 (25:25:7:6), phenylalanine 2-propanol-ethyl acetate-25% NH3- đốt nóng ở 110C trong 5–7 phút. Chấm nước (40:40:3:50) amino acid được quét bằng 2 thiết bị đo mật nước lên men. Phát hiện trytophan bằng cách nhúng bản mỏng trong 40s vào dung dịch 0.5% 4-dimethylamino-benzaldehyde trong ethanol chứa 5% acid sulfuric đậm đặc và 2-propanol-25% NH3 (7:3) Glycine, alanine, aspartic acid Silica gel hay cellulos e Chloroform-methanol (1:1), độ quang khác nhau Sử dụng thuốc thử iodine-azide để phát hiện Glycine, alanine, isopropanol-NH3 (7:3), aspartic acid. Chấm trắng hiện ra trên nền tím ethanol-water (7:3), xác ổ định trong 20 phút [33] chloroform-methanolNH3(20:20:9) and butanol-acetic acid-water (4:1:5) Glycine, L-hydroxyproline, Silica Hệ vi nhũ dầu-nước Hệ thống được dùng để tách chọn lọc DLphenylalanine từ các acid amine khác Dichloromethane-methanol (1:1) Chế độ đo mật độ quang tự động dùng để phát hiện L-arginine hydrochloride trong nền thực phẩm chức năng có chúa nhiều hoạt chất. Độ hồi phúc của chuẩn và mẫu thêm chuẩn lần gel được tẩm DL-alanine, dung DLserine, dịte L-proline, Ltyrosine, DL-valine, Lleucine, DL-iso-leucine, DL-nor-leucine, L-lysine L-arginine Silica gel 60 F254 16 lượt là 98.8% and 98.5% Phát hiện các amino acid: Phương pháp tạo dẫn xuất: Có nhiều loại thuốc thử dùng để phát hiện amino acid được dùng, trong số đó, thuốc thử được dùng nhiều nhất là ninhydrin. Mặc dù được dùng phổ biến, nhưng ninhydrin cho thấy có sự kém nhạy đối với một số amino acid như proline hay hydroxyl proline. Để làm tăng độ nhạy khi phát hiện, phản ứng iodine azide được đề nghị để phát hiện các amino acid [60]. Theo phương pháp này, các amino acid sẽ được tạo dẫn xuất với phenyl isothiocyanate, phản ứng tạo dẫn xuất này được thực hiện trực tiếp ngay trên bản mỏng trước giai đoạn khai triển , sau đó bản mỏng sẽ được phun xịt dung dịch sodium azide (NaN3 sau đó cho tiếp xúc với hơi iodine. Vết sẽ hiện dưới dạng chấm màu trắng trên nền tím-xám. Hệ thuốc thử iodine-azide cho thấy có khả năng định lượng trên chấm có nồng độ từ 1–60 pmol (HPTLC) và 3–100 pmol (TLC). Wawrzycki và cộng sự [61] tổng hợp 4-diethylaminodiazabenzene-4-isothiocyanate và dùng nó để tạo dẫn xuất với 15 alpha-amino acid. Màu của dẫn xuất hiện trên silicagel khi dùng hệ dung môi khai triển thuốc thử ninhydrin thườg được dùng để tạo màu do có độ nhạy cao, tuy nhiên ninhydrin thường tạo dẫn xuất cho màu tím giống nhau đối với hầu hết các amino acid trừ prolin và hydroxylproline. Vì vậy, Samanta và cộng sự đã tạo ra thuốc thử 2,3- dichloro-1,4naphthaquinone để tạo dẫn xuất với nhiều aminoacid cho các màu khác nhau và ổn định (trong 24 đến 48 h). Sắc ký được thực hiện trên bản mỏng silica gel với dung môi khai triển n-propanol–nước, 70:30 (v:v). Sau khi khai triển, đĩa được sấy khô và phun xịt 0.25% 2,3-dichloro-1,4-naphthaquinone trong ethanol (tác nhân 1) và sấy khô ở nhiệt độ phòng cho đến khi ethanol bay hơi hoàn toàn. Bản mỏng được đốt nóng trong lò ở nhiệt độ 110oC trong 10 phút, để nguội và phun xịt với 0.4% isatin trong ethanol (tác nhân 2), bản mỏng được sấy khô và tiếp tục đốt nóng ở 110oC trong 10 phút. Phương pháp có độ nhạy cao và có giới hạn phát hiện từ 0.01 , 0.3 mg. Hệ thống sắc kí (bản mỏng và rửa giải) 17 Các báo cáo cho thấy, TLC đóng góp không nhỏ vào việc phân tích các amino acid có trong sản phẩm tự nhiên và các sản phẩm nhân tạo. Pha tĩnh được dùng trong TLC để phân tích. aminoacid có thể là phân cực hoặc không phân cực. Một số báo cáo cho thấy bản mỏng có thể được tẩm với ion kim loại hoặc tẩm với các tác nhân có tính triền quang. Mặt khác, nhiều hệ pha động cũng được sử dụng trong quá trình khai triển. Hầu hết các hệ đa phần đều ô nhiễm môi trường Định tính và định lượng với TLC Kỹ thuật TLC khi được kết hợp với các thiết bị khác như chấm mẫu tự động, và các thiết bị quét đo mật độ quang thì cho thấy phương pháp có độ nhay cao và tin cậy. TLC ngày càng được quan tâm khi ngày càng phát triển các kỹ thuật định tính mới. Ví dụ, với một hợp chất chưa biết hoặc không có sẵn chất chuẩn thì có thể kết hợp TLC với các kỹ thuật đặc biệt khác như MS, IR Sự thuận lợi của TLC trong phân tích amino acid TLC là kỹ thuật quan trọng trong phân tích các amino acid bởi vì có thể phân tích liên tục do có thể phân tích song song nhiều mẫu , nhanh, đơn giản, tốn ít chi phí, và vấn đề chuẩn bị mẫu có thể đơn giản hơn so với các phương pháp khác do bản mỏng chỉ được sử dụng 1 lần. Các phương pháp sắc kí khác như HPLC, GC vẫn được sử dụng nhưng cần nhiều thiết bị và thời gian phân tích lâu. TLC được xem là kỹ thuật được ứng dụng nhiểu hơn so với HPLC trong phân tích các amino acid có tính triền quang, bởi vì các amino acid có thể hiện màu trực tiếp trên bản mỏng sau khi hoá hơi pha động. Trong khi đó, đối với kỹ thuật HPLC sự hấp thu UV của các chất triền quang trong pha động gây ra những vấn đề về phát hiện chất 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Joseph Sherma, Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis, Journal of Chromatography A, 880 (2000) 129–147 2. Prasad S. Variyar, Suchandra Chatterjee, and Arun Sharma, Fundamentals and Theory of HPTLC-Based Separation, Springer, chapter 2, (2001), 27- 41 3. S. A. Bhawani, M. N. Mohamad Ibrahim, O. Sulaiman, R. Hashim, A. Mohammad, and S. Hena, Thin-layer chromatography of amino acids: a review, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 35 (2012), 1497–1516 4. A. Żwir-Ferenc, M. Biziuk, Solid Phase Extraction Technique – Trends, Opportunities and Applications, Polish J. of Environ. Stud. Vol. 15, No. 5 (2006), 677-690 19 5. G. N. Sapkale*, S. M. Patil, U. S. surwase and P. K. Bhatbhage, Supercritical fluid extraction, Int. J. Chem. Sci., 8(2), 2010, 729-743 6. Joseph Sherma, Bernard Fried, Handbook of thin- layer Chromatography, Marcel Dekker, NewYork, 2013 20