Tài liệu TÓM TẮT DI TRUYỀN HỌC

Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` Phần I : DI TRUYỀN ( chú ý tài liệu được soạn theo sách + slide bài giảng của thầy nhân và cô) ***1 số bệnh, tật di truyển alen trội NST thường ở người: hội chứng Marfan, bệnh Huntington, bệnh u xơ thần kinh, bệnh cận thị, bệnh tăng cholesteron máu có tính gia đình, bệnh thận đa nang ở người lớn, bệnh loạn sản sụn, bệnh u nguyên bào võng mạc, tật dính ngón, tật thừa ngón và tật thừa ngón, bệnh tạo xương bất toàn, hội chứng Noonan, bệnh xơ đa não u, ung thư da, bệnh thrombophilia di truyển, hẹp lỗ dưới động mạch chủ phì đại tự phát, chứng giãn mao mạch xuất huyết di truyển…  1 số bệnh, tật di truyển alen lặn trên NST thường: bệnh bạch tạng, bệnh Agammaglobulinemia, bệnh xơ nang, bệnh thiếu máu hồng cầu hình lưỡi liềm, bệnh Wilson, bệnh apha-beta thalassemia, bệnh mucopolysaccharidoes, tràn khí di truyển, chứng câm điếc, bệnh nhiễm sắc tố sắt mô, sốt Địa Trung Hải gia đình, bệnh gaucher  1 số bệnh, tật di truyển gen lặn lien kết NST giới tính X: bệnh mù màu đỏ lục, bệnh loạn dưỡng cơ Duchene, bệnh Hemophili A, bệnh thiếu hụt Glucose-6-phosphat dehydrogenase, bạch tạng mắt, bệnh tinh hoàn nữ tính hóa, bệnh u hạt mạn, bệnh Fabry  1 số bệnh, tật di truyển gen trội liên kết NST giới tính X: hội chứng NST X dễ gãy, bệnh còi xương do giảm phosphate máu, bệnh thiếu men răng , bệnh còi xương kháng vitamin D, bệnh đái nhạt  1 số bệnh, tật di truyển liên kết NST giới tính Y: bệnh dày sừng lòng bàn tay, tật nhiều lông mọc ở vành tai, bệnh da vẩy cá nặng  1 số bệnh di truyển đa yếu tố: tật khe hở môi-hàm, các khuyết tật của ống thần kinh, ung thư, bệnh tim mạch, bệnh tâm thần phân liệt, tật hẹp môn vị bẩm sinh, tật vô sọ và nứt đốt sống, tật bàn chân vẹo, tật thoát vị rốn, tật thoát vị cơ hoành bẩm sinh, tật da vẩy nến, bệnh động kinh, chậm trí tuệ, loét dạ dày-tá tràng, bệnh tự kỷ, chứng nghiện rượu, nếp vân da (số đếm vân ngón tay), đái đường thể tủy (type 1), đái đường thể tủy (type 2), chiều cao, bệnh sởi  1 số bệnh, tính trạng di truyển đa gen ở người: di truyền màu da, di truyển nếp vân da, di truyển huyết áp tâm thu 1 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) `  Kỹ thuật nhuộm băng G: _ Là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay để đánh giá các bất thường về cấu trúc và số lượng của nhiễm sắc thể _ NST được xử lý bằng trypsin và nhuộm bằng Giemsa hay Wright _ Vùng bắt màu đậm là vùng giàu AT và mang ít gen hoạt động, vùng bắt màu nhạt là vùng giàu GC và mang nhiều gen hoạt động  Kỹ thuật nhuộm băng R: _ NST được xử lý bằng photphat nóng và nhuộm bằng Giemsa _ Hiển thị các band sáng, tối ngược với ngược với phương pháp nhuộm band G,Q _ Được sử dụng để đánh giá các bất thường NST ở đầu tận cùng (mất đoạn, chuyển đoạn..)  Kỹ thuật nhuộm băng Q: _ NST được nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang (Quinacrine), được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang _ Hiển thị các band sáng tối y hệt như trong kỹ thuật nhuộm band G _ Được sử dụng để phân biệt NST Y với các NST nhóm D, E, G  Kỹ thuật nhuộm băng C: _ NST được xử lý bằng muối hay kiềm (Ba(OH)2), nhuộm bằng Giemsa _ Được dùng để đánh giá các vùng dị NST cạnh tâm động, xác định NST 2 tâm, nhận dạng các đa hình của các NST 1,9,16,Y  FISH (Fluorescent insitu hybridization) là kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử, sử dụng một đoạn mồi đặc hiệu (probe) gắn tín hiệu huỳnh quang, để phát hiện sự có mặt hoặc vắng mặt của một đoạn gen nào đó trên nhiễm sắc thể,  Kỹ thuật PCR _ Nguyên liệu: + Đoạn oligonucleoitd 18-30 nu, gồm đoạn mồi xuôi và mồi ngược + Enzim AND polymerase + dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dGTP + DNA khuôn mẫu + Đệm phản ứng: quan trọng nhất là MgCl2 2 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) `  Mô tả Karyotype: _ Cấu trúc được viết như sau: Số lượng NST,NST giới tính,mô tả bất thường NST (nếu có) Vd: 47,XY,+21: người nam bị Down _Mô tả bất thường NST: + Dấu +,- nếu ghi trước số NST thì mô tả chính nguyên NST đó, còn nếu ghi sau thì chỉ mô tả 1 phần NST đó + Tên NST bất thường-tên nhánh bất thường (p,q)-số minh họa NST bất thường (vùng-băng-dưới băng) Vd: 7q31.1: dưới băng 1, băng 1 vùng 3 của nhánh dài NST số 7 _ Việc xác định và lập karyotype dựa trên các nguyên tắc: + Chiều dài NST + Vị trí tâm + Sự phân bố các band sáng tối (trong kỹ thuật nhuộm band) + Màu sắc huỳnh quang bắt màu trên NST (trong kỹ thuật nhuộm màu huỳnh quang) **Hội chứng Down đứng thứ 4 trong các bệnh di truyển nhưng đứng hàng đầu trong các hội chứng về bất thường NST, được gặp với tỷ lệ khoảng 1/800 Thể tam bội chiếm khoảng 15% trong số các loại bất thường NST trong thai kỳ được gặp với tỷ lệ 1/10000, đa số đều bj sẩy thai ngẫu nhiên, nguyên nhân phổ biến là 1 trứng được thụ tinh bởi 2 tinh trùng, các nguyên nhân còn lại chiếm không đáng kể  Đột biến thể lệch bội thường có sự liên quan chặt chẽ với sự gia tăng của tuổi mẹ, nếu như xảy ra trong giảm phân bất thường -> thể đột biến, còn nếu xảy ra bất thường sau khi thụ tinh -> thể khảm  Monosomy được gặp rất ít trong số các trẻ sinh sống vì đa số đều đã chết trong bào thai trừ trường hợp monosomy do hiện tượng bất hoạt NST X  Trysomy thường gặp với tần số cao hơn do cơ thể có thể dung nạp tình trạng thừa vật liệu di truyền tổt hơn là thiếu  NST hình nhẫn có nguyên nhân là do việc mất đoạn NST  Hiện tượng mất đoạn còn được gọi là thể đơn nhiễm 1 phần  Chuyển đoạn Robertson cân bằng: tuy không cân bằng về mức phân tử nhưng lại cân bằng về kiểu hình: đây là đột biến chuyển đoạn giữa 1 đoạn dài trên NST này với 1 đoạn ngắn trên NST khác, kết quả là tạo ra 1 NST rất dài (dài-dài them) NST rất ngắn ,đoạn NST rất ngắn này thường tiêu biến đi nhưng không ảnh hưởng đến việc biểu hiện kiểu hình 3 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) `  Chuyển đoạn Robertson không cân bằng: là hệ quả của chuyển đoạn Robertson cần bằng, khi giảm phân tạo giao tử ở tế bào đã bị chuyển đoạn Robertson cân bằng trước đó, nó sẽ tạo ra 1 giao tử trong đó có 1 NST “dài dài thểm”, và tất cả các NST khác đều bình thường. Khi thụ tinh cùng với 1 giao tử bình thường, đoạn NST “thừa” do chuyển đoạn nằm trên NST “dài dài thêm đó” sẽ làm thừa 1 phần vật chất di truyền trong tế bào và gây mất cần bằng bộ NST và gây biểu hiện trên kiểu hình. Vd: hội chứng Down trong trường hợp này, do trysomy 1 phần NST 21 nên đã biểu hiện kiểu hình bệnh  Các đột biến cân bằng: chuyển đoạn, đảo đoạn, chèn đoạn. Các đột biến này không gây ảnh hưởng đến sô lượng vật liệu di truyền và do đó cũng ko làm biểu hiện kiểu hình hoặc là có thể làm mất hoặc them 1 phần vật liệu di truyền nhưng ko làm biểu hiện kiểu hình  Các đột biến không cân bằng: mất đoạn, nhân đoạn lệch bội, tam bội, đơn bội…  Sự có mặt của đoạn mồi (có bản chất là ARN, khoảng 10 ribonu) mà enzim polymerase mới có thể kéo dài chuỗi polypeptit bắt đầu từ đoạn mồi đó (primase tổng hợp đoạn mồi ARN, cung cấp đầu 3’-OH để DNA polymerase mới có thể bổ sung các nucleotit), vì tất cả các enzim DNA polymerase đều không có khả năng khởi đầu sự sao chép DNA mà phải thông qua đoạn mồi  Trong quá trình tổng hợp AND, enzim ADN polymerase luôn luôn di chuyển theo chiều 3’ -> 5’ (theo mạch ADN mẹ) và mạch mới luôn luôn được tổng hợp theo chiều từ 5’ -> 3’ (chiều của mạch AND mới được tổng hợp)  DNA helicase di chuyển theo chiều từ 5’ -> 3’  Trên mạch khuôn 3’ -> 5’, DNA polymerase di chuyển theo chiều cùng với hướng tháo xoắn, còn trên mạch 5’ -> 3’, DNA polymerase di chuyển theo chiều ngược với hướng tháo xoắn  Ở sinh vật nhân thực, mạch sau được tổng hợp đoạn mồi trước (polymerase alpha) rồi mới đến mạch trước  Ở sinh vật nhân thực, các phân tử DNA sau khi được tổng hợp sẽ tổ chức lại thành nucleoxom trong vòng vài phút 4 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) `  Thực nghiệm invitro cho thấy khả năng sao chép sai là 10-5, còn trong thực tế ở người là 10-9  Ở svns, enzim DNA polymerase 1 và 3 vừa có khả năng polymer hóa (kéo dài) vừa có hoạt tính exonuclease 5’ ->3’ và 3’ -> 5’,do đó trong quá trình xúc tác nếu gặp nucleotide lắp sai, enzyme này sẽ lùi lại, cắt bỏ nucleotide sai theo hướng 3’ -> 5’  Sự hình thành liên kết cộng hóa trị diphotphoeste giữa 2 nu kế tiếp nhau dưới tác dụng của DNA polymerase làm gắn giữa đầu 3’-OH của nu trước với 1 nhóm photphat trong cùng của nu sau, sự phản ứng này làm giải phóng 2 gốc photphat trước đó đã gắn vào nhóm photphat trong cùng (vì cơ chất bỏ sung là deoxyribonucleotit triphotphat), chính sự đứt gãy các gốc diphotphat đã cung cấp năng lượng cho quá trình nhân đôi  Nguyên tắc của quá trình phiên mã + chỉ 1 trong 2 mạch được dùng làm khuôn tổng hợp ARN + Không cần có sự tham gia của đoạn mồi + RNA polymerase di chuyển trên mạch khuôn của DNA theo chiều tử 3’ >5’, do đó RNA cũng được tổng hợp theo chiều 5’ -> 3’ + Enzim RNA polymerase không có khả năng sửa sai nên độ chính xác kém hơn so với quá trình nhân đôi, tuy nhiên RNA không được sao chép nên không ảnh hưởng đến việc truyền đạt thông tin qua các thế hệ + Chỉ phiên mã chọn lọc 1 phần của bộ gen + Cơ chất: ATP, GTP, CTP, UTP (còn ở quá trình nhân đôi cơ chất là dATP, dGTP, dCTP, dTTP) + Tại 1 vùng phiên mã tạo ra nhiều bản sao  Các loại enzim phiên mã ở nhân thực _ RNA pol 1: phiên mã các RNA ở ribosome (28S, 18S, 5.8S) _ RNA pol 2: phiên mã các RNA ở mRNA _ RNA pol 3: phiên mã tRNA, rRNA 5S và các snRNA  Trong quá trình phiên mã, protein hoạt hóa có chức năng: _ Gắn vào vùng điều hòa khởi động của gen ảnh hường đến tốc độ quá trình phiên mã 5 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` _ Gắn vào vùng tăng cường làm cho bẻ cong đoạn DNA từ đó làm cho đoạn khởi động và vùng tăng cường nằm gần nhau  Khi bắt đầu phiên mã (khi đã phiên mã được khoảng 25 ribonu), thì RNA sẽ được gắn mũ chụp - Tác nhân vật lý (Tia UV): làm cho 2 base Thymine liên kết với nhau làm phát sinh đột biến gen - Tác nhân hóa học: + 5BU (5-Bromuraxin) là đồng đẳng của T có khả năng gây đột biến thay thế cặp A-T thành cặp G-X + EMS (Etyl Metyl-Sunfomat) là đồng đẳng của A và G gây đột biến thay thế cặp G-X thành cặp A-T + Acridine gây đột biến mất hoặc thêm cặp Nu, nếu được chèn vào mạch khuôn cũ gây đột biến thêm cặp Nu + HNO2 gây đột biến thay thế cặp Nu  Hội chứng Down: _ Mũi tẹt, mắt xếch, có nếp quạt ở góc trong mắt, gáy phẳng, tai nhỏ, lưỡi dày _ 50% có rãnh khỉ _ Giảm trương lực cơ, bất sản hoặc giảm sản đốt giữa ngón út _ Chậm phát triển tâm thần vận động _40% bị tim bẩm sinh, 3% bị dị tật của ống tiêu hóa, nguy cơ bị bệnh bạch cầu cao gấp 15 đến 20 lần bình thường, dễ mắc các bệnh nhiễm khuẩn đặc biệt là nhiễm khuẩn đường hô hấp  Hội chứng Turner: _ Lùn cân đối, nhi hóa về giới tính, loạn sản buồng trứng. _ Có thể có dị tật lớn hoặc nhỏ . Có thể quan sát thấy hiện tượng phù bạch mạch bàn tay và bàn chân. Nhiều bệnh nhân bị bệnh tim bẩm sinh _ Bệnh nhân có khuôn mặt hình tam giác; lỗ tai nhỏ, ngoài và quay ra sau, cổ rộng và có màng, ngực rộng có hình khiêng, đường chân tóc thấp, móng tay cong, hẹp và sâu _Thường không bị chậm phát triển trí tuệ và hầu hết đều vô sinh  Hội chứng Klinefenter: _ Cao, tay chân dài _ Tinh hoàn nhỏ, không có tinh trùng _ Có thể có vú lớn (1/3 trường hợp) 6 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` _ Thường không bị chậm phát triển trí tuệ -> thường được chẩn đoán muộn, khi đi khám vô sinh.  Hội chứng Edward: _ Trẻ có trọng lượng sơ sinh thấp. Tháng đầu tăng trương lực cơ, sau này giảm _ Mặt: tai nhỏ, vành tai vểnh ra ngoài, miệng nhỏ, miệng há ra khó khăn _ Xương ức ngắn, chẩm nhô, bàn tay nắm chặt có ngón trỏ đè lên ngón giữa, ngón tay có vân cung, ngón chân cái ngắn, gập về phía lung bàn chân _ Chậm phát triển, mang nhiều dị tật bẩm sinh như dị tật tim, thoát vị rốn, thoát vị cơ hoành và thường chết sớm trong những năm đầu  Vật thể Barr: _ Giả thuyết lyon: + Trong các tế bào sinh dưỡng ở người nữ, chỉ có 1 NST X là hoạt động, cái kia bị kết đặc rồi bất hoạt + Sự bất hoạt xảy ra sớm trong thời kỳ phôi (nghiên cứu cho thấy thường xảy ra ở ngày thứ 14 của thai kỳ) + Có tính ngẫu nhiên: NST X bất hoạt có thể có nguồn gốc từ bố hoặc có nguồn gốc từ mẹ ở các tế bào có nguồn gốc khác nhau trong cùng cá thể + Có tính cố định: khi 1 trong 2 NST X nào đó của NST bị bất hoạt thì cả dòng tế bào do tế bào ấy sinh ra đều giữ nguyên trạng thái NST X bất hoạt ấy cho đến hết đời cá thể + Giả thuyết Lyon được củng cố bằng các bằng chứng tế bào học qua hình ảnh của vật thể Barr trong nhân tế bào ở gian kỳ _ Chỉ được thấy ở các tế bào có từ 2 NST X trở lên _ Số lượng vật thể Barr trong nhân tế bào luôn bằng số NST giới tính X trừ đi 1 + VD: nữ bình thường có 1 vật thể Barr, nữ Turner không có vật thể barr, nam bình thường không có vật thể barr, nam klyphentơ có 1 vật thể Barr _ Ở người các tế bào hay dùng để xét nghiệm là tế bào niêm mạc miệng và tế bào niêm mạc âm đạo _ Xảy ra không hoàn toàn, tức là 1 số vùng NST vẫn duy trì trạng thái hoạt động trên bản sao của nó, đặc biệt là trên những đầu tận cùng của nhánh dài hoặc nhánh ngắn NST, vùng tận cùng của nhánh ngắn trên NST X có độ tương đồng rất cao với phần xa trên nhánh ngắn của NST Y 7 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` _ 1 số vùng khác trên NST X cũng không bị bất hoạt, 20% số gen trên NST X bị bất hoạt vẫn có thể hoạt động. Nhiều gen trên NST X thoát khỏi sự bất hoạt có alen tương đồng trên NST Y dẫn đến hiện tượng tạo ra kiểu gen tương tự ở người nam và người nữ -1 số đột biến NST tăng theo tuổi mẹ : ( đa số là tăng theo tuổi mẹ ,tự tìm hiểu :3 ) -1 số đột biến đơn gen tăng theo tuổi bố như hội chứng Marfan, bất sản sụn Các bệnh do đột biến sai nghĩa: bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm Các bệnh do đột biến vô nghĩa: bệnh xơ nang, bệnh teo cơ Duchene, beta thelasemia Bệnh xơ nang: ở gen CF bị mất côdon 508 (TTT) mã hóa axam Phe Ở mức độ nu, tỷ lệ đột biến là 10-9 Ở mức độ gen, tỷ lệ đột biến là 10-4 – 10-7 Các bất thường NST thường gia tăng theo tuổi mẹ trong khi đó các đột biến đơn gen có thể gia tăng theo tuổi bố  Các bà mẹ trên 35 tuổi có nguy cơ sinh con trysomi 21 (nhưng khoảng ¾ số trẻ mắc hội chứng Down được sjnh ra bởi các bà mẹ dưới 35 tuổi ) Tình trạng hôn nhân đồng huyết không thường được gặp trong phả hệ của bệnh di truyền gen lặn trên NST thường nhưng được gặp nhiều trong phả hệ của loại bệnh di truyền này hơn so với các loại bệnh di truyển khác  Dung dịch nhược trương có vai trò: _ Làm mỏng màng tế bào lympho _ Tăng thể tích tế bào lympho _ Hủy tế bào hồng cầu _ Nước đi vào tế bào lympho  Lợi ích chính của việc ứng dụng siêu âm trong chẩn đoán trước sinh _ Hỗ trợ cho kỹ thuật lấy dịch ối, lấy nhung mao màng đệm, lấy máu cuống rốn _ Phát hiện 1 tỷ lệ khá lớn các dị tật của nhiều cơ quan, bộ phận ở thai nhi _ Xác định tuổi thai _ Sàng lọc thai nhi mắc thể 3 nhiễm 21thông qua việc đo độ mờ da gáy và sự có mặt của xương mũi 8 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` _ Quan sát được thai nhi 1 cách trực tiếp, cho phép chẩn đoán các trường hợp dị tật bẩm sinh với độ đặc hiệu cao  2 trẻ sinh đôi cùng trứng có thể khác nhau là do: _ Sống trong những điều kiện sống khác nhau _ Đột biến xảy ra trong giai đoạn tiền phôi của 1 trong 2 đứa trẻ _ Tính thấm không hoàn toàn của bệnh hoặc tính trạng _ Các gen ngoài nhân  Đặc điểm của bệnh di truyển gen lặn trên NST thường _ Bệnh thường được thấy ở 1 số anh chị em ruột nhưng không xảy ra ở các thế hệ đầu (thường gián đoạn qua 1 số thế hệ) _ Nam và nữ đều có khả năng mắc bệnh như nhau _ Trung bình ¼ con của cặp vợ chồng mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp sẽ biểu hiện bệnh _ Nguy cơ tái phát trung bình trong con cái của các cặp bố mẹ bình thường mang gen bệnh là 25% _ Tình trạng hôn nhân đồng huyết làm tăng tỷ lệ xuất hiện bệnh và thường được gặp nhiều trong phả hệ của loại bệnh di truyền này hơn so với các loại bệnh di truyển khác  Đặc điểm của bệnh di truyển gen trội trên NST X: _ Người nữ có khả năng mắc bệnh cao gấp đôi người nam _ 1 cá thể chỉ cần nhận 1 gen bệnh liên kết với NST X là đủ để mắc bệnh _ Người bố mắc bệnh không thể truyền bệnh cho con trai nhưng sẽ truyển bệnh cho 100% con gái _ Mẹ không mắc bệnh thì tất cả con trai sinh ra đều không mắc bệnh _ Nguời mẹ mắc bệnh thường ở trạng thái dị hợp. Những người này thường truyền bệnh cho con gái hoặc con trai với xác suất 50% cả 2 giới  DI TRUYỀN ĐA YẾU TỐ:  Đối với các bệnh di truyền đa yếu tố, nguy cơ tái phát được tính dựa vào: các số liệu thống kê về sự xuất hiện bệnh thu được trên 1 lượng lớn gia đình trong quần thể  Đối với các bệnh di truyền đa yếu tố,việc đánh giá vai trò của yếu tố di truyền và yếu tố môi trường trong quá trình sinh bệnh được thực hiện chủ yếu dựa vào: số liệu thống kê về tỷ lệ tái xuất hiện bệnh 9 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` trong lần sinh sau trên 1 lượng lớn gia đình đã có con mắc bệnh đó trong quần thể  DI TRUYỀN HỌC HÓA SINH  Hầu hết các rối loạn chuyển hóa đều được di truyền theo kiểu gen lặn NST thường  Đột biến ở vị trí cắt nối:  Vị trí: _ Xảy ra ở vị trí cho 5’ _ Xảy ra ở vi trí nhận 3’ _ Xảy ra ở những vùng lân cận quanh vị trí này  Hậu quả: _ Làm mất cả 1 phần exon (nếu đb xảy ra ở đoạn exon làm cho 1 đoạn nu nào đó trở thành đoạn nu là vị trí điểm cắt) _ Làm mất nguyên cả exon _ Làm cho 1 phần hay toàn bộ intron có mặt trong mRNA hoàn chỉnh 10 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) `  Bệnh phenylkito niệu (PKU): _ Nguyên nhân: bệnh do đb gen trên NST thường (thay thể, mất, thêm) làm rối loạn enzim phenylalanine hydroxylase (PAH), từ đó làm cho phenylalanine ko chuyển hóa được thành tyrosin và bị tích trữ, ứ đọng tổn hại đến quá trình hoạt động trong não như myelin hóa, tổng hợp protein, gây ra tình trạng chậm phát triển nặng _ Tỷ lệ: 1/10000 ở người da trắng đến 1/90000 ở người châu phi _ Hiện nay có khoảng hơn 400 đột biến gen khác nhau liên quan đến PKU nhưng khoảng 10 đb gen đã liên quan đến 95% bệnh này _Lâm sàng: da, tóc sáng màu do thiếu myelin, chậm phát triển trí tuệ nặng _ Điều trị : duy trì nồng độ phenylalanine bình thường thông qua việc hạn chế thức ăn có chứa phenylalanine _ Sàng lọc PKU bằng cách lấy máu gót chân của trẻ sơ sinh thấm trên giấy thấm đặc biệt để đánh giá nồng độ phenylalanine (lấy máu khô) sau 48 hay 72 tiếng _ Đặc điểm:  Là bệnh được nghiêm cứu đầy đủ nhất và được thực hiện sang lọc sơ sinh đầu tiên  Bệnh có tỷ lệ mắc ko đều ở mọi chủng tộc  Là bệnh do di truyền đột biến gen lặn trên NST thường  Điện di AND: _ Mục đích: Phân tách các AND _ Nguyên lý: + Các phân tử AND mang điện tích âm nên sẽ di chuyển từ cực âm sáng cực dương trên gel agarose khi được đặt trong điện trường + Thu hoạch: để quan sát hình ảnh AND khi điện di, người ta nhuộm AND bằng ethidium bromide, dưới ánh sáng của tia tử ngoại, AND mang ethidium bromide sẽ phát sáng _ Các yếu tố ảnh hưởng điện di AND: + Kích thước ADN: Các đoạn AND có kích thước ngắn hơn sẽ di chuyển nhanh hơn trên gel + Nồng độ gel agarose: càng cao thì có khả năng phân tách các đoạn AND nhỏ hơn -> tốc độ di chuyển của AND càng chậm, càng thấp có khả năng phân tách các đoan AND lớn hơn -> càng nhanh + Điện thế điện di: điện thế càng cao thì tốc độ di chuyển của AND trong gel càng nhanh 11 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` + Đặc điểm hình dạng: AND thẳng sẽ di chuyển nhanh hơn AND vòng, siêu xoắn nhanh hơn vòng dãn xoắn _ Thiết bị điện di: nắp, khay và buồng điện di  Số lượng điểm gãy của 1 số đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể: _ Mất đoạn giữa (kẽ) :2 _ Mất đoạn đầu mút : 1 _ Nhân đoạn: 1 NST có 1 điểm gãy và 1 NST có 2 điểm gãy _ Chuyển đoạn (Robertson và tương hỗ): mỗi NST có 1 điểm gãy _ NST đều: 1 _ Đảo đoạn: 2 _ Chèn đoạn: 1 NST có 1 điểm gãy và 1 NST có 2 điểm gãy _ NST hình nhẫn: 2 Phần II : CÁC KĨ THUẬT DI TRUYỀN ****Kỹ thuật PCR: _ Tác dụng: Cho phép nhân 1 đoạn DNA đặc hiệu ngắn (có chiều dài khoảng vài ngàn Kb hoặc ngắn hơn) nhân lên 1 cách nhanh chóng thành hàng triệu bản sao giống hết nhau tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện các biến dị di truyền ở mức DNA _ Nguyên lý: PCR là 1 phản ứng kéo dài mồi (primer) nhờ enzyme DNA polymerase nhằm tổng hợp invitro các đoạn DNA đặc trưng trên cơ sở khuôn mẫu của 1 đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự nucleotide. Các đoạn DNA mới hình thành lại được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng kế tiếp theo phương thức phản ứng chuỗi _ Các giai đoạn của mỗi chu kỳ PCR: + Giai đoạn biến tính: được thực hiện ở 93-95 độ C. Phân tử DNA đang ở trạng thái xoắn kép sẽ được tách thành 2 sợi đơn 12 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` + Giai đoạn gắn mồi: được thưc hiện ở 50-70 độ C. Các đoạn mồi sẽ được gắn với DNA khuôn mẫu tại vị trí có trình tự bổ sung. Nhiệt độ gắn mồi thay đổi tùy theo trình tự nucleotide của mồi + Giai đoạn kéo dài: được thực hiện ở 70-72 độ C. Đây là khoảng nhiệt độ thích hợp cho enzim DNA polymerase hoạt động kéo dài mồi theo chiều 5’ > 3’để tổng hợp đoạn DNA mới bổ sung với DNA khuôn mẫu Sau n chu kỳ (thường từ 30-35), số lượng DNA được tổng hợp tăng lên đến 2n. Đoạn DNA được tổng hợp thường dài từ vài trăm đến và ngàn bp _ Các thành phần tham gia PCR: + 2 đoạn mồi (mồi xuôi và mồi ngược): là đoạn oligonucleotide, mỗi đoạn có từ 18-30 nu + Enzym DNA polymerase: Taq polymerase (được lấy từ vi khuẩn Thermus aquaticus) + dNTPs (deoxynucleotide triphotphat): dATP, dCTP, dGTP, dTTP + Đệm phản ứng: quan trọng nhất là MgCl2 + DNA khuôn mẫu _ Cách tiến hành: + Trộn các thành phần với thể tích 25-50 µl + Đặt ống PCR vào ống luân nhiệt, cài chương trình luân nhiệt thích hợp + Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose + Nhuộm Ethidium Bromide + Đọc kết quả dưới đèn cực tím (UV) _ Ưu điểm kỹ thuật PCR: + Có thể được sử dụng với 1 lượng DNA ban đầu hết sức nhỏ (10-9 hoặc 1012 g) (số lượng DNA này có thể thu được từ các vết máu đã khô nhiều năm, trên 1 sợi tóc hoặc thậm chí từ mặt sau của 1 con tem được dán = nước bọt là đủ cho việc phân tích) + Có thể khuếch đại DNA mô, tế bào giáng hóa, tế bào trong môi trường đặc biệt, mô đã cố định formalin, DNA giáng hóa (nếu trình tự ngắn) + Nhanh, dễ thực hiện + Rất nhạy + Dễ phát hiện sản phẩm (PCR cho phéo tạo ra 1 lượng lớn DNA tinh khiết nên không phải sử dụng DNA có hoạt tính phóng xạ để phát hiện các đoạn DNA mang đột biến mà dùng các probe không có hoạt tính phóng xạ đánh dấu bằng phương pháp hóa học an toàn hơn _ Nhược điểm: + Phải biết được trình tự DNA ở 2 đầu (Flanking) (việc tổng hợp các primer đòi hỏi phải có sự hiểu biết về trình tự các đoạn DNA nằm cạnh đoạn DNA cần khảo sát, nếu ko pit thì buộc phải sử dụng kỹ thuật khác) 13 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` + Dễ bị nhiễm DNA khác nguồn từ phòng thí nghiệm (khắc phục được) + Chỉ thực hiện được các đoạn DNA cần khảo sát có kích thước ngắn nên khó áp dụng với các đoạn DNA dài hơn 1 đến vài kb nên không thể phát hiện ra các đột biến mất đoạn gen lớn hơn đoạn DNA trên. Trong trường hợp này phải sử dụng kỹ thuật Southern Blotting để thay thế _ Ứng dụng trong di truyền người: + Chẩn đoán đột biến gen trong bệnh lý di truyển  Mơ hồ giới tính: xác định gen SRY  Mất đoạn nhiễm sắc thể Y ở người vô tinh, thiểu năng tinh trùng  Teo cơ Duchene: mất đoạn gen dystrophin + Ứng dụng trong pháp y và di truyển học tiến hóa +Tạo dòng nhanh chóng, là phương tiện giúp nghiên cứu gen, bộ gen (thay thế kỹ thuật Southern blotting trong phân tích RFLP, VNTR)  Xác định trình tự của DNA _ Phương pháp: + Phương pháp hóa học: Maxam và Gilbert + Phương pháp dideoxy (phương pháp kết thúc chuỗi) ( Frederick Sanger): sử dụng các dideoxynucleotide chấm dứt chuỗi. Đây là các nucleotide có cấu trúc tương tự như các deoxyribonucleotide bình thường chỉ khác ở chỗ chúng thiếu mất 1 nhóm hydroxyl trong cấu trúc ở vị trí 3’ vì thế khi gắn vào nó sẽ kết thúc chuỗi polynucleotide do không tạo được liên kết photphodieste với các nu kế tiếp (nhưng với nu trước đó thì có) 14 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` _ _ Trình tự của 1 đoạn DNA mạch đơn chưa biết sẽ được trộn với các primer (được đánh dấu bằng các hoạt chất có tính phóng xạ), các nucleotide thông thường, DNA polymerase và 1 loại dideoxynucleotide. Giống như trong kỹ thuật PCR, các primer sẽ lai với 1 vị trí tương ứng trên chuỗi đơn DNA theo nguyên tắc bổ sung và DNA polymerase sẽ giúp kéo dài chuỗi từ vị trí đó. Và khi dideoxynucleotide gắn vào chuỗi DNA đang được tổng hợp thì chuỗi DNA đang được tổng hợp đó cũng sẽ bị dừng lại. Vì việc thêm vào dideoxynucleotide được thực hiện 1 cách ngẫu nhiên nên quá trình này sẽ tạo nên các đoạn DNA với các chiều dài khác nhau, mỗi đoạn kết thúc bởi cùng 1 loại dideoxynucleotide _ 4 loại phản ứng khác nhau được thực hiện trên 4 loại nucleotide, các đoạn thu được từ mỗi loại phản ứng sẽ được cho chạy điện di bên cạnh nhau trên cùng 1 gel để vị trí của các đoạn có thể so sánh được với nhau nên từ đó ta 15 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` có thể đọc được trình tự của chuỗi DNA đơn đó bằng các phương pháp khác nhau + Đánh dấu phóng xạ: điện di sản phẩm trên gel polyacrylamine: quan sát bằng mắt thường các band trên phim phóng xạ tự chụp (vì mỗi band tương ứng với 1 chuỗi DNA tận cùng bởi 1 loại base duy nhất nên trình tự của DNA có thể được đọc bằng cách quan sát thứ tự của các band trên gel). Phương pháp này có thể đọ được trình tư vài tram cặp base. Nhược điểm: đọc chậm, khó khắn, dễ sai sót +Đánh dấu huỳnh quang: 1 trong 4 dideoxynucleotide khác nhau được gắn với 1 loại huỳnh quang cho phép phát ra 1 phổ ánh sáng riêng. Sau đó điện di trên gel polyacrylamine rồi sau đó kích thích = 1 chùm tia lase. Ánh sáng phát ta sẽ đượ ghi nhận qua camera kỹ thuật số để chuyển thành các tín hiệu điện tử và chuyển thành ảnh, ảnh này được phân tích để chuyển thành dạng đồ thị trong đó mỗi loại nucleotide khác nhau được mô tả bằng 1 đỉnh màu khác nhau, trình tự của các đỉnh màu này cho phép đọc trình tự của DNA. Có thể đọc được 500bp của 64 người khác nhau trên cùng 1 gel trong vòng từ 2 đến 4 giờ + Đánh dấu huỳnh quang (điện di trên mao dẫn): được điện di trên các ống mao dẫn. Vì những ống này rất mỏng và lượng nhiệt tỏa ra trong quá trình điện di rất ít nên việc đọc trình tự diễn ra rất nhanh. Có thể đọc được trình tự của 600 bp của 95 mẫu chỉ trong 15 phút  Các kỹ thuật tự động (đánh dấu huỳnh quang, hóa chất phát sáng, hệ thống đo màu…) được thực hiện cho việc đánh giá tính chất đa hình của đoạn lặp ngắn (STRP), tính đa hình của đơn nucleotide (SNP) và các dạng đa hình khác 16 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` + Sử dụng sắc ký khối phổ: có độ phân giải cao, sự phát triển của kỹ thuật MALDI-TOF cho phép phân tích hàng trăm mẫu DNA trong vài phút. Hiện nay đây là kỹ thuật thu hút nhiều sự quan tâm trong việc sử dụng để đọc trình tự DNA  Bằng cách sử dụng vi tính và các kỹ thuật tự động hóa đã cho phép đọc trình tự của khoảng 3 tỷ cặp nu trong bộ gen của người  Điện di DNA: _ Mục đích: Phân tách các DNA theo kích thước. Đây là công cụ hữu ích giúp phân tích các sản phẩm của PCR, phân tích các đoạn DNA sau phản ứng được cắt bởi các enzim cắt hạn chế, phân tích các đoạn DNA trước khi thực hiện kỹ thuật Sounthern Blot _ Nguyên lý: + Các phân tử DNA mang điện tích âm nên sẽ di chuyển từ cực âm sáng cực dương trên gel agarose khi được đặt trong điện trường + Thu hoạch: để quan sát hình ảnh DNA khi điện di, người ta nhuộm AND bằng ethidium bromide, dưới ánh sáng của tia tử ngoại, AND mang ethidium bromide sẽ phát sáng _ Các yếu tố ảnh hưởng điện di DNA: + Kích thước DNA: Các đoạn DNA có kích thước ngắn hơn sẽ di chuyển nhanh hơn trên gel + Nồng độ gel agarose: càng cao nhỏ hơn -> tốc độ di chuyển của DNA càng chậm, càng thấp -> càng nhanh + Điện thế điện di: điện thế càng cao thì tốc độ di chuyển của DNA trong gel càng nhanh + Đặc điểm hình dạng: DNA thẳng sẽ di chuyển nhanh hơn DNA vòng, siêu xoắn nhanh hơn vòng dãn xoắn _ Thiết bị điện di: nắp, khay và buồng điện di  Sự đa hình trong chiều dài các đoạn DNA giới hạn: _ Khi sử dụng enzim cắt giới hạn để cắt đoạn DNA thành những đoạn khác nhau tại những vị trí đặc hiệu. Vì 1 lý do đột biến nào đó làm thay đổi vị trí đặc hiệu nên làm cho enzim cắt không chính xác tạo ra các đoạn DNA giới hạn khác nhau từ các đoạn DNA ban đầu giống nhau. Và khi đó bằng các kỹ thuật khác ta có thể quan sát được các đoạn DNA giới hạn khác nhau đó Ví dụ: ở escherichia coli có 1 enzim giới hạn EcoRi ghi nhận 1 đoạn DNA có trình tự GAATTC. Mỗi khi bắt gặp đoạn này trên DNA thì EcoRi sẽ cắt giữa vị trí G và A dẫn đến tạo thành các đoạn DNA giới hạn. Giả sử có 2 17 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` đoạn DNA có trình tự giống nhau, mỗi đoạn đều có 3 vị trí ghi nhận enzim EcoRI, 1đoạn DNA bình thường (A) và 1 đoạn DNA bị đột biến ở vị trí cắt ở giữa tạo thành GAATTT (B) và vì thế EcoRi sẽ không nhận diện được vị trí này nên chỉ sẽ cắt ở 2 vị trí đầu và cuối. Do đó ở đoạn DNA (A) sẽ có đoạn DNA giới hạn ngắn hơn đoạn DNA giới hạn của DNA (B) _ Để có thể quan sát được các đoạn DNA giới hạn có chiều dài khác nhau, ta lần lượt thực hiện các kỹ thuật sau + Xử lý = enzim giới hạn: quá trình này sẽ tạo ra trên 1 triệu đoạn DNA với các chiều dài khác nhau + Điện di : chủ yếu dựa vào kích thước để phân tách các đoạn DNA giới hạn trên gel sau khi điện di + Tách cấu trúc xoắn kép: = cách cho tiếp xúc với dung dịch kiềm để chuyển DNA từ cấu trúc xoắn kép thành cấu trúc mạch đơn + Cố định DNA: = cách thấm chuyển chúng từ gel qua 1 màng rắn như nitrocellulose (màng thấm Southern). Màng này bây h sẽ chứa hàng ngàn đoạn DNA phân bố theo trật tự tương tự như vị trí của chúng ở trên gel + Xác định đoạn DNA đặc hiệu: sử dụng mẫu dò probe (khoảng vài ngàn bp) có đánh dấu đồng vị phóng xạ. Cho các mẫu dò này tiếp xúc qua màng thấm, sau đó cho tiếp xúc với phim X quang, phóng xạ phát ra từ các đoạn dò sẽ tác động lên phim tạo thành các band  Sự đa hình trong số lượng các đoạn lặp (VNTR): số lượng của các đoạn lặp trên 1 vùng nhất định (thường là các DNA tiểu vệ tinh) sẽ tạo ra nhiều biến dị khác nhau trên cùng 1 đoạn DNA (có thể tạo ra rất nhiều alen trong khi ở RFLP thì chỉ tạo ra 2 alen) _Các VNTR cũng được phát hiện bằng các kỹ thuật giống như trên RFLP (tức là cũng được cắt = enzim cắt giới hạn và sau đó điện di trên gel) nhưng đối với VNTR thì sự phát hiện ra các biến dị thông qua sự khác nhau về số lượng của các đoạn lặp giữa 2 vị trí giới hạn _Nếu sự đa hình của DNA dựa vào số lượng các đoạn lặp của các vi vệ tinh thì gọi đó là các đoạn lặp ngắn (STRP). Số lần lặp của các DNA vi vệ tinh có sự khác biệt rất lớn giữa người này với người khác và giữa 2 NST tương đồng _Kích thước của các đoạn lặp trong STRP được phân lập khôngqua vị trí giới hạn nằm cạnh các đoạn lặp (VNTR) mà thay vào đó là bằng kỹ thuật PCR 18 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) ` _Sự đa hình của các DNA vi vệ tinh rất cao nên được lựa chọn trong nghiên cứu lập bản đồ gen, trong lĩnh vực pháp y như xác định người cha, xác định tội phạm   1.  Phần III : ĐỘT BIẾN GEN Các hình thức đột biến gen: _ Đột biến thay cặp nu _ Đột biến thêm hoặc mất cặp nu Vị trí đột biến _ Đột biến ở vùng mã hóa _ Đột biến ở vùng điều hòa _ Đột biến ở vị trí cắt nối Đột biến ở vùng mã hóa:  Đột biến thay cặp nucleotide: 1 cặp nucleotide trong cấu trúc của gen bị thay bởi 1 cặp nu khác. Tùy theo hậu quả của nó trên chuỗi polypeptide mà có 3 loại: Đột biến im lặng: Đột biến làm thay đổi bộ ba mã hóa nhưng không làm đổi nghĩa (nhờ vào tính chất thoái hóa), do đó không làm thay đổi trình tự của các amino acid trong chuỗi polypeptide vì thế không gây hậu quả trên kiểu hình 19 Khúc Thừa Minh- Y1H(2013-2019) `  Đột biến sai nghĩa: Đột biến chỉ làm thay đổi 1 amino acid trong chuỗi polypeptide VD: trong bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm, đột biến đã làm thay thế nu T thành nu A trên mạch gốc DNA làm cho codon mà hóa acid glutamid (GAG) bị thay thế bằng codon mã hóa valine (GUG)  Đột biến vô nghĩa: Đột biến làm cho 1 codon có nghĩa thành 1 codon mang mã kết thúc (UAA, UAG, UGA trên mRNA) dẫn đến quá trình giải mã bị kết thúc sớm hơn bình thường do đó làm cho chuỗi polypeptide bị ngắn lại 20