Tài liệu Sản xuất protein đơn bào (scp)

́ ĐẠI HỌC QUÔC GIA HÀ NỘI ̀ TRƯƠNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC ____________ ́ LƠP K12 – CNKHTN SINH HỌC ̉ BÀI TIÊU LUẬN MÔN VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP SẢN XUẤT PROTEIN ĐƠN BÀO (SCP) Hà Nội, 1/2012 ́ ĐẠI HỌC QUÔC GIA HÀ NỘI ̀ TRƯƠNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC ____________ ́ LƠP K12 – CNKHTN SINH HỌC ̉ BÀI TIÊU LUẬN MÔN VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP SẢN XUẤT PROTEIN ĐƠN BÀO (SCP) Giảng viên: PGS.TS. Ngô Tự Thành Sinh viên thực hiê ̣n: Trần Vũ Quỳnh Giao Nguyễn Cẩ m Linh Lê Hải Vân Hà Nô ̣i, 1/2012 Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Sản xuất Protein đơn bào Mục lục PHẦN I. TỔNG QUAN ............................................................................................ 3 1. Các khái niệm chung . ....................................................................................... 3 1.1. Protein đơn bào ......................................................................................... 3 1.2. Công nghệ sản xuất protein đơn bào ......................................................... 3 2. Lịch sử nghiên cứu và sản xuất protein đơn bào............................................... 4 3. Các nhóm vi sinh vật đƣợc sử dụng để sản xuất protein đơn bào..................... 6 3.1. Yêu cầu đối với các chủng vi sinh vật sử dụng trong sản xuất. ................. 6 3.2. Các nhóm vi sinh vật sử dụng trong sản xuất protein đơn bào. ................ 6 4. Các nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất protein đơn bào ............................... 9 4.1. Các sản phẩm thải trong nông nghiệp ....................................................... 9 4.2. Các sản phẩm phụ của các quá trình lên men công nghiệp. ..................... 9 4.3. Các sản phẩm, dịch chiết và dịch thủy phân từ nguyên liệu thực vật...... 10 4.4. Các nguồn nhiên liệu có giá trị thương mại cao như khí đốt, methan, methanol và các n-alkan.................................................................................. 10 5. Quy trình sản xuất protein đơn bào ................................................................. 11 6. Chế biến protein đơn bào thành thực phẩm .................................................... 11 6.1. Phá hủy thành tế bào: .............................................................................. 12 6.2. Loại bỏ axit nucleic .................................................................................. 12 7. Ƣu nhƣợc điểm của protein đơn bào. .............................................................. 13 7.1. Ưu điểm: ................................................................................................... 13 7.2. Nhược điểm: ............................................................................................. 13 1 Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Sản xuất Protein đơn bào PHẦN II. MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT PROTEIN ĐƠN BÀO ................ 14 1. Sản xuất protein đơn bào sử dụng chủng Cellulomonas đột biến [3] ............. 14 2. Một số quy trình sản xuất protein đơn bào từ nấm men: ................................ 18 2.1. Một số nguồn nguyên liệu thường sử dụng để sản xuất protein đơn bào.20 2.2. Quy trình sản xuất protein đơn bào từ nấm men ..................................... 26 3. Một số quy trình sản xuất protein đơn bào từ nấm mốc: ................................ 29 3.1. Sản xuất protein đơn bào từ chất thải công nghiệp: ................................ 30 3.2. Sản xuất protein đơn bào từ rác thải nông nghiệp từ phần bỏ đi của quả ................................................................................................................... 30 4. Một số quy trình sản xuất protein đơn bào từ nhóm vi sinh vật quang hợp ... 31 4.1. Nhóm vi sinh vật quang hợp- nguồn cung cấp protein. ........................... 31 4.2. Ứng dụng trong sản xuất SCP.................................................................. 34 PHẦN III. KẾT LUẬN ........................................................................................... 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO: ...................................................................................... 55 2 Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Sản xuất Protein đơn bào PHẦN I. TỔNG QUAN 1. Các khái niệm chung . 1.1. Protein đơn bào Protein đơn bào (Single-cell protein – SCP) là thuật ngữ thƣờng dùng để chỉ phần protein thu đƣợc trong sinh khối khô của các tế bào hoặc tổng lƣợng protein tách chiết đƣợc từ môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật, đƣợc sử dụng làm nguồn thức ăn cho con ngƣời hay nguồn thức ăn chăn nuôi. Thuật ngữ “protein đơn bào” đƣợc GS. C.L.Wilson đƣa ra vào năm 1966, đƣợc dùng thích hợp hơn đối với hầu hết các vi sinh vật đơn bào hoặc cá thể dạng sợi. Các protein đơn bào có thành phần protein cao (60-80% khối lƣợng khô của tế bào), chất béo, carbohydrate, axit nucleic, vitamin và chất khoáng. Chúng cũng chứa nhiều các axit amin thiết yếu nhƣ Lysin và Methionine. 1.2. Công nghệ sản xuất protein đơn bào Công nghệ sản xuất protein đơn bào là công nghệ nuôi cấy và thu sinh khối các vi sinh vật. Nó ra đời đƣợc coi là một phƣơng pháp hứa hẹn có thể giải quyết đƣợc vấn đề thiếu protein trên toàn thế giới. Công nghệ sản xuất protein đơn bào bao gồm cả các quá trình chuyển vị sinh học, biến đổi các sản phẩm phụ ít giá trị và chi phí thấp, thƣờng là các chất thải, trở thành sản phẩm với giá trị dinh dƣỡng và giá trị thị trƣờng cao hơn. Sản xuất protein đơn bào đòi hỏi phải vận dụng các kiến thức về lên men, công nghệ sản xuất sinh khối, nuôi cấy vi sinh vật. Đầu thế kỉ 20, sự áp dụng rộng rãi các chƣơng trình phát triển nông nghiệp đã làm cho các nguồn thức ăn thực vật, nhƣ đậu nành, ngô, lúa mì và gạo luôn ở trong tình trạng sẵn có. Ngoài ra, sự phát triển về chính trị và kinh tế đã thay đổi trật tự thế giới từ một hệ thống các khối nƣớc trở nên toàn cầu hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho việc mở cửa giao dịch các sản phẩm nông nghiệp. Các sản phẩm nông nghiệp này vƣợt trội so với protein đơn bào trên cơ sở giá cả sản xuất thấp hơn. Tuy nhiên, sự kết hợp giữa việc sản xuất phức tạp với các công nghệ chế biến thực phẩm đã mang lại một thế hệ sản phẩm protein đơn bào mới, có thể sử dụng để thay thế các loại thị hay dùng làm chất tăng cƣờng hƣơng vị. Các ứng dụng trong tƣơng lai của việc biểu hiện protein dị hợp thể có thể phát triển hơn nữa tiềm năng của dạng thực phẩm này, tạo ra các sản 3 Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Sản xuất Protein đơn bào phẩm phù hợp với yêu cầu của chế độ ăn uống hay tạo thành các dòng sản phẩm có giá trị cao. Sản xuất protein đơn bào ở quy mô công nghệp có một số đặc điểm nhƣ sau:  Sử dụng đa dạng các phƣơng pháp, loại nguyên liệu thô và loại vi sinh vật khác nhau.  Có hiệu quả biến đổi cơ chất ban đầu cao  Năng suất cao nhờ vào tốc độ tăng trƣởng nhanh của các vi sinh vật.  Không phụ thuộc vào các yếu tố mùa hay thời tiết. 2. Lịch sử nghiên cứu và sản xuất protein đơn bào Ngƣời tiên phong nghiên cứu và xây dựng công nghệ này là nhà khoa học ngƣời Đức Max Delbruck và các cộng sự của ông cách đây gần 1 thế kỉ. Họ là ngƣời đầu tiên chú ý đến giá trị của các nấm men rƣợu dƣ thừa trong việc tạo nguồn thức ăn cho vật nuôi. Trong chiến tranh Thế giới thứ nhất, ngƣời Đức đã thay thế phần nửa nguồn protein quan trọng bằng nấm men. Vì các nấm men rƣợu từ công nghiệp sản xuất bia không đủ số lƣợng để đáp ứng nhu cầu protein thức ăn, một tỉ lệ rất lớn sinh khối nấm men đƣợc sản xuất trong điều kiện hiếu khí trong môi trƣờng bán tổng hợp chứa nguồn nitơ là các muối ammonium. Phƣơng pháp này hiệu quả hơn so với lên men, nhƣng vẫn có hiện tƣợng lên men một số chất trong nguồn cacbon, đồng thời năng suất sinh khối thu đƣợc là không tối ƣu. Vào năm 1919, Sak (Đan Mạch) và Hayduck (Đức) đã phát minh ra một quy trình mới, đƣa dung dịch đƣờng vào dịch huyền phù chứa nấm men thay vì đƣa thêm nấm men vào một dung dịch đƣờng đã pha loãng. Công nghệ này đến ngày nay vẫn đƣợc sử dụng. Sau khi Chiến tranh Thế giới thứ nhất kết thúc, sự quan tâm của ngƣời Đức đến nấm men đã giảm xuống, nhƣng đến 1936, ngƣời ta tiếp tục sử dụng nấm men rƣợu và một số loài nấm men khác, đặc biệt là các loài đƣợc nuôi cấy với số lƣợng lớn để làm thức ăn bổ sung cho con ngƣời và động vật. Kể từ đó, ƣu điểm của việc nuôi cấy nấm men trong môi trƣờng giàu dinh dƣỡng và điều kiện hiếu khí đã đƣợc nhận ra một cách đầy đủ và nhanh chóng trở thành một phƣơng tiện để sản xuất thức ăn trên quy mô công nghiệp. 4 Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Sản xuất Protein đơn bào Vào thời điểm bắt đầu Chiến tranh thế giới thứ II, nấm men đƣợc sử dụng trƣớc hết làm thức ăn trong quân đội, sau đó áp dụng cho tất cả các công dân. Ngƣời ta đã hi vọng có thể sản xuất đƣợc hơn 100,000 tấn mỗi năm, tuy nhiên trên thực tế, sản lƣợng chƣa bao giờ vƣợt quá 15,000 tấn, do việc sản xuất liên tục bị gián đoạn bởi chiến tranh. Việc sử dụng nấm men làm thức ăn trong giai đoạn này bắt đầu từ Đức, sau đó đƣợc áp dụng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới. Phòng thí nghiệm các sản phầm rừng của Sở nông nghiệp Hoa Kỳ đã tiến hành hàng loạt thí nghiệm nuôi cấy nấm men Candida utilis trên môi trƣờng chứa sulfit là chất thải trong quá trình sản xuất giấy. Sau chiến tranh, vấn đề sản xuất protein đơn bào ngày càng đƣợc chú trọng để giải quyết các vấn đề của nhân loại trên quy mô toàn cầu. Đầu những năm 60, một số công ti đa quốc gia đã quyết định nghiên cứu sản xuất sinh khối vi sinh vật để làm nguồn protein thức ăn. Các cơ chế cơ bản quyết định sự tăng trƣởng của các sinh vật nhƣ nấm men và nấm sợi đã đƣợc lám sáng tỏ, tuy nhiên vẫn còn nhiều khó khăn trong ứng dụng các cơ chế trên trong công nghiệp, do đó ngƣời ta tiếp tục đẩy mạnh nghiên cứu. Ngƣời ta tiếp tục tìm kiếm các loại cơ chất với giá thành thấp. Các sản phẩm phụ trong công nghiệp nhƣ sữa phomat, rỉ đƣờng hay các cơ chất giá thành rẻ nhƣ tinh bột, ethanol và methanol, sulfit từ quá trình sản xuất giấy đã đƣợc chọn để sử dụng trong quá trình sản xuất protein đơn bào. Lợi ích của việc sản xuất protein đơn bào không chỉ dừng lại ở việc cung cấp thêm nguồn thức ăn cho con ngƣời nữa mà còn hạn chế sự lãng phí các sản phẩm phụ trong các quá trình sản xuất khác và bảo vệ môi trƣờng. Vào giữa thập niên 60, ngƣời ta đã sản xuất đƣợc hàng triệu tấn nấm men thực phẩm ở các vùng khác nhau trên thế giới. Liên bang Soviet đã lên kế hoạch sản xuất thƣờng niên 900,000 tấn kể từ năm 1970 để bù đắp lại sự thiếu hụt của protein nông nghiệp. Đến năm 1980, quá trình sản xuất protein đơn bào tiếp tục đƣợc mở rộng ở các nƣớc phát triển và đƣợc dự kiến tiến hành ở các quốc gia đang phát triển. Từ đó đến nay, quy trình sản xuất protein đơn bào đƣợc không ngừng nghiên cứu phát triển hoàn thiện, tìm kiếm các cơ chất và các loài vi sinh vật phong phú hơn, phục vụ nhu cầu của con ngƣời ở khắp các quốc gia trên thế giới. 5 Sản xuất Protein đơn bào Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp 3. Các nhóm vi sinh vật đƣợc sử dụng để sản xuất protein đơn bào 3.1. Yêu cầu đối với các chủng vi sinh vật sử dụng trong sản xuất.  Thời gian sinh trƣởng ngắn.  Có khả năng tạo thành lƣợng protein lớn, từ 40-70% sinh khối khô của tế bào.  Có khả năng tận dụng đƣợc tối đa các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy.  Không có độc tố, không có khả năng gây bệnh  Có sức bền cao, ít bị nhiễm trong quá trình nuôi cấy, dễ tách khỏi dịch nuôi cấy. Ngoài ra, phần trăm axit nucleic của tế bào vi sinh vật cũng là một yếu tố quan trọng cần xem xét. Quá trình hấp thụ axit nucleic quá mức có thể dẫn đến lắng đọng axit uric, gây ra một số bệnh nhƣ gout hay hình thành sỏi thận, nên đối với ngƣời thì thành phần axit nucleic này phải giảm xuống dƣới 2%. Do đó, ngƣời ta đã áp dụng một vài kĩ thuật để giảm thành phần axit nucleic trong tế bào vi sinh vật, bao gồm cả quy trình về hóa học và enzyme. 3.2. Các nhóm vi sinh vật sử dụng trong sản xuất protein đơn bào. Ngƣời ta sử dụng nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau để sản xuất protein đơn bào, bao gồm:  Các nhóm vi khuẩn: Cellulomonas, Alcaligenes,…  Nấm men: Candida, Saccharomyces,…  Nấm sợi: Trichoderma, Fusarium, Rhizopus,…  Các nhóm tảo: Spirulina, Chlorella,… Giá trị dinh dƣỡng của chúng đƣợc trình bày trong Bảng 1 [1]: Thành phần Nấm Tảo Nấm men Vi khuẩn Protein 30-45 40-60 45-55 50-65 Chất béo 2-8 7-20 2-6 1-3 Các chất vô cơ 9-14 8-10 5-10 3-7 Axit nucleic 7-10 3-8 6-12 8-12 6 Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Sản xuất Protein đơn bào Bảng 1: Trung bình các thành phần trong tế bào ở các nhóm vi sinh vật chính (% khối lượng khô) theo Miller and Litsky (1976) Ngƣời ta đã ƣớc tính rằng, 100 pound nấm men có thể sản xuất ra 250 tấn protein trong vòng 24h. Đối với tảo nuôi cấy trong ao thì năng suất protein thu đƣợc là 20 tấn sinh khối khô/acre/năm. Vi khuẩn thì cho lƣợng protein cao, có thể lên đến 80% và có tốc độ sinh trƣởng nhanh hơn, tuy nhiên lại có nhiều nhƣợc điểm. Nấm men là loài có nhiều ƣu điểm, ví dụ nhƣ kích thƣớc lớn, dễ thu sinh khối, hàm lƣợng axit nucleic trong tế bào thấp, hàm lƣợng lysine cap, có khả năng sinh trƣởng ở pH axit. Tuy nhiên, đặc điểm quan trọng nhất là nó rất phổ biến và đƣợc chấp nhận rộng rãi vì đã đƣợc sử dụng từ rất lâu trong công nghệ lên men truyền thống. Nhƣợc điểm của nấm men bao gồm tốc độ sinh sản chậm, hàm lƣợng protein cũng nhƣ methionine thấp hơn so với vi khuẩn. Nấm sợi cũng có những ƣu điểm tƣơng tự, dễ thu hoạch, tuy nhiên hạn chế về tốc độ sinh trƣởng, hàm lƣợng protein và ít đƣợc chấp nhận hơn so với nấm men. Một nhóm vi sinh vật khác là tảo thì lại có nhƣợc điểm là thành tế bào cấu tạo từ cellulose – loại phân tử mà con ngƣời không tiêu hóa đƣợc, bên cạnh đó nó còn chứa nhiều kim loại nặng. Ngoài ra, cần nhấn mạnh rằn, vì lý do kĩ thuật và kinh tế thì ngƣời ta thƣờng thu cả sinh khối tảo chứ không tách riêng protein của nó, do vậy đôi lúc thuật ngữ protein đơn bào ở đây chƣa hoàn toàn chính xác. Protein của tảo thƣờng có chất lƣợng cao, có thể sánh đƣợc với protein từ thực vật. Sản xuất protein đơn bào từ các vi sinh vật khác nhau, cụ thể là từ nấm và vi khuẩn đã nhận đƣợc sự quan tâm đáng kể, ngƣợc lại nghiên cứu sản xuất và sử dụng thành công protein trên tảo hiện nay còn chƣa nhiều, do giá thành sản xuất cao hơn và khó khăn hơn về mặt kĩ thuật. Một vài loài tảo, nấm sợi, nấm men và vi khuẩn đƣợc sử dụng làm protein đơn bào và hiện đang đƣợc sản xuất thƣơng mại, cùng với nguồn carbon của nó đƣợc thể hiện trong Bảng 2: Vi sinh vật Cơ chất Vi khuẩn Aeromos hydrophylla Lactose Acromobacter delvacvate n-alkan Acinetobacter calcoacenticus Ethanol 7 Sản xuất Protein đơn bào Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Bacillus megaterium Các hợp chất nitơ (ngoài protein) Bacillus subtilis, Cellulomonas sp., Flavobacterium sp., Thermomonospora fusca Cellulose, hemicellulose Lactobacillus sp. Glucose, amylose, maltose Methylomonas methylotrophus, M. clara Methanol Pseudomonas fluorescens Axit uric và các hợp chất chứa nitơ ngoài protein khác. Rhodopseudomonas capsulata Glucose Nấm sợi Aspergillus fumigatus Maltose, glucose Aspergillus niger, A. oryzae, Cephalosporium eichhorniae, Chaetomium cellulolyticum Cellulose, hemicellulose Penicillium cyclopium Glucose, lactose, galactose Rhizopus chinensis Glucose, maltose Scytalidium aciduphlium, Thricoderma alba Thricoderma viridae, Cellulose, pentose Nấm men Amoco torula Ethanol Candida tropicalis Maltose, glucose Candida utilis Glucose Candida novellas n-alkan. Candida intermedia Lactose Saccharomyces cereviciae Lactose, pentose, maltose Tảo Chlorella pyrenoidosa, Chlorella sorokiana, CO2 dùng cho quang hợp 8 Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Sản xuất Protein đơn bào Chondrus crispus, Scenedesmus sp, Spirulina sp., Porphyrium sp. Bảng 2: Một số loài vi sinh vật sử dụng trong sản xuất protein đơn bào và nguồn carbon của chúng theo Bhalla và cộng sự (2007) 4. Các nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất protein đơn bào Các nguồn nguyên liệu hiện đang đƣợc sử dụng để sản xuất protein đơn bào rất phong phú và đa dạng, có thể liệt kê một số loại chính nhƣ sau: 4.1. Các sản phẩm thải trong nông nghiệp Cellulose từ nguồn nông nghiệp và lâm nghiệp là nguồn nhiên liệu tái tạo nhiều nhất trên hành tinh này, đồng thời là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất protein đơn bào. Trong tự nhiên, cellulose thƣờng ở dạng phức hợp với lignin, hemicellulose, tinh bột và có cấu tạo phức tạp, do vậy, để sử dụng dƣới dạng cơ chất nó phải đƣợc xử lý hóa học (phân giải bằng axit hay kiềm) hoặc bằng các enzyme (cellulase) để phân giải cellulose thành các đƣờng mà tế bào vi sinh vật sử dụng đƣợc. Lignocellulose là nguồn nguyên liệu từ gỗ, đòi hỏi phải xử lý trƣớc khi sử dụng làm cơ chất cho sản xuất protein đơn bào. Có nhiều cách xử lý khác nhau, ví dụ nhƣ phân giải bằng axit hay kiềm, bằng hơi nƣớc hay thậm chí dùng phóng xạ tia X [2]. Ngƣời ta có thể nấu gỗ trong dung dịch chứa Canxi sulfit. Đến ngày nay, để tận dụng các nguồn lignocellulose là sản phẩm thải ngƣời ta dùng các nhóm nấm, trong đó đƣợc biết rõ nhất là Agaricus bisporus và một số các nhóm khác chứa enzyme phân giải lignocellulose. 4.2. Các sản phẩm phụ của các quá trình lên men công nghiệp. Dịch kiềm sulfit – sản phẩm phụ của quá trình sản xuất giấy đã đƣợc sử dụng làm cơ chất để lên men kể từ nawmg 1909 ở Thụy Điển và sau đó ở nhiều nơi trên thế giới. Dạng vi sinh vật đầu tiên đƣợc sử dụng trong quá trình này là Saccharomyces cerevisiae, mặc dù loài vi sinh vât này không có khả năng chuyển háo pentose – loại hợp chất có mặt với lƣợng lớn trong sản phẩm thải này. Sau đó, ngƣời ta tìm ra các loài vi sinh vật thích hợp hơn nhƣ Candida tropicalis hay Candida utilis. Rỉ đƣờng là một sản phẩm phụ của quá trình lên men đƣờng. Dịch đƣờng nồng độ cao thu đƣợc từ quá trình xay xát mía hay củ cải đƣờng đƣợc làm lạnh để đƣờng kêt tinh. Khi đƣờng không kết tinh nữa thì ngƣời ta thu đƣợc phần dung dịch còn lại, đó là rỉ đƣờng. Đối với 100kg thực vật có thể thu đƣợc 3.5 đến 4.5 kg rỉ đƣờng. Bên cạnh nồng độ đƣờng cao, rỉ đƣờng còn chứa các chất khoáng, các hợp chất hữu cơ và 9 Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Sản xuất Protein đơn bào vitamin có giá trị cao trong công nghiệp lên men. Tuy nhiên, sản xuất sinh khối vi sinh vật từ rỉ đƣờng đòi hỏi phải bổ sung thêm nguồn nitơ và photpho phù hợp. Nguồn nitơ truyền thống là các muối amonium, nguồn photpho thêm vào thƣờng ở dạng muối. 4.3. Các sản phẩm, dịch chiết và dịch thủy phân từ nguyên liệu thực vật. Tinh bột thu đƣợc từ các loài thực vật có củ ở các nƣớc nhiệt đới và ôn đới, từ gạo, ngô và ngũ cốc là nguồn nguyên liệu để sản xuất protein đơn bào. Ở các nƣớc nhiệt đới, ngƣời ta còn sử dụng sắn nhƣ một nguồn nguyên liệu sản xuất protein đơn bào. Quy trình sản xuất này sử dụng một số loài vi sinh vật có enzyme amylase nhƣ Endomycosis fibuligira, sau đó đƣa dịch nuôi cấy sau khi phân hủy tinh bột qua nồi lên men có chứa một loại vi sinh vật có tốc độ sinh trƣởng nhanh nhƣ Candida utilis. Dịch chiết của một số loại quả nhƣ đủ đủ, dứa, chuối cũng là nguồn cơ chất để tổng hợp protein đơn bào. Dịch chiết đu đủ có hàm lƣợng chất dinh dƣỡng cao: saccharride chiếm 9.6%, protein, protein chiếm 0.2%, đƣờng hòa tan chiếm khoảng 7%; đƣờng hòa tan trong đu đủ ở dạng glucose, fructose và sucrose, đồng thời đây là loài thực vật có năng suất cao, sinh trƣởng tƣơng đối nhanh. Một loại quả khác là chuối cũng là nguyên liệu để sản xuất protein đơn bào. Điều này có rất có ích trong việc tận dụng nguồn sản phẩm dƣ thừa do không đủ chất lƣợng xuất khẩu ở các quốc gia có trồng nhiều loại cây ăn quả này. 4.4. Các nguồn nhiên liệu có giá trị thương mại cao như khí đốt, methan, methanol và các n-alkan. Các vi sinh vật liên quan đến quá trình sản xuất protein đơn bào từ nguồn cơ chất trên chủ yếu là các vi khuẩn và nấm men. Nhiều quá trình hiện nay đang trong giai đoạn nghiên cứu. Việc sử dụng nguồn hợp chất nhiên liệu trên để sản xuất thức ăn từ lâu đã đƣợc nhiều nhà khoa học đặt ra. Công ti dầu mỏ của Anh đã sử dụng hai loại nấm men Candida lipolytica và C. tropicalis với nguồn cơ chất là các alkan có mạch Carbon từ 12 đến 20 nguyên tử có trong phần dẻo của khí gas. Một vài loại dầu thô có chứa phần này chiếm khoảng 15%. Sản phẩm thu đƣợc từ quá trình này còn gọi là TOPRINA, đã đƣợc kiểm tra độc tính và khả năng gây ung thƣ trong vòng 12 năm, sau đó đã đƣợc sử dụng làm nguồn thức ăn thay thế có hàm lƣợng protein cao cho cá hoặc dùng làm bột sữa không béo. Tuy nhiên, do giá dầu mỏ ngày càng cao, nhiều nƣớc đã ngừng sử dụng nguồn nguyên liệu này để sản xuất protein đơn bào. Thay vào đó, ngƣời ta tăng cƣờng nghiên cứu sử dụng methane làm nguồn cơ chất. Vi sinh vật phù hợp với nguồn cơ chất này mà đã đƣợc nghiên cứu kĩ là Methylomonas methanica, nuôi cấy trong môi trƣờng có chứa muối nitrat hay muối ammonium làm nguồn nitơ. 10 Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Sản xuất Protein đơn bào Mặt khác, methanol cũng là một nguồn chất đƣợc quan tâm. Lên men trên quy mô lớn để thu sinh khối của Methylophilus methtlotrophus từ nguồn cơ chất là methanol là phƣơng pháp đƣợc xây dựng để sản xuất protein đơn bào từ nguồn này, và sản phẩm của quy trình này đƣợc sử dụng làm thức ăn cho vật nuôi. Methanol với vai trò là nguồn carbon để sản xuất protein đơn bào có nhiều ƣu điểm vƣợt trội hơn so với n-paraffin, khí metan hay thậm chí một số hợp chất carbohydrate. 5. Quy trình sản xuất protein đơn bào Quá trình lên men tạo sinh khối yêu cầu lựa chọn loại vi sinh vật đƣợc có giai đoạn sinh lý phù hợp, khử trùng môi trƣờng nuôi cấy và các thiết bị dùng để giữ môi trƣờng nuôi ở trạng thái sẵn sàng, tách tế bào, thu các tế bào ở phần dịch nổi, tinh chế và xử lý, bộ ổn nhiệt để điều hòa nhiệt độ, dụng cụ xác định pH và các thiết bị điều khiến khác để điều hòa các yếu tố cần thiết cho sự sinh trƣởng ở mức ổn định. Sau khi chuẩn bị, nuôi cấy vi sinh vật ở điều kiện thích hợp trong môi trƣờng đã chuẩn bị. Quá trình này đòi hỏi phải kiểm soát nồng độ carbon ở mức thích hợp cũng nhƣ cung cấp đủ oxy để duy trì điều kiện hiếu khí cần cho sự sinh trƣởng của vi sinh vật. Vì đây là một quá trình phụ thuộc vào thời gian, nên việc biến đổi liên tục các yếu tố của môi trƣờng sẽ ảnh hƣởng đến sinh lý của tế bào, trong đó nồng độ cơ chất có ảnh hƣởng lớn nhất. Vì thế, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy liên tục để có thể kiểm soát nguồn Carbon đƣa vào môi trƣờng, đồng thời lấy ra một lƣợng vi sinh vật nhất định để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho lƣợng vi sinh vật ở trong thùng nuôi cấy. Các phƣơng pháp thƣờng đƣợc áp dụng bao gồm: lên men nổi, lên men chìm và lên men trên pha rắn. Sau khi nuôi cấy, cần thu sinh khối vi sinh vật. Hiện nay có nhiều phƣơng pháp để cô đặc dịch nuôi cấy nhƣ lọc, để lắng, li tâm và dùng các màng bán thấm. Ngƣời ta thƣờng thu sinh khối nấm men bằng cách li tâm, còn đối với nấm sợi thƣờng thu bằng cách lọc. Tuy nhiên, các thiết bị cần thiết tƣờng đắt và không phù hợp với sản xuất ở quy mô nhỏ cũng nhƣ mở rộng sản xuất. Việc loại bỏ lƣợng nƣớc là rất cần thiết để giữ các chất ổn định để lƣu trữ nhƣng lại không dễ thực hiện. Protein đơn bào cần phải đƣợc sấy đến độ ẩm 10% hoặc phải làm cô đặc lại và biến tính để đề phòng chúng bị hỏng. 6. Chế biến protein đơn bào thành thực phẩm Để sử dụng hiệu quả các protein vi sinh vật làm thức ăn cho ngƣời, cần các điều kiện sau:  Giải phóng protein tế bào bằng cách phá hủy hay phân hủy thành tế bào. 11 Sản xuất Protein đơn bào Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp  Làm giảm hàm lƣợng axit nucleic trong tế bào. 6.1. Phá hủy thành tế bào: Có thể phá hủy thành tế bào vi sinh vật bằng nhiều cách: ép, bẻ vụn, nghiền, dùng áp lực hay phá hủy bằng sóng âm. Ngoài ra ngƣời ta còn sử dụng các enzyme hay hỗn hợp enzyme để phân hủy từng phần hoặc hoàn toàn thành tế bào. Thủy phân thành tế bào nhờ enzyme có hiệu quả cao hơn do tác động đặc hiệu. Phƣơng pháp enzyme có thể dùng để thay thế phá hủy cơ học, đặc biệt là đối với các nguyên liệu có thể bị bất hoạt do yếu tố cơ học, ngƣời ta sử dụng cả các enzyme nội bào và ngoại bào do các vi sinh vật khác tiết ra. Tuy nhiên, quá trình này diễn ra chậm hơn so với dùng phƣơng pháp cơ học hoặc hóa học, do vậy, ngƣời ta thƣờng sử dụng phối hợp nhiều phƣơng pháp để có hiệu quả cao hơn. Phƣơng pháp phi-cơ học Xử lý hóa học: dùng axit, bazơ, các chất hòa tan, chất tẩy rửa Phân giải bằng enzyme: enzyme thủy phân, dùng phage, tự phân hủy Dùng các phƣơng pháp vật lý: làm đông lạnh-để tan, sốc thẩm thấu, dùng nhiệt và sấy khô Phƣơng pháp cơ học Dùng áp lực cao Nghiền ƣớt, sử dụng các hạt nghiền Dùng sóng âm để phá hủy tế bào Nén tế bào Dùng áp suất cao ở nhiệt độ thấp Bảng 3: Một số phương pháp thường sử dụng để phá hủy thành tế bào vi sinh vật 6.2. Loại bỏ axit nucleic Các phƣơng pháp dùng để loại bỏ axit nucleic trong tế bào bao gồm phƣơng pháp xử lý hóa học và xử lý bằng enzyme. Mỗi phƣơng pháp đều có nhƣợc điểm là giá thành đắt và có thể ảnh hƣởng đến thành phần dinh dƣỡng trong tế bào. Một số phƣơng pháp:  Tách axit nucleic bằng các rƣợu, muối, acid và kiềm.  Tách axit nucleic khỏi sinh khối vi sinh vật bằng kiềm ở nhiệt độ cao, tuy nhiên phƣơng pháp này có thể tạo ra các chất độc, ví dụ nhƣ lysinoalanine.  Xử lý bằng anhydrid để biến đổi cấu trúc nucleoprotein ở nấm men.  Sử dụng các enzyme nuclease để phân giải axit nucleic. 12 Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Sản xuất Protein đơn bào 7. Ƣu nhƣợc điểm của protein đơn bào. 7.1. Ưu điểm:  Vi sinh vật có tốc độ nhân đôi và tăng trƣởng nhanh, thu sinh khối trong thời gian ngắn.  Vi sinh vật có hàm lƣợng protein tƣơng đối cao.  Các vi sinh vật có khả năng sử dụng một số lƣợng nguồn carbon phong phú để tạo thành năng lƣợng, trong đó có một số nguyên liệu đƣợc tái sử dụng từ nguồn chất thải nông nghiệp hay công nghiệp.  Các chủng vi sinh vật với năng suất cao cũng nhƣ thành phần chất dinh dƣỡng phù hợp có thể đƣợc chọn lọc và nuôi cấy với số lƣợng lớn trong điều kiện phòng thí nghiệm, đồng thời cũng có tiềm năng áp dụng ở quy mô công nghiệp.  Sinh khối vi sinh vật dùng để thu protein đơn bào không phụ thuộc vào mùa cũng nhƣ biến đổi khí hậu. 7.2. Nhược điểm: Bên cạnh các ƣu điểm trên, việc sử dụng các nguồn vi sinh vật hay sinh khối vi sinh vật làm thức ăn hay sản xuất protein đơn bào cũng có nhiều nhƣợc điểm cần phải khắc phục, bao gồm:  Nhiều loài vi sinh vật có thể tạo ra các chất gây độc cho cơ thể ngƣời và cơ thể động vật, Vì vậy, khi chọn lựa một loài vi sinh vật để tiến hành sản xuất phải đảm bảo nó không chứa bất kì chất độc nào.  Đôi khi sử dụng sinh khối vi sinh vật để làm nguồn thức ăn bổ sung có thể dẫn đến khó tiêu hoặc không tiêu hóa đƣợc, thậm chí gây phản ứng dị ứng cho ngƣời.  Hàm lƣợng axit nucleic cao trong sinh khối khô của nhiều loài vi sinh vật cũng là một yếu tố gây ảnh hƣởng không mong muốn cho con ngƣời. Đôi khi hàm lƣợng axit nucleic cao này có thể dẫn đến sự hình thành sỏi thận hay bệnh gout.  Khả năng chứa các hợp chất gây độc hay gây ung thƣ cho con ngƣời và động vật.  Sản xuất protein đơn bào là một quá trình đắt tiền, vì nó cần có các chất điều khiển có độ tiệt trùng cao khi nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. 13 Sản xuất Protein đơn bào Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp PHẦN II. MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT PROTEIN ĐƠN BÀO 1. Sản xuất protein đơn bào sử dụng chủng Cellulomonas đột biến [3] Cellulase là một hệ enzyme có hoạt động theo cơ chế kiềm chế bằng sản phẩm cuối cùng, tức là sự có mặt thừa của glucose (sản phẩm của quá trình phân giải cellulose bởi enzyme cellulase) sẽ làm giảm sự tổng hợp ra enzyme này, từ đó hạn chế sự sinh trƣởng của tế bào. Trong nghiên cứu này, ngƣời ta giải quyết vấn đề trên bằng cách sử dụng chủng Cellulomonas đột biến làm giảm hàm lƣợng cellulase trong tế bào. Quy trình: Môi trƣờng nuôi cấy cơ bản bao gồm các chất sau (tính theo số gam trên 100ml nƣớc máy ở pH=7.0) Chất hóa học Số gam trên 100 ml nƣớc NaNO3 0.1 K2HPO4 0.1 KCl 0.05 MgSO4.7H2O 0.05 Dịch chiết nấm men 0.05 Glucose 0.1 Bảo quản môi trƣờng ở -20 oC trên thạch Bảng 4: Thành phần của môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm nuôi cấy chủng Cellulomonas đột biến Nguồn nitơ và cellulose: Ngƣời ta nghiên cứu 5 sử dụng 5 nguồn nitơ khác nhau bao gồm: ammoni bisulfat, ammoni bicacbonat, ammoni nitrat, ure và natri nitrat thu đƣợc tốc độ tăng trƣởng của tế bào tƣơng tự nhau, tuy nhiên ure còn có thể đóng vai trò là chất điều khiển độ pH nên sự tăng trƣởng của tế bào ở nguồn nitơ này cao hơn. 14 Sản xuất Protein đơn bào Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Cellulose đƣợc sử dụng dƣới dạng bột cellolose kết tinh (Avicel, FMC Corp.) Nuôi cấy vi sinh vật trong nồi lên men dung tích 250l, chứa dung dịch cơ bản nhƣ trên nhƣng không có glucose, bổ sung Avicel 0.5 % và ure. Hình 1: Nuôi cấy liên tục . Điều kiện nuôi cấy:  Tốc độ dẫn khí vào: 0.09 m3/phút  Tốc độ lắc: 100 vòng/phút.  Tốc độ phá bọt khí: 1800 vòng/phút  Áp lực 2 lb. Nuôi cấy trong vòng 72- 96h trƣớc khi thu tế bào. Thu tế bào và sấy khô sinh khối vi sinh vật. Xác định hàm lƣợng các chất dinh dƣỡng và phân tích thành phần các amino acid có mặt trong protein của vi sinh vật. Sau đó, ngƣời ta thí nghiệm trên chuột bằng cách nuôi chuột bằng nguồn thức ăn có chứa sinh khối Cellulomonas và so sánh với các nguồn thức ăn khác. Các lô thí nghiệm đƣợc thể hiện trong bảng 5: Lƣợng (g/kg) Các thành phần Chế độ ít protein Tinh bột ngô 633 Chế độ Casein 578 Chế độ Cellulomonas 573 15 Sản xuất Protein đơn bào Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Dextrose 100 100 100 Hỗn hợp vitamin 10 10 10 Hỗn hợp muối 40 40 40 Avicel 122 122 Dầu ngô 50 50 Bột trứng 45a Casein 50 100 Cellulomonas Choline 222 0.75 0.75 0.75 DL-Methionine 4.5 Bột trứng đƣợc cho vào làm nguồn bổ sung protein Bảng 5: Thành phần của các chế độ ăn thí nghiệm Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Thành phần % khối lƣợng khô của tế bào Protein (AA) 67.6 Protein (N) 74 Carbohydrate 12 Chất vô cơ 9.2 RNA 26 DNA 2 Năng lƣợng Nƣớc 4.03 kilocalo/g 76.9 % tổng khối lƣợng của tế bào Bảng 6: Thành phần chất dinh dưỡng có trong Cellulomonas 16 Sản xuất Protein đơn bào Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Axit amin Theo tiêu chuẩn của FAO Cần cho chuột đang lớn Cellulomonas Arginine _ 6.0 10.2 Histidine _ 3.0 3.6 Isoleucine 4.2 5.0 3.3 Leucine 4.8 5.0 3.3 Lysine 4.2 7.0 6.5 Methionine 2.2 6.0a 1.5 Phenylalanine 2.8 8.0b 3.4 Tyrosine 2.8 Threonine 2.8 5.0 4.7 Valine 4.2 6.0 5.8 2.6 a ⅓ đến ½ có thể đƣợc thay thế bởi cystein b ⅓ đến ½ có thể đƣợc thay thế bởi tyrosine Bảng 7: So sánh thành phần axit amin cần cho chuột và thành phần axit amin trong Cellulomonas Chế độ ăn Thay đổi về trọng lƣợng cơ thể Lƣợng cho ăn Lƣợng N đƣa vào Ít protein - 8.7 126.4 0.61 Casein 29.0 153.1 2.45 58.1 ± 0.5 Cellulomonas 23.6 163.4 2.61 50.4 ± 0.4 NPU (biểu thị mức sử dụng protein) (%) Bảng 8: Thay đổi cân nặng, lượng thức ăn và giá trị NPU ở các chế độ ăn thí nghiệm Từ các kết quả trên, có thể thấy rằng chủng Cellulomonas đột biến này có khả năng phân giải cellulose tinh thể để tạo thành một sản phẩm có chất lƣợng dinh dƣỡng 17 Tiểu luận môn Vi sinh vật học Công nghiệp Sản xuất Protein đơn bào tốt, nhƣ đã chỉ ra ở thí nghiệm nuôi chuột. Đồng thời, có thể thấy rằng Cellulomonas là một sinh vật có thể sử dụng an toàn và có nhiều tiềm năng để sản xuất protein đơn bào từ cellulose. 2. Một số quy trình sản xuất protein đơn bào từ nấm men: Trong các nguồn protein sản xuất bằng con đƣờng vi sinh vật, nấm men đƣợc nghiên cứu sớm nhất và đƣợc áp dụng rộng rãi trên thế giới. Con ngƣời đã sử dụng nấm men hoặc các sản phẩm hoạt động sống của chúng từ hàng nghìn năm nay. Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản bằng cách nảy chồi. Nấm men không có diệp lục và không thể sử dụng năng lƣợng mặt trời. Vì vậy chúng dinh dƣỡng bằng các hydratcacbon, các hydrocacbua, trƣớc hết là đƣờng. Trong tế bào nấm men có chứa hầu hết các chất cần thiết cho sự sống (protein, gluxit, lipit, các enzim, các vitamin, các axit nucleic, các chất khoáng). Không một sản phẩm thực vật hoặc động vật nào có trong thành phần của mình một lƣợng các chất có tác dụng đặc hiệu nhƣ trong nấm men. Tuy nhiên thành phần các chất đặc hiệu của nấm men không phù hợp hoàn toàn với những nhu cầu sinh lý của động vật. Nấm men đƣợc chú ý nhiều vì không những trong tế bào của chúng có nhiều chất dinh dƣỡng có giá trị, mà chúng lại có khả năng tăng sinh khối và các đặc điểm sinh lý phù hợp với điều kiện sản xuất công nghiệp. Về đặc điểm lịch sử: Men gia súc đƣợc sản xuất đầu tiên ở Đức vào khoảng năm 1880. Lúc đó ngƣời ta dùng men bia (Saccharomyces cerevisiae). Trong thế chiến thứ I, men gia súc và men thực phẩm đƣợc sản xuất chủ yếu ở Đức là giống Torula utilis. Ở Mỹ, từ năm 1946 mới tổ chức sản xuất sinh khối nấm men. Lúc đầu, ngƣời ta nuôi cấy nấm men trên sacaroza để thu hồi sinh khối làm thức ăn cho ngƣời. Sau đó vì lý do kinh tế, dần dần ngƣời ta thay sacaroza bằng dịch thủy phân từ tinh bột và xenluza, phế liệu công nghiệp đƣờng, bia, rƣợu … Năm 1968, Liên Xô là nƣớc đầu tiên xây dụng nhà máy sản xuất nấm men từ paraphin dầu mỏ, sau đó Anh, Pháp , Nhật v…v.. đã tiến hành rất nhanh trong lĩnh vực sử dụng nguồn nguyên liệu dồi dào và rẻ tiền này vào mục đích thu protein của nấm men và đã đƣa sản lƣợng nấm men trên thế giới ngày càng tăng. Về giá trị dinh dƣỡng:  Nấm men rất giàu protein và vitamin, đặc biệt là các vitamin nhóm B. 18