Tài liệu Phân lập và xác định độc tố vi khuẩn clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc thịt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI --------------- LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM BOTULINUM GÂY BỆNH NGỘ ĐỘC THỊT LÊ THỊ TRANG HÀ NỘI - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI --------------- LUẬN VĂN THẠC SĨ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM BOTULINUM GÂY BỆNH NGỘ ĐỘC THỊT LÊ THỊ TRANG CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Nguyễn Thùy Trâm HÀ NỘI - 2022 TS. Lê Huy Hoàng LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện của các thầy cô giáo Trường Đại học Mở Hà Nội, các nhà khoa học của Viện vệ sinh dịch tễ trung ương. Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào và các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Hà Nội đã giảng dạy cho em những kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và hoàn thành luận văn. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thùy Trâm, TS Lê Huy Hoàng, là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn tới Lãnh đạo Viện vệ sinh dịch tễ trung ương, Lãnh đạo khoa Vi khuẩn và các anh chị phòng thí nghiệm Vi khuẩn kỵ khí, đã luôn tạo điều kiện, chia sẻ và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện luận văn. Nghiên cứu này sử dụng kinh phí của đề tài “Nghiên cứu sản xuất bộ kit LAMP phát hiện nhanh gen độc tố của Clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc thịt", mã số đề tài 02/2021 ĐX. Em xin trân trọng cảm ơn chủ nhiệm đề tài. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, đồng nghiệp, cơ quan đã quan tâm, động viên, nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng Lê Thị Trang năm 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi Lê Thị Trang, học viên Cao học khóa 2019-2021 Trường Đại học mở Hà Nội, chuyên ngành công nghệ sinh học, xin cam đoan: 1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của các Thầy: TS. Nguyễn Thùy Trâm, TS Lê Huy Hoàng. 2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. 3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày tháng Ngƣời viết cam đoan Lê Thị Trang năm 2021 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................2 1.1 Tổng quan về bệnh ngộ độc thịt ......................................................................... 2 1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm bệnh ngộ thịt ............................................................. 2 1.1.2 Các dạng bệnh ngộ độc thịt ............................................................................. 4 1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh ngộ độc thịt ............................................... 8 1.2 Tổng quan về vi khuẩn C. botulinum ............................................................... 11 1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn C. botulinum .................................................. 11 1.2.2 Sự phân bố của vi khuẩn C. botulinum .......................................................... 13 1.2.3 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn C. botulinum ............................................... 15 1.2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. botulinum trên thế giới............................. 17 1.2.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. botulinum ở Việt Nam ............................. 17 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................19 2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................... 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cúu ................................................................................... 19 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu ..................................................................................... 19 2.1.3 Thời gian nghiên cứu .................................................................................... 19 2.2. Vật liệu- dụng cụ hóa chất dùng trong nghiên cứu .......................................... 19 2.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ .................................................................................. 19 2.2.2 Vật tư tiêu hao .............................................................................................. 20 2.2.3 Hóa chất, sinh phẩm ..................................................................................... 20 Hóa chất sinh phẩm dùng cho nuôi cấy phân lập.................................................... 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu: ................................................................................ 22 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu ...................................................................................... 22 Nghiên cứu mô tả thực nghiệm và mô tả cắt ngang ................................................ 22 2.3.2 Các kỹ thuật nghiên cứu................................................................................ 22 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ ......................................................................................36 3.1. Kết quả thu thập các loại mẫu ......................................................................... 36 3.2. Kết quả xác định tính chất sinh vật hóa học C. botulinum bằng kit API 20A ... 38 3.3 Kết quả xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR .............................................. 40 3.5. Kết quả giải trình gen ..................................................................................... 45 CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN ....................................................................................50 KẾT LUẬN ..............................................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................58 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ tiếng anh Viết giải nghĩa tiếng việt bp Base pair Đơn vị đo chiều dài của phân tử DNA CDC Centers for Disease Control and Prevention Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh dịch API Analytical Profile Index Hồ sơ định danh vi khuẩn ATCC American Type Culture Collection Bộ chủng chuẩn của Mỹ An toàn sinh học ATSH BHI Brain Heart Infusion Canh thang não tim BoNT Botulinum Neurotoxin Độc tố thần kinh botulinum C. botulinum Clostridium botulinum Vi khuẩn Clostridium botulinum CBI Clostridium botulinum isolation Môi trường phân lập C. botulinum CMM Cooked Meat Medium Môi trường thịt băm EYA Egg York Agar Thạch trứng nhuyễn EYE Egg York Emulsion Lòng đỏ trứng nhuyễn GAM Gifu Anaerobic Medium Môi trường nuôi cấy kỵ khí PFGE Pulsed- Field Gel Electrophoresis Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN TPGY Trypticase Peptone Glucose Yeast extract medium Môi trường TPGY Vi khuẩn kỵ khí VKKK WHO Điện di xung trường World Health Orgnization Tổ chức Y tế thế giới DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cơ chế dẫn truyền thần kinh ở khe synap và cơ chế cắt đứt dẫn truyền thần kinh do botulin ........................................................................................................ 3 Hình 2: Mô hình chuỗi nặng và chuỗi nhẹ độc tố bolulinum .................................... 4 Hình 3: Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn C. botulinum ......................................... 12 Hình 4: Hình ảnh khuẩn lạc trên thạch C. botulinum EYA ..................................... 13 Hình 5: Phản ứng sinh vật hóa học ........................................................................ 28 Hình 6: Sắp xếp index N và S theo thứ tự trên giá ................................................. 31 Hình 7: Đoạn ngắn DNA sau khi gắn index và adapter .......................................... 32 Hình 8: Hình ảnh tạo cluster và giải trình tự read 1 ................................................ 34 Hình 9: Quá trình giải trình tự trên máy Miseq ...................................................... 35 Hình 10: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen độc tố B C. botulinum. ... 41 Hình 11: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen độc tố A C. botulinum .... 41 Hình 12: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 trên thạch máu ................................ 43 Hình 13: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 trên thạch GAM .............................. 43 Hình 14: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 trên thạch Brucella .......................... 44 Hình 15: Hình ảnh nhuộm gram chủng Cbt3F01.................................................... 44 Hình 16: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 trên thạch EYA ............................... 45 Hình 17: Cây phả hệ chủng Cbt3F01 so với các chủng C. botulinum nhóm I, II, III .... 47 Hình 18: Cây phả hệ chủng Cbt3F01 so với các chủng C. tobulinum nhóm I ........ 48 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Báo cáo ca bệnh ngộ độc thịt từ năm 2008 – 2017 tại Mỹ ......................... 6 Bảng 2 .1 Thành phần phản ứng PCR…………………………………….. .............. 29 Bảng 3. 1.Tổng số mẫu các loại đã thu thập……………………………… .............. 36 Bảng 3. 2. Nguồn gốc mẫu mật ong ......................................................................... 36 Bảng 3 3. Nguồn gốc mẫu đất .................................................................................. 37 Bảng 3 .4. Các loại mẫu đồ hộp ............................................................................... 37 Bảng 3 .5. Tỉ lệ phân lập C. botulinum từ các loại mẫu ............................................ 42 Bảng 3. 6. Kết quả định danh chủng C. botulinum bằng bộ kit API 20A .................. 38 Bảng 3 .7. Kết quả xác định loại độc tố bằng phương pháp PCR ............................. 40 MỞ ĐẦU Nha bào vi khuẩn Clostridium botulinum (C. botulinum) có ở trong mật ong, đất có thể là nguồn lây nhiễm vi khuẩn vào thực phẩm và gây ra bệnh ngộ độc thịt. Nhiều nước trên thế giới (Mỹ, Nhật, Đức, Braxin, Thái Lan) đã có báo cáo hàng năm về số liệu ca bệnh ngộ độc thịt. Trung bình mỗi năm ở Mỹ có 70-100 trường hợp ngộ độc thịt được báo cáo, trong số đó khoảng 25% ca bệnh ngộ độc thịt do thực phẩm và 72% ca bệnh ngộ độc thịt ở trẻ sơ sinh [42,45]. Từ năm 1976 đến nay, trên 1500 ca bệnh ngộ độc thịt trẻ em được báo cáo ở hơn 15 quốc gia. Tuy nhiên hiện Việt Nam chỉ có 1 chùm ca bệnh được báo cáo gần đây là vào tháng 9/2020 tại Hà Nội và tháng 3/2021 đều do ngộ độc pate chay. Điều này có thể do thiếu sự quan tâm của các bác sĩ lâm sàng cũng như các nhà nghiên cứu vi sinh học. Thêm vào đó, vi khuẩn C. botulinum là vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối, khó nuôi cấy phân lập. Vi khuẩn này sinh độc tố thần kinh được xem là một trong những độc tố mạnh nhất vì thế nó được xếp vào danh sách tác nhân nguy hiểm nhóm A và bị nghi ngờ sử dụng làm vũ khí sinh học nên nó lại càng khó khăn hơn trong việc đặt mua hoặc chia sẻ chủng vi khuẩn từ các hãng hay tổ chức nghiên cứu quốc tế. Các cơ sở nghiên cứu, bệnh viện, trường học không có chứng dương để tiến hành các nghiên cứu, xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn này, vì vậy nghiên cứu về bệnh ngộ độc thịt tại Việt Nam hầu như bị quên lãng. Bộ Y tế Việt Nam có ban hành các tiêu chuẩn việt nam (TCVN) liên quan đến chẩn đoán vi khuẩn và độ tố vi khuẩn C. botulinum bằng kỹ thuật PCR và Elisa [4,5,6] nhưng trên thực tế không có chứng dương để xác nhận phương pháp. Dựa vào tình hình thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và xác định độc tố vi khuẩn C. botulinum gây bệnh ngộ độc thịt” với các mục tiêu nghiên cứu sau: 1. Nuôi cấy phân lập chủng vi khuẩn kỵ khí C. botulinum từ mẫu môi trường và thực phẩm. 2. Xác định độc tố C. botulinum bằng kĩ thuật PCR và giải trình tự gen. 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về bệnh ngộ độc thịt 1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm bệnh ngộ thịt Bệnh ngộ độc thịt – tên tiếng Anh là “Botulism” – bắt nguồn từ tiếng La tinh “botulus” có nghĩa là “xúc xích” do những ca bệnh đầu tiên phát hiện ở châu Âu có liên quan đến xúc xích sản xuất tại nhà. Tên “botulism” – bệnh ngộ độc thịt có tầm quan trọng về mặt lịch sử nhưng không phản ánh hết nguồn gốc sinh bệnh vì ngày nay nhiều sản phẩm gây bệnh có nguồn gốc thực vật chứ không phải chỉ ở động vật. Bệnh ngộ độc thịt do độc tố (botulin) của trực khuẩn kỵ khí Clostridum botulinum (C. botulinum) gây ra. Độc tố này thuộc loại độc tố thần kinh và là độc tố độc nhất trong các loại độc tố đã biết. Độc tố có thể xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa, qua niêm mạc mắt hoặc niêm mạc đường hô hấp. Sau khi vào cơ thể, độc tố thẩm thấu vào hệ thống tuần hoàn và hệ thống lympho sau đó đến dây thần kinh vận động, gắn không hồi phục vào các đầu mút (receptor) hòa màng của túi Acetycholin và màng cúc tận cùng, ngăn chặn sự giải phóng chất dẫn truyền Acetylcholine từ các đầu dây thần kinh, cắt đứt các dẫn truyền thần kinh, giao tiếp giữa các tế bào thần kinh không được thực hiện, gây liệt các cơ như cơ vận động, cơ hô hấp [24,36]. Độc tố ngộ độc thịt gồm 7 loại (A, B, C, D, E, E, G) gây liệt phản hồi theo cơ chế ức chế sự phóng thích acetylcholine tại các đầu nối thần kinh – cơ, nhưng chúng lại không giống nhau về vị trí gắn kết trên tế bào thần kinh tạo mức độ ức chế giải phóng acetylcholin khác nhau do vậy mức độ biểu hiện bệnh là khác nhau. Chính vì vậy, mức độ nặng nhẹ và thời gian phục hồi của bệnh phụ thuộc vào loại độc tố và lượng độc tố mà bệnh nhân hấp thu vào máu. Bệnh tuy hiếm gặp nhưng thuộc loại bệnh tiến triển cấp tính nên cần chẩn đoán và điều trị kịp thời. 2 Hình 1: Cơ chế dẫn truyền thần kinh ở khe synap và cơ chế cắt đứt dẫn truyền thần kinh do botulin (nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Botulinum_toxin) Triệu chứng lâm sàng điển hình của tất cả các dạng bệnh ngộ độc thịt bao gồm liệt cơ thần kinh trung ương như hiện tượng song thị và giãn đồng tử, chứng loạn vận ngôn, khô miệng, khó nuốt và liệt mặt. Các độc tố này gây liệt mềm nhanh chóng ở người và động vật bằng cách gắn vào đầu mút thần kinh, nếu không điều trị kịp thời sẽ liệt cơ hô hấp và dẫn đến tử vong [36]. Độc tố ngộ độc thịt là một protein lớn có trọng lượng phân tử 150 kDa với hoạt tính của enzym zinc- endopeptidase, gồm 2 tiểu đơn vị là 1 chuỗi nặng và 1 chuỗi nhẹ. Chuỗi nặng trọng lượng 100 kDa là chuỗi có thụ thể đặc hiệu cho độc tố gắn vào và vận chuyển qua màng synap. Chuỗi nhẹ có trọng lượng 50 kDa có vai trò chính trong việc thay đổi cấu trúc protein liên quan tới việc hợp nhất thành màng tiền synap và giải phóng chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine. Phân tử độc tố được tiết ra nguyên bản có chứa cả cấu phần độc tố cũng như cấu phần không độc tố. Cấu phần không độc tố bảo vệ cấu phần độc tố khỏi áp lực môi trường và hỗ trợ cấu phần độc tố thẩm thấu vào cơ thể. Độc tố chịu được nhiệt độ thấp nhưng lại mất hoạt tính ở nhiệt độ cao và môi trường kiềm . Độc tố bị bất hoạt (mất hoạt tính) nếu 3 phơi nhiễm với ánh sáng mặt trời trong vài giờ. Độc tố có thể bị phá hủy khi xử lí với sodium hypoclorit (NaClO) 0,1% hoặc Sodium Hydroxide (NaOH) 0,1N. Độc tố bị phá hủy ở nhiệt độ 500C/30 phút hoặc 800C/20 phút hoặc >850C ít nhất 5 phút. Tuy nhiên độc tố lại không bị phân hủy trong môi trường a xít của dạ dày hay dưới tác dụng của các enzym tiêu hóa (pepsin, tripsin). Sự đề kháng với nhiệt của chúng rất khác nhau phụ thuộc vào thành phần thức ăn hoặc môi trường và nồng độ độc tố [35,36]. Hình 2: Mô hình chuỗi nặng và chuỗi nhẹ độc tố bolulinum (nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Botulinum_toxin) Liều lượng gây độc của độc tố botulinum phụ thuộc vào loại độc tố và đường lây nhiễm. Liều lượng gây chết người của độc tố botulinum chưa được biết nhưng có thể được ước tính thông qua các nghiên cứu về linh trưởng, người ta ước tính, liều gây chết 50% quần thể thử nghiệm (LD50) của độc tố botulin qua đường hít thở và đường uống là 1 – 3ng/kg thể trạng, còn nếu qua được tiêm tĩnh mạch thì chỉ từ 0.25 – 0.5ng/kg thể trạng [35]. 1.1.2 Các dạng bệnh ngộ độc thịt Bệnh ngộ độc thịt có 3 dạng phổ biến là bệnh ngộ độc thịt lây truyền qua thực phẩm, bệnh ngộ độc thịt ở trẻ sơ sinh và bệnh ngộ độc thịt vết thương [36,37,39]. 1.1.2.1 Bệnh ngộ độc thịt lây truyền qua thực phẩm (foodborne botulism) 4 Là hình thức phổ biến nhất được quan sát thấy trên toàn thế giới, do ăn phải thức ăn có chứa độc tố thần kinh. Thức ăn có nha bào C. botulinum sống sót sau khi chế biến, sau đó gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm, sinh trưởng và tạo ra độc tố. Vì thế các thực phẩm đóng hộp hoặc đóng chai (có hàm lượng oxy thấp) được sản xuất tại nhà không được chế biến kỹ lưỡng, bảo quản ở nhiệt độ thấp là những thực phẩm có tiềm năng gây bệnh ngộ độc thịt cao [45]. Vi khuẩn C. botulinum không phát triển trong điều kiện axit (pH nhỏ hơn 4,6), do đó độc tố sẽ không được hình thành trong thực phẩm có tính axit (tuy nhiên, độ pH thấp sẽ không phân hủy được độc tố hình thành từ trước). Sự kết hợp giữa nhiệt độ bảo quản thấp và hàm lượng muối và/hoặc pH cũng được sử dụng để ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn hoặc sự hình thành độc tố trong thực phẩm [45]. Độc tố botulinum được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm, bao gồm các loại rau củ muối bảo quản bằng nồng độ axit thấp, chẳng hạn như đậu xanh, rau bina, nấm và củ cải đường; cá, bao gồm cá ngừ đóng hộp, cá lên men, ướp muối và hun khói; và các sản phẩm thịt, chẳng hạn như giăm bông và xúc xích [8,15]. Bệnh ngộ độc thịt lây truyền qua thực phẩm đặc trưng bởi tình trạng người bệnh tê liệt từ trên cao xuống thấp (liệt từ mặt lan dần xuống các chi), toàn thân tê liệt, sức co cơ bằng 0, cơ thể như bị tiêm thuốc giãn cơ quá liều nhưng đầu óc vẫn hoàn toàn tỉnh táo. Liệt mềm ở cơ hô hấp có thể khiến bệnh nhân khó/không nuốt được, không thở được, mức oxy bão hòa trong máu thấp gây suy hô hấp khiến bệnh nhân tử vong. Các triệu chứng ban đầu bao gồm mệt mỏi, suy nhược và chóng mặt, sau đó thường là mờ mắt, khô miệng, khó nuốt và khó nói. Nôn mửa, tiêu chảy, táo bón, chướng bụng cũng có thể xảy ra. Bệnh có thể tiến triển thành yếu ở cổ và cánh tay, sau đó các cơ hô hấp và cơ vùng hạ vị bị ảnh hưởng. Không sốt và không mất ý thức. Các triệu chứng thường xuất hiện trong vòng 12 đến 36 giờ sau khi tiếp xúc [45]. Tỷ lệ bệnh ngộ độc thịt thấp, nhưng tỷ lệ tử vong cao nếu không được chẩn đoán kịp thời và điều trị thích hợp. Bệnh có thể gây tử vong trong 5 đến 10% trường hợp. 5 1.1.2.2 Bệnh ngộ độc thịt tr s sinh Thường do C. botulinum nhóm I, độc tố loại A, B, Bf và F. Bệnh thường xảy ra ở trẻ sơ sinh dưới 6 tháng tuổi khi trẻ nuốt phải nha bào C. botulinum, sau đó nha bào đã nảy mầm và phát triển sản sinh độc tố trong ruột già. Ở hầu hết người lớn và trẻ em trên 6 tháng tuổi, điều này không xảy ra vì hệ thống phòng thủ tự nhiên của cơ thể giúp ngăn chặn sự nảy mầm và phát triển của nha bào C. botulinum. Bệnh ngộ độc thịt trẻ em gây nôn mửa, táo bón, chán ăn, suy nhược cơ thể, cơ không phát triển, khóc yếu. Nếu không được chữa trị kịp thời, những triệu chứng này có thể phát triển gây tê liệt cánh tay, chân và cơ hô hấp [45]. Ở Mỹ, bệnh ngộ độc thịt ở trẻ sơ sinh là thể phổ biến và thường gặp nhất trong các dạng ngộ độc thịt. Trung bình mỗi năm có 160 ca ngộ độ thịt sơ sinh và tỷ lệ tử vong chung từ 5 – 10% Bảng 1.1. Báo cáo ca bệnh ngộ độc thịt từ năm 2008 – 2017 tại Mỹ [10] Tổng số ca Số ca mắc ở trẻ Tỷ lệ mắc ở trẻ mắc em em 2017 182 141 78 % 2 2016 205 150 73% 3 2015 199 141 71% 4 2014 161 128 80% 5 2013 153 135 88% 6 2012 160 122 76% 7 2011 140 102 73% 8 2010 112 85 76% 9 2009 121 84 69% 10 2008 153 111 73% STT Năm 1 6 Điểm đáng chú ý là trong số bệnh nhân ngộ độc botulinum có tới 72% là trẻ nhũ nhi dưới 1 tuổi. Một nghiên cứu định lượng các mẫu mật ong có khả năng gây bệnh ở Mỹ cho thấy, mỗi gam mật có từ 5-70 nha bào vi khuẩn. Khi trẻ nhũ nhi ăn phải nha bào có trong mật ong, dạ dày của trẻ ít axit, nên các nha bào có điều kiện nảy mầm, phát triển tạo ra độc tố botulinum. Biểu hiện bệnh ở trẻ nhũ nhi cũng khác người lớn. Chưa biết chính xác thời gian khởi bệnh, nhưng khoảng từ 3 – 30 ngày, tính từ thời điểm trẻ ăn phải nha bào. Các dấu hiệu chính gồm yếu cơ (mềm người) và mí mắt có thể rũ xuống lúc nào cũng nhắm như ngủ, đôi khi trẻ táo bón không đi ngoài trong vài ngày, bú kém hoặc bỏ bú, trẻ hay cáu gắt hoặc tiếng khóc bất thường. Giai đoạn muộn trẻ khó thở, suy hô hấp, ngừng thở và tử vong nếu không được điều trị kịp thời [37]. Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã phải đưa ra khuyến cáo trẻ dưới 1 tuổi không nên cho ăn mật ong và các sản phẩm chứa mật ong, bao gồm cả việc bôi mật ong vào núm vú. Châu Âu và các quốc gia phát triển khác ở châu Á cũng đều khuyến cáo như vậy. 1.1.2.3 Bệnh ngộ độc thịt v t th ng Do nha bào C. botulinum dính vào vết thương hở, nảy mầm và phát triển trong vết thương hoặc ổ áp xe ở điều kiện kỵ khí. Triệu chứng của bệnh ngộ độc vết thương giống với triệu chứng của bệnh ngộ độc thịt và thường xuất hiện sau 2 tuần lây nhiễm. Bệnh này thường gặp ở người phải tiêm thuốc nhiều lần trong ngày hoặc những người tiêm bạch phiến hắc lào trong da (injecting black tar heroin) [45]. 1.1.2.4 Các dạng bệnh ngộ độc thịt khác Ngoài 3 dạng bệnh ngộ độc thịt phổ biến kể trên, còn có thể gặp các sau: Bệnh ngộ độc thịt do hít phải độc tố botulinum, trường hợp này rất hiếm và không phải xảy ra một cách tự nhiên, thường là sự kiện cố ý (chẳng hạn như khủng bố sinh học) dẫn đến giải phóng chất độc trong bình xịt. Chứng ngộ độc lây qua đường hô hấp có dấu hiệu lâm sàng tương tự như chứng ngộ độc thực phẩm. Liều gây chết trung bình cho con người ước tính là 2 nanogram độc tố botulinum trên 7 mỗi kg trọng lượng cơ thể, cao hơn khoảng 3 lần so với các trường hợp lây qua thực phẩm. Sau khi hít phải chất độc, các triệu chứng sẽ xuất hiện trong vòng 1-3 ngày, thời gian khởi phát lâu hơn, mức độ nhiễm độc thấp hơn và đỉnh điểm là tê liệt cơ và suy hô hấp. Nếu nghi ngờ có tiếp xúc với chất độc qua đường hô hấp, niêm mạc mắt bằng khí dung thì phải ngăn ngừa tiếp xúc thêm cho bệnh nhân và những người khác. Quần áo của bệnh nhân phải được cởi ra và cất trong túi nhựa cho đến khi có thể giặt kỹ bằng xà phòng và nước. Bệnh nhân nên tắm và được khử độc ngay lập tức. Chứng ngộ độc thịt thể ẩn (Hidden botulism) – còn gọi là chứng ngộ độc ruột hay ngộ độc thịt sơ sinh tuổi trưởng thành, do chứng bệnh này gặp ở người lớn bị ngộ độc thịt nhưng không có nguồn gốc độc tố botulinum rõ ràng, Người ta tìm thấy vi khuẩn Clostridium botulinum trong đường tiêu hóa của những bệnh nhân này, chúng sinh sôi nảy nở và tạo ra chất độc thần kinh. Những bệnh nhân này thường có bất thường về đường tiêu hóa như phẫu thuật trước đó, nhiễm khuẩn achlorhydria, bệnh viêm ruột hoặc sử dụng kháng sinh gần đây … Chứng ngộ độc thịt vô tình (Inadvertent Botulism): là loại bệnh gần đây nhất được cộng đồng y tế công nhận, là dạng bệnh do sử dụng độc tố botulinum để điều trị y tế hoặc xảy ra do nhân viên phòng thí nghiệm tiếp xúc với độc tố. Một báo cáo gần đây về bệnh ngộ độc thịt toàn phát do sử dụng độc tố botulinum trị liệu ở ít nhất 2 bệnh nhân. Ba trường hợp ngộ độc thịt đã được báo cáo ở nhân viên phòng thí nghiệm dường như đã mắc bệnh bệnh do hít phải chất độc này. 1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh ngộ độc thịt Chẩn đoán lâm sàng bệnh ngộ độc thịt có thể được xác định bằng cách phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, gen sinh độc tố của vi khuẩn hoặc độc tố botulinum trong máu, phân hoặc chất nôn của bệnh nhân hoặc thực phẩm nghi ngờ. Các bệnh phẩm thu thập cho mục đích xác định độc tố phải được thu thập trước khi sử dụng thuốc kháng độc tố botulinum cho bệnh nhân [46]. Xác định thực phẩm gây bệnh là quan trọng nhất trong việc ngăn ngừa thêm các trường hợp ngộ độc thịt. Chẩn đoán bệnh ngộ độc thịt thường mất nhiều thời gian và phương pháp chẩn đoán phụ thuộc 8 vào dạng bệnh. Có thể chỉ sử dụng một kỹ thuật nhưng cũng có thẻ phải phối hợp nhiều kỹ thuật cùng lúc. 1.1.1.3.1 Ph ng pháp PCR phát hiện gen sinh độc tố Phát hiện trực tiếp gen sinh độc tố của vi khuẩn C. botulinum bằng cách tách chiết trực tiếp DNA từ mẫu vật hoặc thêm bước tăng sinh nồng độ vi khuẩn trong mẫu bằng cách nuôi cấy trong môi trường TPGY trong điều kiện kỵ khí, canh thang tăng sinh sau đó được tách DNA tổng số. DNA thu được sau đó được dùng làm DNA khuôn mẫu trong phản ứng PCR phát hiện gen sinh độc tố. Sơ đồ quy trình phát hiện gen sinh độc tố của vi khuẩn C. botulinum bằng phương pháp PCR như sau [6,27]: 9 1.1.3.2 Ph ng pháp nuôi cấy phát hiện vi khuẩn Để đáp ứng nhanh cho quá trình chẩn đoán, mẫu bệnh phẩm dùng cho nuôi cấy phát hiện vi khuẩn C. botulinum thường được cấy trực tiếp lên môi trường chọn lọc CBI, đồng thời cấy tăng sinh nồng độ vi khuẩn trong môi trường TPGY. Các mẫu nuôi cấy được ủ kỵ khí và đọc kết quả sau 40 -18 giờ sau nuôi cấy. Nếu mẫu cho kết quả âm tính, mẫu vẫn phải được theo dõi thời gian nuôi cấy kỵ khí đủ 7 ngày. Sau 7 ngày nuôi cấy, mầu vẫn cho kết quả âm tính, lúc đó mới khẳng định là mẫu âm tính [5]. Các khuẩn lạc nghi ngờ C. botulinum trên thạch CBI được định danh bằng các phương pháp khác nhau như PCR phát hiện gen sinh độc tố, phương pháp xác định tính chất sinh vật hóa học bằng kit Api20A. 1.1.3.3 Ph ng pháp Elisa phát hiện độc tố botulin Phương pháp này được dùng để phát hiện các độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F trong các môi trường nuôi cấy tăng sinh TPGY và CMM. Các độc tố trong môi trường bị bắt giữ bởi các kháng thể immunoglobin G (IgG) đã được phủ trên các đĩa vi và được phát hiện bằng cách sử dụng các IgG đã biotinyl hóa và các chất cộng hợp phosphatase kiềm. Enzym gắn kết với kháng thể sau đó được quan sát bằng cách sử dụng cơ chất được khuếch đại. Phép thử dương tính là khi có giá trị độ hấp thụ > 0,2 trên giá trị độ hấp thụ quan sát được trong các giếng chứng âm [4,5]. 1.1.3.4 Ph ng pháp thử nghiệm trên động vật Huyết thanh, dịch tiết dạ dày, phân hoặc thức ăn của bệnh nhân được pha loãng trong dung dịch đệm phosphate và tiêm vào màng bụng của chuột thí nghiệm. Sau đó chuột được theo thời điểm xuất hiện các triệu chứng giống ngộ độc botulism như: lông xơ, yếu cơ và suy hô hấp…. Các triệu chứng được ghi chép và so sánh triệu chứng của nhóm chuột đối chứng (chứng âm - chuột khỏe mạnh, và chuột chứng dương (chuột được tiêm độc tố). Trong quá trình theo dõi sức khỏe của chuột thử nghiệm, người ta có thể tiêm thêm cho chuột nhiễm bệnh kháng độc tố botulism. Các triệu chứng ngộ độc botulism sẽ hết khi chuột nhiễm bệnh nhận được 10 chất kháng độc tố phù hợp [15]. Kỹ thuật xét nghiệm này tốn nhiều công sức và nguồn lực. Do vậy, chỉ có một số ít phòng thí nghiệm y tế hiện đại mới có thể thực hiện thử nghiệm này [19]. 1.2 Tổng quan về vi khuẩn C. botulinum 1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn C. botulinum C. botulinum là trực khuẩn kỵ khí, có khả năng di động và sinh nha bào. Nha bào hình oval, ở gần đầu nên làm cho tế bào phồng lên. Trên tiêu bản nhuộm gram, vi khuẩn bắt màu gram dương, kích thước dao động tùy từng nhóm. Dựa vào đặc điểm huyết thanh của độc tố sinh ra, độc tố thần kinh của C. botulinum được chia thành 8 loại độc tố kí hiệu bằng các chữ từ A đến G và một số subtype. Có chủng sinh cả hai loại độc tố và có chủng sinh một loại độc tố nhưng mang gen lặn của độc tố khác. Loài Clostridia khác là C. butyricum cũng sinh độc tố E và C. baratii sinh độc tố F. Bệnh ngộ độc thịt ở người thường do các chủng sinh độc tố A, B, E hoặc F gây ra. Độc tố A có xu hướng độc hơn độc tố B, E và thời gian gây bệnh dài hơn [13 . Còn dựa vào kiểu hình và kiểu gen, C. botulinum chia thành 4 nhóm đánh số từ I-IV. Nhóm I, II là nhóm gây bệnh trên người, nhóm III thường gây bệnh trên động vật – nhưng cũng có trường hợp ngoại lệ. Nhóm IV thường không gây bệnh vì vậy nhóm IV đã được đề nghị đổi tên thành vi khuẩn Clostridium argentinense. C. botulinum nhóm I sinh độc tố loại A, B, E và nhóm II sinh độc tố B, E, F. Thông thường, C. botulinum ở nhóm I là nhóm có khả năng li giải protein và sinh enzym endogenous có khả năng phân tách phân tử độc tố. Còn nhóm II là nhóm không li giải protein, phân tử độc tố thần kinh cần những protease khác (như trypsin) để hoạt hóa hệ thống enzym. Nhóm I hoặc nhóm II đều liên quan đến nguy cơ mất an toàn thực phẩm nhưng nha bào của C. botulinum nhóm I có khả năng chịu nhiệt cao hơn nha bào của nhóm II, nhóm I sinh trưởng tốt ở nhiệt độ gần với nhiệt độ cơ thể (370C) trong khi đó C.botulinum nhóm II sinh trưởng tốt ở nhiệt độ dưới 300C và bị hạn chế ở nhiệt độ 370C. C. botulinum nhóm I thường liên quan đến 11