Tài liệu Pcr và một số kỹ thuật y sinh học phân tử sách đào tạo sau đại học y dược

A ___ Bỏ YTẼ VA MỌT SO KY THUẠT Y SINH HỌC PHÂN TỬ ■ (Sách đào tạo sau đại học y dược) Chủ bỉên: PGS.TS. TẠ THÀNH VÀN HQGHN 72 R 0 )0489 Ỹ NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC * __ a ' BỘ Y TÊ PCR VÀ MỘT ■ SỐ KỸ THUẬT ■ Y SINH HỌC PHÂN TỬ ■ Sách đào tạo sau đại học y dược Mã số: Đ.01.Y.06VV Chủ biên: PGS. TS. TA THÀN H VĂN NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC ■ HÀ N Ộ I- 2 0 1 0 ■ CHÍ ĐẠO BIẼN SOẠN: Vụ Khoa học và Đào tạo, Bộ Y tê CHỦ BIÊN: PGS. TS. Tạ Thành Văn NHỮNG NGƯỜI BIÊN SOẠN: PGS. TS. Tạ Thành Văn THAM GIA TỔ CHỨC BẢN THẢO: ThS. Phí Văn Thâm TS. N gu yển Mạnh Pha © Bản quyền thuộc Bộ Y tê (Vụ Khoa học và Đào tạo) LỜI GIỚI THIỆU ■ Đào tạo nguồn nhân lực cán bộ chất lượng cao là một trong những môi quan tâm hàng đầu của ngành Y tế. Song song vỏi việc đầu tư cơ sơ vật chất cho các cơ sơ đào tạo, Bộ Y tế đã đặc biệt chú trọng tăng cương các phương tiện dạy vè học, trong đó việc biên soạn giáo trình, tài liệu giảng dạy đặc biệt ưu tiên. Sách “PCR và một sô kỹ th u ật y sinh học phân tử” này được biên soạn nhằm phục vụ chủ yếu cho việc đào tạo sau đại học trong các Trường đại học Y, Dược dựa trên chương trình khung của Trường Đại học Y Hà Nội nhưng cũng là tài liệu đề đào tạo đại học và tham khảo, tự học cho các nghiên cứu viên làm việc trong lĩnh vực y sinh. Bên cạnh những kiến thức lý thuyết và nguyên lý cơ bản của các kỹ th u ậ t y sinh học phân tử, cuốn sách còn cung cấp những quy trình kỹ th u ậ t cụ thể hướng dẫn cho những người bắt đầu triến khai các kỹ th u ậ t chuyên sâu này. Cuốn sách này được biên soạn bởi PGS. TS. Tạ Thành Văn, một nhà khoa học giàu kinh nghiệm trong lĩnh vực Hóa sinh học phân tử và tế bào. Sách đã được Hội đồng chuyên môn của Bộ Y tê thẩm định theo Quyêt định sô 928/QĐ BYT ngày 22 tháng 3 năm 2010 gồm các chuyên gia thuộc các chuyên ngành Hóa sinh, Miễn dịch, Sinh lý bệnh, Vi sinh và Sinh học. Cuốn sách được ban hành làm tài liệu sử dụng chính thức phục vụ đào tạo đại học và sau đại học của ngành Y tế. Đồng thòi cuốn sách cũng sẽ là tài liệu tham khảo hữu ích cho các cán bộ làm việc trong các phòng thí nghiệm, phòng xét nghiệm y sinh. Bộ Y tế xin chân thành cảm ơn GS. TSKH. Phan Thị Phi Phi, Chủ tịch Hội đồng thẩm định, GS. TS. Phùng Đắc Cam và PGS. TS. Nguyễn Thị Hà, ủy viên phản biện và các ủy viên Hội đồng đã đọc, đóng góp nhiều ý kiến quý báu đê cuôn sách được hoàn thiện. Đây là lần xuất bản đầu tiên, cuốn sách chắc chắn sẽ được chỉnh lý, bổ sung và cập n h ật trong những lần xuất bản tiếp sau. Chúng tôi mong nhận được ý kiến đóng góp của đồng nghiệp và các độc giả để sách được hoàn chỉnh hơn cho những lần xuất bản sau. VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y T Ế 3 LỜI MỞ ĐẦU Các kỹ th u ậ t sinh học phân khoa học làm việc trong lĩnh vực gen người được hoàn tất, các kỹ trong y học và phát huy hiệu quả trị và phòng bệnh. tử là một công cụ đặc biệt hữu ích cho các nhà công nghệ sinh học. Kê từ khi việc giải mã bộ thuật này ngày càng được ứng dụng rộng rãi to lốn trong chẩn đoán, theo dõi hiệu quả điều Cuôn sách “PCR uà một sô kỹ thuật y sinh học phân tử ' này được biên soạn dành cho các nghiên cứu viên, sinh viên bậc đại học và sau đại học thuộc các chuyên ngành khác nhau trong lĩnh vực y sinh. Cuốn sách cung cấp cho các dộc giả không chỉ những kiến thức lý thuyết cơ bản, nguyên lý, triển vọng ứng dụng của PCR và các kỹ th u ật y sinh học phân tử khác, mà còn cung cấp những quy trình kỹ th u ật cụ thê hướng dẫn cho những người bắt đầu triển khai các kỹ th u ậ t chuyên sâu này. Nội dung cuốn sách để cập đến những lĩnh vực mà các kỹ th u ật sinh học phân tử chuyên biệt đang được áp dụng. Các độc giả có thể tìm thấy trong cuốn sách này những kiến thức khoa học chuyên sâu, cơ sỏ lý luận khoa học của việc thiết lập các quy trình kỹ thuật, từ đó mỗi cán bộ khoa học có thê tự điểu chỉnh, thay đổi, cải tiến các quy trình này sao cho phù hợp vối từng mục đích và điều kiện của từng phòng thí nghiệm để phát huy tối đa hiệu quả trong nghiên cứu khoa học cũng như trong hoạt động chuyên môn thường quy của mình. Vối tất cả nội dung được trình bày, cuốn sách sẽ là tài liệu học tập, tham khảo cho các cán bộ khoa học thuộc các chuyên ngành Kỹ th u ật Y học, Hóa sinh, Sinh học, Miễn dịch học, Vi sinh của các Trường đại học Y Dược, Trường đại học Tổng hợp và các Viện nghiên cứu. Với tốc độ phát triển rất nhanh của công nghệ sinh học trong những năm gần đây, đặc biệt là các kỹ th u ật sinh học phân tử ứng dụng trong y học, trong khuôn khô cuốn sách này, tác giả không hướng tối mục đích mô tả chi tiêt tất cả các quy trình kỹ th u ậ t cũng như các ứng dụng khác nhau của PCR nói riêng và của các kỹ th u ậ t sinh học phân tử nói chung. Tuy nhiên, có thê nói những kiến thức được trình bày ở đây là những kiến thức nền cơ bản nhất, mà thường những kỹ th u ậ t dù mới th ế nào đi chăng nữa cũng đểu dựa trên những nguyên tắc khoa học này. Tác giả xin bày tỏ sự biết ơn tói các đồng nghiệp đã dành thời gian đọc bản thảo và góp ý chi tiết về nội dung, cũng như cách trình bày, các cán bộ của Vụ Khoa học và Đào tạo, Bộ Y tế, Nhà xuất bản Y học đã giúp đỡ tác giả trong quá trình hoàn thiện cuốn sách này. Hà Nội, ngày 01 tháng 3 năm 2010 PGS. TS. TẠ THẢNH VĂN 5 MỤC LỤC ■ ■ Lời giới thiệu 3 Lời mở đầu 5 Chương I. N hững kiến thức cơ bản chu ng A. Thành phần hóa học và cấu trúc acid nu cleic 11 11 1. Thành phần hóa học của acid nucleic 11 2. Cấu trúc hóa học của acid nucleic 13 2.1. Cấu trúc của acid deoxyribonucleotid (DNA) 13 2.1.1. Cấu trúc xoắn kép 13 2.1.2. Cấu trúc Watson-Crick (B-DNA) 13 2.1.3. Các dạng cấu trúc xoắn khác của acid nucleic 14 2.1.4. Các lực hóa học và cấu trúc làm bền vững cấu trúc acid nucleic 2.1.5. Sự biến tính th u ận nghịch 1.2. Cấu trúc của acid ribonucleic (RNA) 15 16 17 1.2.1. Cấu trúc RNA 17 1.2.2. Các loại RNA 17 B. Câu trúc gen và các yếu tô điểu hòa hoạt động của gen ở tê bào có nhân 18 1. Gen điều khiển và gen tăng cường 19 1.1. Một số phức hợp gen tăng cường 20 1.1.1. Phức hợp gen tăng cường có nguồn gốc virus 20 1.1.2. Phức hợp gen tăng cường có nguồn gốc tế bào 22 1.2. Gen điều khiển và gen tăng cường cảm ứng 22 1.3. Cơ chế hoạt động của gen tăng cường 22 2. Môi tương tác giữa gen điều khiển và intron 23 3. Các tín hiệu thoái hóa của mRNA và quá trình polyadenin hóa 24 4. Kiểm soát quá trình sao chép 25 5. Các hiện tượng liên quan 26 Chương II. Giới th iệu c h u n g về kỷ th u ậ t PCR 28 1. Giối thiệu chung: PCR, một máy photocopy 28 7 2. Lịch sử của kỹ th u ật PCR 28 3. Kỹ thuật PCR liên quan đến quá trình sao chép DNA 29 4. PCR được điều khiển bởi nhiệt độ 30 5. Liệu kỹ th uật PCR có thê thay thê được kỹ thuật tạo dòng gen? 31 6. ứ n g dụng của kỹ th u ậ t PCR 32 Chương III. N guyên tắc của kỹ thuật PCR 33 1. Kỹ thuật PCR được tiến hành như th ế nào? 33 2. Triển vọng ứng dụng của PCR 35 3. DNA khuôn là bộ gen hoặc một phần bộ gen của tê bào 36 4. Động học của phản ứng PCR 37 4.1. Những chu kỳ đầu (E) 38 4.2. Những chu kỳ giữa (M) 38 4.3. Những chu kỳ cuối và độ bão hòa (L) 39 5. Phân tích sản phẩm PCR 39 Chương IV. Hóa chất và th iết bị 40 1. Những ưu điểm của kỹ thuật PCR 40 2. Các dung dịch phản ứng 40 3. Dung dịch đệm PCR 40 3.1. Tris-HCl 3.2. KC1 41 41 3.3. MgCl2 41 4. Nucleotid 42 5. Hỗn hợp dung dịch PCR trộn trước (PCR premix) 6. Đoạn oligonucleotid mồi 43 43 6.1. Nhiệt độ nóng chảy (Tm) 45 6.2. Mồi được đánh dấu ỏ đầu 5’ 46 6.3. Khuếch đại gen đích nhò hỗn hợp các mồi 47 6.4. Nồng độ mồi 47 7. DNA polymerase 7.1. DNA polvmerase bển với nhiệt 7.2. Đặc tính của Taq DNA polymerase 48 7.3. Một số loại Taq DNA polymerase thương mại 49 7.4. Một sô loại DNA polymerase bền vối nhiệt có hoạt tính sửa chữa 50 8. Acid nucleic khuôn 8 48 48 50 9. Vật tư tiêu hao 51 10. Máy tạo chu kỳ nhiệt cho PCR 51 11. Xây dựng hệ thống phòng xét nghiệm sinh học phân tử 51 11.1. Phòng tách chiết DNA/RNA 51 11.2. Phòng chuẩn bị Mastermix 52 11.3. Phòng bố sung khuôn 52 11.4. Phòng đặt máy RCR/Realtime PCR 52 11.5. Phòng điện di 52 Chương V. Phân tích sản phẩm PCR 54 1. Điện di (Electrophoresis) 54 2. Southern và dot blot 56 3. PCR lồng 57 4. Sử dụng enzym cắt giới hạn 59 5. Giải trình tự gen trực tiếp 60 6. Đánh dấu trực tiếp sản phẩm PCR 61 7. Kỹ thuật miễn dịch 62 8. Kỹ thuật điện hóa phát quang 62 9. Realtime PCR và PCR định lượng 63 10. Phương pháp MLPA (multiplex ligation-dependent probe ampliíication) 66 11. Biểu hiện sản phẩm PCR in vitro 68 12. Một sô vấn đề kỹ th u ật cần lưu ý khi đọc và phân tích kết quả PCR 69 Chương VI. Tinh sạch và tách dòng sản phẩm PCR 73 1. Tinh sạch sản phẩm PCR 73 1.1. Tủa bằng ethanol 73 1.2. Gắn vào gel (In-gel ligation) 74 1.3. Tinh chê bằng cột và ly tâm (Spin columns) 74 1.4. Điện di đẩy (Electroelution) 74 1.5. Tinh chê bằng hỗn hợp silica hoặc glassmilk 75 1.6. Sử dụng các kit thương mại 75 2. Tách dòng sản phẩm PCR 75 2.1. Các vector tách dòng 76 2.2. Phân tích các clon mang DNA đích 79 Chương VII. Các phương pháp phân tích bộ gen 80 1. Phân tích cấu trúc đa hình thái chuỗi đơn 81 9 1.1. Nguyên tắc 81 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự di chuyến của sợi đơn DNA 83 2. Phản ứng nối chuỗi 84 2.1. Nguyên tắc 84 2.2. Một sô đặc điểm của kỹ th u ật LCR 85 3. Hệ thống khuếch đại các đột biến bên với nhiệt 86 4. Khuếch đại phân đoạn cấu trúc đa hình thái 87 5. P hân tích kiểu gen “một ông nghiệm Tm" 88 6. Phương pháp sử dụng enzym giới hạn phân tích chuỗi gen đa hình thái 90 7. Khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình thái 91 8. Phân tích thê đa hình thái A lu bằng PCR đa mồi 92 9. Phân tích sự lặp lại của minisatelite 93 10. Microsatelite 95 Chương VIII. Các quy trình kỹ th uật sinh học phân tử 97 Quy trình 2.1. Quy trình cơ bản của PCR 97 Quy trình 3.1. Phosphoryl hóa đầu 5 của chuỗi oligonucleotid 99 Quy trình 3.2. Tách chiết genomic DNA từ mô thực vật 100 Quy trình 3.3. Chuẩn bị DNA khuôn 101 Quy trình 3.4. Tách chiết DNA sử dụng proteinase K 103 Quy trình 4.1. Southern blotting Quy trình 4.2. Giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 105 107 Quy trình 4.3. Giải trình tự gen 108 Quy trình 5.1. Tạo các phân đoạn PCR đầu tù 110 Quy trình 5.2. Tủa sản phẩm DNA bằng ethanol 111 Quy trinh 5.3. Biến nạp DNA vào hệ vi khuẩn 112 Quy trình 6.1. Quy trình sao chép ngược 114 Quy trình 6.2. Thu hồi DNA từ gel đã khô 115 Quy trình 6.3. Khuếch đại nhanh cDNA từ đầu tận (5’-RACE) 116 Quy trình 6.4. Cô định lát cắt mô vào phiến kính 118 Tài liệu tham khảo 120 10 Chương I NHỮNG KIẾN THỨC c ơ BẢN CHUNG A. THÀNH PHẨN HÓA HỌC VÀ CẤU TRÚC ACID NUCLEIC ■ Nucleotid là những hợp chất sinh học tham gia vào nhiều các quá trình chuyên hóa của tế bào. Chúng là phương tiện dự trữ và vận chuyển năng lượng, là sự đáp ứng hóa học của tê bào đối với các hormon và các chất kích thích ở khoảng gian bào, là th àn h phần cấu trúc của các coenzym hay các chất chuyển hoá trung gian. Song điều quan trọng nhất phải kế đến là nucleotid chính là th àn h phần cấu tạo nên các acid nucleic: acid deoxyribonucleic (DNA) và acid ribonucleic (RNA), cơ sỏ vật chất của thông tin di truyền. 1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ACID NƯCLEIC Cấu trúc hóa học của acid nucleic được Phoebus Levine và Alexander Todd đưa ra trong những năm đầu của những năm 50 của th ế kỷ trước. Acid nucleic là các chuỗi polymer thang (phổ biến) của nucleotid nôi vối nhau bằng cầu nôi phosphat ở vị trí 3’ và 5’ của hai phân tử đường liên tiếp. I---------------- iiì; --------------— — " adenine 5' end ũ 0 — p — 0 — CH ' 0 — p — 0 — (etc) nucleic aciđ Q 3' end H ình 1.1. Thành phần và mô hình cấu trúc của dinucleotid (adenyl-3’ , 5’-cytidyl-3’, '-phosphat (ACp)) 11 (a) Base *o3po- Base *03P 0 -ró 2 ^0 ch2^ o OH - Xem thêm -