Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của loài nàng nàng (callicarpa candicans) và loài tử châu lá to (callicarpa macrophylla) ở việt nam tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …………***………… VŨ THỊ THU LÊ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI NÀNG NÀNG (CALLICARPA CANDICANS) VÀ LOÀI TỬ CHÂU LÁ TO (CALLICARPA MACROPHYLLA) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 9.44.01.17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2020 Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Thị Hồng Minh Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2. GS.TS. Phạm Quốc Long Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Phản biện 1: PGS. TS. Phan Minh Giang Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Phản biện 2: TS. Đỗ Hữu Nghị Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Luận án đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Số 18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội. Vào hồi ….. giờ…. ngày ….. tháng …. năm 2020 Có thể tìm luận án tại thư viện Quốc gia Việt Nam và thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có nguồn thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loài dược liệu quý. Việc sử dụng các loại thảo dược theo y học cổ truyền hay từ các hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học. Những bài thuốc sử dụng thảo dược là đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên, các kết quả nghiên cứu sẽ góp phần giải thích rõ hơn về tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền vẫn hay được sử dụng trong dân gian Trên thế giới những nghiên cứu về các loài chi Callicarpa chủ yếu tập trung nghiên cứu về: thực vật học, dược lý, hóa thực vật và lâm sàng của nó. Nghiên cứu dược lý được thực hiện trên dịch chiết thô hoặc các hợp chất tinh khiết cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng truyền thống. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học chủ yếu tập trung vào các hoạt tính: kháng viêm, cầm máu, mất trí nhớ, oxi hóa, kháng khuẩn. Những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới chỉ ra rằng, các hợp chất diterpenoid và triterpenoid có hoạt tính chống ung thư rất tốt mà các hoạt chất này là thành phần hóa học phong phú nhất trong chi Callicarpa. Việc nghiên cứu nhằm tìm ra những hoạt chất có ích của thực vật đã và đang nhận được sự quan tâm của giới khoa học nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Đây cũng là lý do đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla ) ở Việt Nam.” được lựa chọn để nghiên cứu. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án  Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ loài C. candicans và loài C. macrophylla thu hái ở Việt Nam.  Đánh giá hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư: gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) của các hợp chất sạch phân lập được.  Nghiên cứu thành phần hóa học trong tinh dầu loài C. candicans và loài C. macrophylla 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án 2 1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ lá loài C. candicans và loài C. macrophylla ở Việt Nam 2. Xác định thành phần hóa học tinh dầu của lá loài C. candicans và loài C. macrophylla ở Việt Nam bằng các phương pháp chưng cất lôi quấn hơi nước thông thường và phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng. 3. Đánh giá hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào ung thư (gan HepG2, tiền liệt tuyến - PC3, phổi - A549) và kháng vi sinh vật kiểm định in vitro của tinh dầu thu được từ lá loài C. candicans và loài C. macrophylla . 4. Đánh giá hoạt tính gây độc trên ba dòng ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) in vitro của các hợp chất sạch phân lập được từ lá loài C. candicans và loài C. macrophylla CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Phần tổng quan tài liệu là tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề: 1.1. Đặc điểm chung về thực vật học chi Callicarpa 1.2. Tác dụng dược lý của chi Callicarpa 1.3. Thành phần hóa học các thực vật chi Callicarpa 1.4. Hoạt tính sinh học các thực vật chi Callicarpa Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phần này mô tả chi tiết các quá trình xử lý mẫu, phương pháp tạo cặn chiết, sắc ký và phân lập các hợp chất; xác định thành phần hóa học của tinh dầu và các phương pháp thử hoạt tính sinh học. 2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Mẫu thực vật Lá, thân cành và quả loài Nàng nàng (Callicarpa candicans (Burm.f.) Hochr.) và Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla Vahl) thu tại huyện Tam Đảo – Vĩnh Phúc vào tháng 10/2015 và huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 10 năm 2017, được TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam - VAST) xác định tên khoa học, mẫu số tiêu bản lưu tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam. 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu cây 3 Việc phân tích, phân tách các phần dịch chiết của cây được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck), sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là YMC RP 18 (Merck), sắc ký dây phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20 (Merck) và sắc ký điều chế pha tĩnh là silica gel. 2.1.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại như: điểm nóng chảy (Mp), độ quay cực ([α]D), sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESIMS), phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân gồm phổ 1 chiều (1H-, 13 C-NMR và DEPT) phổ 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC và NOESY). 2.2. Phương pháp chiết xuất tinh dầu 2.2.1. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước dùng bộ cất tinh dầu vi lượng 2.2.2. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng 2.2.3.Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu Xác định thành phần hóa học của tinh dầu bằng cách kết hợp hệ thống máy GC –MS với thư viện phổ chuẩn và phần mềm khóa thời gian lưu Mass Finder 4.0. 2.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học Hoạt tính gây độc tế được thử nghiệm bằng phương pháp SRB trên ba dòng ung thư: gan (Hep-G2), phổi (LU-1) và vú (MCF-7) và phương pháp MTT [3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide] trên ba dòng ung thư gan (Hep-G2), tiền liệt tuyến (PC3) và phổi (A549). Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane & Kandel (1996) trên 8 chủng: Vi khuẩn Gram, nấm sợi và nấm men. Các thử nghiệm được thực hiện tại tại Phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, VAST. 4 Chương 3. THỰC NGHIỆM Phần thực nghiệm đã mô tả chi tiết các quá trình: Xử lý mẫu và phân lập các chất sạch từ lá 2 loài Tử châu lá to (C. macrophylla) và Nàng nàng (C. candicans); Hằng số vật lí và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ 2 loài được nghiên cứu. 3.1. Lá cây Tử châu lá to (C. macrophylla) 3.1.1. Thu nhận các dịch chiết từ lá cây Tử châu lá to Quá trình xử lý mẫu lá cây Tử châu lá to Sơ đồ 3.1. Sơ đồ ngâm chiết lá cây Tử châu lá to (C. macrophylla) 3.1.2. Phân lập, tinh chế các chất từ các cặn chiết lá Tử châu lá to Quá trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane và ethyl acetate của lá cây Tử châu lá to như Sơ đồ 3.2 Sơ đồ 3.2. Phân lập cặn n-hexane và ethyl acetate lá cây Tử châu lá to 3.2. Lá cây Nàng nàng (C. candicans) 5 3.2.1. Thu nhận các dịch chiết từ lá cây Nàng nàng Quá trình xử lý mẫu lá cây Nàng nàng như Sơ đồ 3.3. Sơ đồ 3.3. Sơ đồ ngâm chiết lá cây Nàng nàng (C. candicans) 3.2.2. Phân lập, tinh chế các chất từ các cặn chiết lá Nàng nàng Quá trình phân lập các hợp chất từ cặn n-hexane và ethyl acetate lá cây Nàng nàng như Sơ đồ 3.4 Sơ đồ 3.4. Sơ đồ phân lập cặn n-hexane và ethyl acetate của lá cây Nàng nàng Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương 4 trình bày về cách xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được, thành phần hóa học của tinh dầu và kết quả thử hoạt tính sinh học của các thành phần. 4.1. Thành phần hóa học tinh dầu cây Nàng nàng và Tử châu lá to Phân tích GC - MS trong thành phần lá khô Nàng nàng có 39 cấu tử, chiếm 92,57% tổng hàm lượng. Trong đó có 25 sesquiterpene 6 hydrocacbon (62,98%) và 11 sesquiterpen có chứa oxi (22,46%). Cấu tử chính được xác định trong tinh dầu là α-Gurjunene (21,97%). Trong tinh dầu của lá cây Nàng nàng tươi có 47 cấu tử được phát hiện chiếm 93,17% tổng hàm lượng tinh dầu. Trong số đó, có 28 sesquiterpene hydrocarbon (69,84%), 12 sesquiterpen (16,50%). Trong đó, cấu tử chiếm hàm lượng lớn nhất là α-gurjunene (21,31%) Thành phần hóa học tinh dầu từ hoa Nàng nàng cho biết có tổng 47 cấu tử, chiếm 92,86% tổng hàm lượng. Các cấu tử có hàm lượng cao được xác định trong tinh dầu hoa là. Các cấu tử có hàm lượng chính được xác định trong tinh dầu hoa cây Nàng nàng là Ecaryophyllene (5,07%), α- selinene (5,66%), δ-cadinene (5,44%). Thành phần hóa học tinh dầu lá tươi cây Tử châu lá to phát hiện có 50 cấu tử, chiếm 90,59% tổng hàm lượng. Cấu tử chính được xác định trong tinh dầu là Phytol (11,03%). 4.2. Các hợp chất phân lập được từ lá Tử châu lá to và Nàng nàng Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Tử châu lá to 10 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, gồm 7 hợp chất terpenoid: callimacrophylla B (M8), 3βhydroxyolean-12-ene (M2), β-amyrin (M3), ursolic acid (M6), oleanolic acid (M10), callimacrophylla A (M1) và ent-1β-acetoxy7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) và 3 hợp chất steroid: spinasterol (M5), β-sitosterol (M4) và daucosterol (M9). Trong đó, callimacrophylla A (M1) và callimacrophylla B (M8) là hai hợp chất mới. Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Nàng nàng (C. candicans) 11 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, gồm 4 hợp chất flavonoid: 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1), 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3), Hợp chất genkwanin (C9) và cynaroside (C10); 5 hợp chất terpenoid: ursolic acid (M6), 2α-hydroxy-ursolic acid (C7), 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8), seco-hinokiol (C5) và methyl seco-hinokiol (C6) và 2 hợp chất steroid: β-sitosterol (M4) và daucosterol (M9). Trong đó, hợp chất methyl seco-hinokiol lần đầu phân lâp được từ tự nhiên. Thành phần hóa học chính của 2 loài thực vật chi Callicarpa được nghiên cứu chủ yếu là các hợp chất flavonoid, diterpennoid và 7 triterpenoid. Một số hợp chất phân lập được giống nhau ở hai loài như: ursolic acid, β-sitosterol và daucosterol. Các hợp chất triterpenoid phân lập được từ 2 loài nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học chính là các hợp chất khung ursane và oleane, phù hợp với thành phần hóa học chính của các hợp chất triterpenoid trong chi Callicarpa trong các tài liệu đã công bố. Các hợp chất diterpene phân lập được từ 2 loài nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học chính là các hợp chất khung ent-kaurane và abietane, phù hợp với thành phần hóa học chính của các hợp chất diterpenoid trong chi Callicarpa trong các tài liệu đã công bố. Các hợp chất phân lập được từ lá 2 loài nghiên cứu Bảng 4.26. Các hợp chất phân lập được từ 2 loài nghiên cứu Tên hợp chất callimacrophylla A (M1) ent-1α-acetoxy-7β,14 α-dihydroxy-kaur16-en-15-on (M7) seco-hinokiol (C5) methyl seco-hinokiol (C6) 3β-hydroxyolean-12-ene (M2) Diterpneoid C. macrophylla KL Tính (mg) mới 10,8 M Diterpenoid C. macrophylla 12,5 H Diterpenoid C. candicans Diterpenoid C. candicans Triterpenoid C. macrophylla 22,8 31,0 10,3 H H L Lớp chất Loài phân lập 8 β-amyrin (M3) ursolic acid (M6) callimacrophylla B (M8) 2α-hydroxy-ursolic acid (C7) 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8) oleanolic acid (M10) spinasterol (M5) Triterpenoid C. macrophylla C. macrophylla Triterpenoid C. candicans Triterpenoid C. macrophylla Triterpenoid C. candicans 12,7 15,5 15,7 10,1 12,5 L L L M L Triterpenoid C. candicans 11,5 L Triterpenoid C. macrophylla Steroid C. macrophylla Steroid C. macrophylla β–sitosterol (M4) C. candicans C. macrophylla daucosterol (M9) Steroid C. candicans 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1) Flavonoid C. candicans 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3) Flavonoid C. candicans genkwanin (C9) Flavonoid C. candicans cynaroside (C10) Flavonoid C. candicans 8,5 11,2 20,0 19,0 16,5 8,5 11,2 13,0 10,8 M: Hợp chất mới; L: Lần đầu tiên phân lập từ loài; H: Lần đầu tiên phân lập từ họ Hai hợp chất mới thu được gồm 1 chất thuộc lớp chất diterpenoid và triterpenoid. Chúng được xác định cấu trúc dựa trên các dữ liệu phổ như sau: 4.2.1.1. Hợp chất callimacrophylla A (M1) – Hợp chất mới Hợp chất M1 thu được dưới dạng tinh thể trắng. Công thức phân tử của hợp chất M1 được xác định là C20H28O5 dựa trên sự xuất hiện của các píc ion giả phân tử trên phổ khối lượng phân giải cao HRESI-MS tại m/z 387,1940 [M + 35Cl] (tính toán lý thuyết cho C20H32O535Cl: m/z 387,1938) và m/z 389,1918 [M + 37Cl] (tính toán lý thuyết cho C20H32O537Cl: 389,1909). Hình 4.7. Phổ ESI-MS của M1 Phổ H-NMR của hợp chất M1 cho thấy sự xuất hiện hai tín hiệu dưới dạng singlet của 2 nhóm methyl [H 0,65 (3H, s, H3-19) và 1,02 (3H, s, H3-20)], 1 nhóm oxymethine [H 3,62 (1H, dd, J = 10,5; 5,5 1 L L L L L 9 Hz, H-7)], tín hiệu của 2 nhóm oxymethylen [H 2,85 (1H, dd, J = 10,5; 5,0 Hz, Ha-18); 3,18 (1H, dd, J = 10,5; 5,0 Hz, Hb-18) và H 3,45 (1H, dd, J = 12,0; 6,5 Hz, Ha-17); 3,54 ((1H, dd, J = 12,0; 4,5 Hz, Hb-17)] và tín hiệu của các proton khác nằm trong khoảng từ H 0,93 đến 2,38 ppm. Ngoài ra, phổ 1H-NMR của hợp chất M1 còn xuất hiện tín hiệu của 4 nhóm hydroxyl [H 4,30 (1H, d, J = 5,0 Hz, 7-OH); 4,78 (1H, s, 16-OH); 4,43 (1H, dd, J = 4,5; 6,5 Hz, 17-OH)] và H 4,49 (1H, dd, J = 5,0; 10,0 Hz, 18-OH) (Bảng 4.3). Hình 4.8. Phổ 1H-NMR của M1 Hình 4.9. Phổ 13C-NMR của M1 Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất M1 xuất hiện tín hiệu của 20 nguyên tử carbon, bao gồm 1 nhóm keton tại C 219,3 (C15), 1 nhóm oxymethine tại C 69,5 (C-7), 2 nhóm oxymethylene [C 61,4 (C-17) và 69,9 (C-18)], 2 nhóm methyl tại C 17,4 (C-19) và C 17,7 (C-20), 4 tín hiệu carbon bậc 4 [C 36,9 (C-4), 38,6 (C-1), 58,4 (C- 10 8) và 78,4 (C-16)], 6 nhóm methylene [C 38,6 (C-1), 17,3 (C-2), 34,7 (C-3), 26,9 (C-6), 17,9 (C-11), 28,0 (C-12) và 25,3 (C-14)] và 3 nhóm methine [C 44,9 (C-5), 52,6 (C-9) và 38,7 (C-13)]. Các dữ liệu trên cho thấy hợp chất M1 là một hợp chất ent-kaurane diterpen và có cấu trúc tương tự hợp chất ent-7α,16β,17-trihydroxy-18-acetoxykaur-15-one ngoại trừ nhóm acetoxy tại C-18 của hợp chất ent-7α,16β,17trihydroxy-18-acetoxykaur-15-one [101]. Hình 4.10. Phổ DEPT của M1 Phổ HSQC cho thấy các proton tại H 0,65 (H3-19); H 1,02 (H3-20) và H 3,62 (H-7) liên kết với các nguyên tử carbon tương ứng C 17,4 (C-19); C 17,7 (C-20) và C 69,5 (C-7) cũng như các proton tại H 2,85/3,18 (H-18) và H 3,45/3,54 (H-17) có tương tác với các nguyên tử carbon tương ứng tại C 69,9 (C-18) và 64,1 (C-17). Ngoài ra, bốn tín hiệu proton tại H 4,30 (7OH); 4,43 (17-OH); 4,49 (18-OH) và H 4,78 (16-OH) không liên kết với bất kỳ nguyên tử carbon nào trên phổ HSQC chứng tỏ rằng hợp chất M1 có 4 nhóm hydroxyl (hình 4.6 và bảng 4.3). 11 Hình 4.11. Phổ HSQC của M1 Hình 4.12. Phổ HMBC của M1 Phổ HMBC của hợp chất M1 xuất hiện các tương tác xa dị hạt nhân của các proton tại H 0,65 (H3-19) và 2,85/3,18 (H-18) với các nguyên tử carbon tại C 34,7 (C-3), 36,9 (C-4) và C 44,9 (C-5); proton tại H 1,02 (H-20) với C 38,6 (C-1), C 44,9 (C-5), C 52,6 (C-9) và C 38,5 (C-10). Hơn nữa, các liên kết từ proton tại H 3,45/3,54 (H-17) đến các nguyên tử carbon tại C 38,7 (C-13), C 219,3 (C-15) và C 78,4 (C-16) cũng xuất hiện trên phổ HMBC, điều đó khẳng định rằng 3 nhóm hydroxyl nằm ở vị trí C-18, C-6 và C-17 (Hình 4.6). Nhóm hydroxyl cuối cùng được xác định tại C-7 bởi các liên kết HMBC giữa proton tại H 4,30 (7-OH) với các nguyên tử carbon tại C 26,9 (C-6), C 69,5 (C-7) và C 58,4 (C-8). Ngoài ra, các liên kết từ proton 12 tại H 4,49 (18-OH) với các nguyên tử carbon tại C 69,9 (C-18) và C 36,9 (C-4); từ proton tại H 4,78 (16-OH) với các nguyên tử carbon tại C 38,7 (C-13), C 219,3 (C-15), C 26,9 (C-16) và từ proton tại H 4,43 (17-OH) tới các nguyên tử carbon tại C 61,4 (C-17)/C 78,4 (C16) cũng xuất hiện trên phổ HMBC (Hình 4.6). Mặt khác, độ dịch chuyển hóa học carbon tại vị trí C-18 (C 69,9) và C-19 (C 17,4) của hợp chất M1 tương tự hợp chất scopariusol L [C 71,1 (C-18) và C 17,8 (C-19)] [102] và khác hẳn so với hợp chất diterpen SL-II [C 22,8 (C-18) và C 64,3 (C-19) [103] khẳng định thêm sự tồn tại của nhóm hydroxyl ở vị trí C-18. Hằng số ghép lớn của H-7 (J = 10,5 Hz) giống với hợp chất 7β,16α,17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid [104] xác định hướng α của nhóm hydroxyl (7-OH) trong hợp chất M1. Độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử carbon tại C-16 (C 78,4) và C-17 (C 61,4) của hợp chất M1 phù hợp với các giá trị carbon tương ứng của hợp chất ent-7α,16β,17-trihydroxykaur-18-acetoxy-15-one [C 77,4 (C-16) và C 63,1 (C-17)] [101] và khác hẳn so với hợp chất 16α,17dihydroxy-15-oxo-ent-kaur-19-oic acid [C 83,0 (C-16) và C 65,3 (C17)] [105] đề xuất cấu hình β của nhóm hydroxyl (16-OH). Từ các dữ liệu trên, hợp chất M1 được xác định là ent-7α,16β,17,18tetrahydroxykaur-15-one. Đây là một hợp chất mới và được đặt tên là callimacrophylla A. Hình 4.6. Cấu trúc hóa học, tương tác chính HMBC(HC) của M1 Bảng 4.3. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của M1 và chất tham khảo 1 δC 38,6 Hợp chất M1 δH (mult., J Hz) 0,57 (1H, m)/ 1,66 (1H, m) 2 17,3 1,38 (1H, m)/ 1,57 (1H, m) #δC 41,7 20,3 3 34,7 1,11 (1H, m)/ 1,40 (1H, m) 39,2 4 36,9 - 44,2 TT [103] #δH (mult., J Hz) 3,57 (m) 2,03 (m) 1,85 (overlap) 2,01 (m) 1,42 (m) 13 5 44,9 - 6 26,9 1,75 (1H, m)/ 1,66 (1H, m) 48,1 30,5 7 69,5 3,62 (1H, dd, 10,5; 5,5) 78,1 8 9 10 58,4 52,6 38,5 0,94 (1H, d, 9,0) 1,20 (1H, m)/ 1,53 (1H, m) 11 17,9 1,20 (1H, m)/ 1,53 (1H, m) 49,0 51,1 40,4 19,1 12 28,0 1,18 (1H, m)/ 1,60 (1H, m) 27,6 13 38,7 2,21 (1H, br d, 3,5) 14 25,3 1,66 (1H, m)/ 2,38 (1H, m) 46,1 37,5 15 16 219,3 78,4 1,63 (dd, 11,9, 1,7) 1,75 (m) 1,40 (m) 2,28 (dt, 13,3, 4,1) 1,33 (overlap) 1,85 (overlap) 3,66 (dd, 10,7, 6,0) 1,68 (m) 1,98 (m) 1,57 (m) 2,95 (br s) 2,45 (d, 11,8) 1,33 (overlap) 6,02 (br s) 5,16 (br s) 3,64 (d, 10,5) 3,32 (d, 10,5) 0,88 (s) 1,44 (s) 219,3 82,9 3,45 (1H, dd, 6,5; 12,0) 66,7 17 61,4 3,54 (1H, dd, 4,5; 12,0) 2,85 (1H, dd, 5,0; 10,5) 71,0 18 69,9 3,18 (1H, dd, 5,0; 10,5) 19 17,4 0,65 (3H, s) 16,8 20 17,7 1,02 (3H, s) 16,1 7-OH 4,30 (1H, d, 5,0) 16-OH 4,78 (1H, s) 17-OH 4,43 (1H, dd, 4,5; 6,5) 18-OH 4,49 (1H, dd, 5,0; 10,0) #δH và #δC của scopariusol L (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz, pyridine-d5) [102] 4.2.2.1. Hợp chất callimacrophylla B (M8)- Hợp chất mới Hợp chất M8 thu được dưới dạng tinh thể trắng. Công thức phân tử của hợp chất M8 được xác định là C32H50O4 dựa trên sự xuất hiện của các píc ion giả phân tử trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại m/z 499,3786 [M + H]+ (tính toán lý thuyết cho C32H51O4: m/z 499,3786). Phổ 1H-NMR của hợp chất M8 xuất hiện 6 nhóm methyl singlet tại H 0,83 (3H, s, H3-28); 1,17 (3H, s, H3-26); 1,18 (3H, s, H325); 1,34 (3H, s, H3-27); 0,89 (6H, s, H3-23 và H3-24), 2 nhóm methyl dưới dạng doublet tại H 0,80 (3H, J = 6,5 Hz, H3-29) và 0,93 (3H, J = 6,5 Hz, H3-30) và 1 nhóm methyl tại H 2,05 (3H, s, CH3CO) của nhóm acetoxy. Phổ 1H-NMR của M8 còn cho thấy sự xuất hiện của 6 nhóm methien [H 4,53 (1H, dd, J = 11,5; 4,5, H-3); 0,82 (1H, m, H-5); 2,50 (1H, s, H-9), 2,43 (1H, dd, J = 11,5; 1,5, H-18); 1,42 (1H, m, H-19) và 1,08 (1H, m, H-20)] và 8 nhóm methine có độ dịch chuyển hóa học 14 trong khoảng H 0,95-2,75 (H-1, H-2, H-6, H-7, H-15, H-16, H-21 và H-22), một proton singlet tại H 6,27 (1H, s, 12-OH) (Bảng 4.7) Hình 4.17. Phổ HR-ESI-MS của M8 Hình 4.18. Phổ 1H-NMR của M8 Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy hợp chất M8 có 32 nguyên tử cacbon, trong đó có 8 cacbon bậc bốn [C 38,0 (C-4); 45,5 (C-8); 37,0 (C-10); 195,2 (C-11); 144,5 (C-12); 134,4 (C-13); 41,7 (C14) và 33,4 (C-17)], 6 nhóm methine [C 80,5 (C-3); 55,0 (C-5); 59,7 (C-9); 48,9 (C-18); 39,3 (C-19) và 40,8 (C-20)], 8 nhóm methilen [C 38,9 (C-1); 23,5 (C-2); 17,4 (C-6); 32,9 (C-7); 27,3 (C-15); 27,5 (C16); 31,2 (C-21) và 41,2 (C-22)] và 8 nhóm methyl [C 28,0 (C-23); 16,6 (C-24); 16,7 (C-25); 18,6 (C-26); 21,0 (C-27); 28,8 (C-28); 16,6 (C-29) và 20,9 (C-30)]. Ngoài ra, còn có tín hiệu của 01 nhóm acetoxy tại C 170,9 (CH3CO) và 21,3 (CH3CO) cũng thu được từ phổ 13C-NMR 15 Hình 4.19. Phổ 13C-NMR của M8 Tất cả dữ liệu trên gợi ý cho biết hợp chất M8 là một triterpene khung ursane chứa một nhóm acetoxy và có cấu trúc giống hợp chất 3βacetoxy-urs-12-ene-11-one [94], ngoại trừ sự khác biệt về độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử cacbon tại vị trí C-11, C-12 và C-13. Khi so sánh dữ liệu NMR của các hợp chất M8 và hợp chất 3β-acetoxy-urs-12-ene-11one (TLTK) có thế thấy ở TLTK tín hiệu proton của nhóm olefin tại H 5,54 (1H,s) liên kết trực tiếp với C-12 là một cacbon bậc 4(không liên kết với hydro) có độ chuyển dịch hóa học C 144,5 ppm (C-12). Đồng thời tại vị trí C-12 có gắn với nhóm hydroxy cũng được thể hiện bởi phổ khối phân giải cao. Ngoài ra còn được xác định bởi tương tác xa dị hạt nhân của proton tại H 6,27 (1H, s, 12-OH) với các nguyên tử cacbon tại C 195,2 (C-11); 144,5 (C-12) và 134,4 (C-13). Thêm vào đó, các liên kết trên phổ HMBC giữa H18 (H 2,43) và C-12 (144,5)/C-13 (C 134,4) chỉ ra vị trí của liên kết đôi tại C-12/C-13 và nhóm keton tại C-11 (Hình 4.16) Hình 4.20. HSQC của M8 16 Hình 4.21. Phổ HMBC của M8 Bên cạnh đó, liên kết giữa các proton methyl tại H-23/H-24 (H 0,89) với C-3(C 80,5)/C-4 (C 38,0) và C-5(C 55,0) cũng như liên kết giữa H-3 (H 4,53)/CH3CO (H 2,05) với nguyên tử carbon tại C 170,9 (CH3CO), kết hợp với hằng số ghép lớn của H-3 (J = 11,5 Hz) trên phổ 1 H-NMR xác nhận nhóm acetoxy liên kết tại C-3 có hướng β. Ngoài ra, proton H-3 có hướng α được xác định bởi các liên kết từ H-2α (H 1,65) và H3-23 (H 0,89) đến H-3 (H 4,53) cũng như từ H3-25 (H 1,18) đến H-2β (H 1,72) trên phổ ROESY. Mặt khác, các liên kết giữa H-20 với H-29/H-19 và giữa các proton H-2 với H-1/H-3 cũng được tìm thấy trên phổ 1H-1H COSY. Hình 4.22 Phổ 1H-1H COSY và NOESY của M8 Kết hợp các dữ liệu phổ với HMBC, 1H-1H COSY và ROESY và so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất 3β-acetoxy-urs-12-ene-11one [94] trong tài liệu tham khảo cho phép khẳng định hợp chất M8 là 3β-acetoxy-urs-12-ene-11-one-12-ol. Đây là một hợp chất mới và được đặt tên là callimacrophylla B 17 Hình 4.16. Cấu trúc hóa học, tương tác chính HMBC (HC) của M8 Bảng 4.7. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của M8 và chất tham khảo Vị trí δC 1 38,9 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 CH3CO 23,5 80,5 38,0 55,0 17,4 32,9 45,5 59,7 37,0 195,2 144,5 134,4 41,7 27,3 27,5 33,4 48,9 39,3 40,8 31,2 41,2 28,0 16,6 16,7 18,6 21,0 28,8 16,6 20,9 170,9 M8 δH (mult., J Hz) 2,75 (1H, dt, 6,5; 3,5) 1,13 (1H, m) 1,65 (1H, m) / 1,72 (1H, m) 4,53 (1H, dd, 11,5; 4,5) 0,82 (1H, m) 1,43 (1H, m)/ 1,58 (1H, m) 1,43 (1H, m)/ 1,68 (1H, m) 2,50 (1H, s) 0,95 (1H, m)/ 2,10 (1H, m) 1,17 (1H, m)/ 1,90 (1H, m) 2,43 (1H, dd, 11,5; 1,5) 1,42 (1H, m) 1,08 (1H, m) 1,25 (1H, m)/ 1,43 (1H, m) 1,39 (1H, m)/ 1,47 (1H, m) 0,89 (3H, s) 0,89 (3H, s) 1,18 (3H, s) 1,17 (3H, s) 1,34 (3H, s) 0,83 (3H, s) 0,80 (3H, d, 6,5) 0,93 (3H, d, 6,5) - [94] #δH (mult., J Hz) #δC 38,9 2,75(lH,ddd, 3,5;3,5;13,5) 23,6 80,7 38,1 55,1 17,5 32,8 45,2 61,5 36,7 199,5 130,5 164,8 43,7 27,2 27,3 33,9 59,1 39,2 39,3 30,9 40,9 28,1 16,7 16,5 18,6 20,5 28,9 17,5 21,2 170,9 4,51 (lH, dd, 4,6; 11,7) 2,34 (1H, s) 5,54 (1H, s) 0,87 (3H, s) 0,88 (3H, s) 1,16 (3H, s) 1,18 (3H, s) 1,29 (3H, s) 0,81 (3H, s) 0,80 (3H,d, 6,0) 0,94 (3H, d, 6,0) -