Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của loài nàng nàng (callicarpa candicans) và loài tử châu lá to (callicarpa macrophylla) ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VŨ THỊ THU LÊ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI NÀNG NÀNG (CALLICARPA CANDICANS) VÀ LOÀI TỬ CHÂU LÁ TO (CALLICARPA MACROPHYLLA) Ở VIỆT NAM \ LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI, NĂM 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VŨ THỊ THU LÊ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI NÀNG NÀNG (CALLICARPA CANDICANS) VÀ LOÀI TỬ CHÂU LÁ TO (CALLICARPA MACROPHYLLA) Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 9.44.01.17 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Thị Hồng Minh 2. GS.TS. Phạm Quốc Long HÀ NỘI, 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Phạm Thị Hồng Minh và GS.TS Phạm Quốc Long. Các số liệu, kết quả của luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kì công trình nghiên cứu khoa học nào khác. Tác giả Vũ Thị Thu Lê LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, có sự hỗ trợ kinh phí của Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Chương trình hỗ trợ sau tiến sĩ, mã số: GUST.STS.ĐT2017HH03. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ qúy báu của các Thầy cô, những nhà khoa học trong và ngoài nước cũng như các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS.TS. Phạm Thị Hồng Minh và GS.TS. Phạm Quốc Long và là những người Thầy đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện trong thời gian tôi thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo, Trung tâm phát triển công nghệ sạch và vật liệu cùng tập thể cán bộ Viện hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm khoa Khoa học Cơ Bản, bộ môn Khoa học tự nhiên đã tạo điều kiện, chia sẻ và động viên trong suốt thời gian tôi thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Tác giả luận án Vũ Thị Thu Lê DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt Các phương pháp sắc ký CC Column Chromatography HPLC High Performance Sắc ký cột thường Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng Các phương pháp phổ 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy APCI-MS Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry CD Circular Dichroism Spectroscopy COSY Correlation Spectroscopy DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HR-ESI- High Resolution - Electron Spray Ionization - Mass Spectrometry MS HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence J (Hz) Interactive constant in Hz NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Phổ khối ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển Phổ nhị sắc tròn Phổ tương tác hai chiều 1H-1H Phổ DEPT Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết Hằng số tương tác tính bằng Hz Phổ NOESY i ESI-MS δ (ppm) Electron Spray Ionization Mass Spectra (ppm = part per million) Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử Độ dịch chuyển hóa học tính bằng phần triệu Các dòng tế bào Hep-G2 Human hepatoma Ung thư gan Lu-1 Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi MCF-7 Human breast Adenocarcinoma Ung thư vú Các kí hiệu khác IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% LD50 Lethal Dose 50 Liều độc cấp tính ED50 Effective Dose at 50% Liều gây chết hiệu quả MIC Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu SI Selectivity Index Độ chọn lọc, được tính bằng tỉ số IC50/MIC TMS Tetrametyl Silan Chất chuẩn nội NCI Nitional Cancer Institute Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ δH Proton chemical shift δC Carbon chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của proton Độ chuyển dịch hóa học của cacbon Ghi chú: Tên các hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học được viết theo nguyên bản Tiếng Anh để đảm bảo tính thống nhất và chính xác. DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1. Sơ đồ ngâm chiết lá cây Tử châu lá to (C. macrophylla) ............................. 42 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ phân lập cặn n-hexane của lá cây Tử châu lá to (C. macrophylla) .... 46 Sơ đồ 3.3. Sơ đồ phân lập cặn ethyl acetate của lá Tử châu lá to (C. macrophylla) ..... 47 Sơ đồ 3.4. Sơ đồ ngâm chiết lá cây Nàng nàng (C. candicans) ..................................... 49 Sơ đồ 3.5. Sơ đồ phân lập cặn n-hexane của lá cây Nàng nàng (C. candicans) ............ 50 Sơ đồ 3.6. Sơ đồ phân lập cặn ethyl acetate của lá cây Nàng nàng (C. candicans)....... 52 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Một số loài chi Callicarpa sử dụng trong y học cổ truyền dân tộc [2] ..... 4 Bảng 1.2. Một số hợp chất monoterpennoid phân lập được từ chi Callicarpa ................ 6 Bảng 1.3. Một số hợp chất sesquiterpennoid phân lập được từ chi Callicarpa ............... 8 Bảng 1.4. Một số hợp chất diterpennoid phân lập được từ chi Callicarpa .................... 10 Bảng 1.5. Một số hợp chất triterpennoid phân lập được từ chi Callicarpa ................... 14 Bảng 1.6. Một số hợp chất flavonoid phân lập từ chi Callicarpa .................................. 20 Bảng 1.7. Một số hợp chất phenylethanoid, phenylpropanoid và một số hợp chất khác phân lập được từ chi Callicarpa..................................................................................... 24 Bảng 4.1. Thành phần hóa học tinh dầu lá và hoa Nàng nàng (C. candicans) .............. 57 Bảng 4.2. Thành phần hóa học tinh dầu lá tươi cây Tử châu lá to (C. macrophylla) .... 70 Bảng 4.3. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của M1 và hợp chất tham khảo ..................... 79 Bảng 4.4. Dữ liệu phổ của chất M7 .............................................................................. 87 Bảng 4.5. Dữ liệu phổ của chất C5 ................................................................................ 88 Bảng 4.6. Dữ liệu phổ của chất C6 ............................................................................... 90 Bảng 4.7. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của M8 ........................................................... 93 Bảng 4.8. Dữ liệu phổ của chất M2 ............................................................................. 101 Bảng 4.9. Dữ liệu phổ của chất M3 ............................................................................ 103 Bảng 4.10. Dữ liệu phổ của chất M10. ........................................................................ 105 Bảng 4.11. Dữ liệu phổ của chất M6 .......................................................................... 108 Bảng 4.12. Dữ liệu phổ của chất C7 ............................................................................ 109 Bảng 4.13. Dữ liệu phổ của chất C8 ........................................................................... 111 Bảng 4.14. Dữ liệu phổ của chất M5 ........................................................................... 114 Bảng 4.15. Dữ liệu phổ của chất C1 ............................................................................ 117 Bảng 4.16. Dữ liệu phổ của chất C3 ........................................................................... 118 Bảng 4.17. Dữ liệu phổ của chất C9 ........................................................................... 120 Bảng 4.18. Dữ liệu phổ của chất C10 ......................................................................... 122 Bảng 4.19. Các hợp chất phân lập được từ 2 loài nghiên cứu ..................................... 124 Bảng 4.20. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro của tinh dầu lá Nàng nàng trên các dòng tế bào ung thư: gan (Hep-G2), tiền liệt tuyến (PC3) và phổi (A549). .......... 128 Bảng 4.21. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của lá Nàng nàng ....... 128 Bảng 4.22. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro tinh dầu lá tươi cây Tử châu lá to trên các dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư tiền liệt tuyến (PC3) và ung thư phổi (A549) .................................................................................................................. 129 Bảng 4.23. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của lá tươi cây Tử châu lá to .......................................................................................................................... 129 Bảng 4.24. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các cặn chiết tổng methanol từ lá, quả và thân cành cây Tử châu lá to và Nàng nàng.............................................................. 130 Bảng 4.25. Hoạt tính gây độc tế bào của các cặn chiết phân đoạn từ lá cây Tử châu . 130 Bảng 4.26. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất trên các dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu-1) và ung thư vú (MCF-7) ............... 131 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất monoterpennoid .................................. 7 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất sesquiterpennoid ................................. 9 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất diterpenoid ........................................ 14 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất triterpennoid...................................... 20 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất flavonoid ........................................... 24 Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất phenylethanoid và phenylpropanoid . 29 Hình 2.1. Quả và Hoa cây Nàng nàng (Callicarpa candicans (Burm.f.) Hochr.) ......... 33 Hình 2.2. Cây và hoa loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla Vahl) ..................... 33 Hình 2.3. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước dùng bộ cất tinh dầu vi lượng ........... 36 Hình 2.4. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng.................... 36 Hình 4.1. Phổ GC-MS của tinh dầu lá tươi Nàng nàng ................................................. 67 Hình 4.2. Phổ GC-MS của tinh dầu lá khô Nàng nàng .................................................. 68 Hình 4.3. Phổ GC-MS của tinh dầu hoa Nàng nàng ...................................................... 68 Hình 4.4. Phổ GC-MS của tinh dầu lá tươi Nàng nàng có hỗ trợ vi sóng .................... 69 Hình 4.5. Phổ GC-MS của tinh dầu lá tươi cây Tử châu lá to ...................................... 76 Hình 4.6. Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) của M1 ...................... 79 Hình 4.7. Phổ ESI-MS của M1 ...................................................................................... 80 Hình 4.8. Phổ 1H-NMR của M1..................................................................................... 81 Hình 4.9. Phổ 13C-NMR của M1 ................................................................................... 82 Hình 4.10. Phổ DEPT của M1....................................................................................... 83 Hình 4.11. Phổ HSQC của M1....................................................................................... 84 Hình 4.12. Phổ HMBC của M1 ..................................................................................... 85 Hình 4.13. Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) của M7 .................... 86 Hình 4.14. Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) của C5 .................... 88 Hình 4.15. Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) của C6 ..................... 90 Hình 4.16. Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) của M8 .................... 93 Hình 4.17. Phổ HR-ESI-MS của M8 ............................................................................. 95 Hình 4.18. Phổ 1H-NMR của M8................................................................................... 96 Hình 4.19. Phổ 13C-NMR của M8 ................................................................................. 97 Hình 4.20. HSQC của M8 .............................................................................................. 98 Hình 4.21. Phổ HMBC của M8 ..................................................................................... 99 Hình 4.22. Phổ 1H-1H COSY của M8 ......................................................................... 100 Hình 4.23. Phổ NOESY của M8 ................................................................................. 100 Hình 4.24. Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) của M2 .................. 101 Hình 4.25. Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) của M3 ................. 103 Hình 4.26. Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) của M10 ............... 105 Hình 4.27. Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) của M6 .................. 107 Hình 4.28. Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) của C7 ................... 109 Hình 4.29. Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) của C8 ................... 111 Hình 4.30. Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) của M5 .................. 113 Hình 4.31. Cấu trúc hóa học của M4 (R = H) và M9 ( R = Glu) ............................... 115 Hình 4.32. Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) của C1 ................... 116 Hình 4.33. Cấu trúc hóa học của C3 ............................................................................ 118 Hình 4.34. Cấu trúc hóa học của C9 ............................................................................ 120 Hình 4.35. Cấu trúc hóa học của C10 .......................................................................... 122 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ................................................................ i DANH MỤC SƠ ĐỒ ..................................................................................................iii DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................................ iv DANH MỤC HÌNH VẼ ............................................................................................. vi MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 2 1.1. Đặc điểm chung về thực vật học chi Callicarpa ..................................................... 2 1.2. Tác dụng dược lý của chi Callicarpa ...................................................................... 3 1.3 Thành phần hóa học thực vật chi Callicarpa........................................................... 6 1.3.1. Monoterpenoid ........................................................................................................ 6 1.3.2. Sesquiterpenoid ....................................................................................................... 7 1.3.3. Diterpenoid .............................................................................................................. 9 1.3.4. Triterpenoid ........................................................................................................... 14 1.3.5. Flavonoid ............................................................................................................... 20 1.3.6. Phenylethanoid và phenylpropanoid .................................................................... 24 1.4. Hoạt tính sinh học các thực vật chi Callicarpa ..................................................... 30 1.4.1. Hoạt tính kháng viêm và miễn dịch ..................................................................... 30 1.4.2. Tác dụng cầm máu ................................................................................................ 30 1.4.3. Tác dụng bảo vệ thần kinh và chống mất trí nhớ ................................................ 30 1.4.4. Hoạt tính chống lao ............................................................................................... 31 1.4.5. Tác dụng giảm đau ................................................................................................ 31 1.4.6. Hoạt tính chống oxi hóa ........................................................................................ 31 1.4.7. Hoạt tính kháng khuẩn .......................................................................................... 31 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 33 2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 33 2.1.1. Mẫu thực vật .......................................................................................................... 33 2.1.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu .......................................................................... 33 2.2. Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng ..................................................... 34 2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất ...................................................................... 34 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học .............................................................. 34 2.3. Phương pháp chiết xuất tinh dầu .......................................................................... 35 2.3.1. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước dùng bộ cất tinh dầu vi lượng ........ 35 2.3.2. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng ................. 35 2.3.3. Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu ......................................... 36 2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ............................................................ 37 2.4.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp SRB........... 37 2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp MTT......... 39 2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định............................ 40 Chương 3. THỰC NGHIỆM .................................................................................... 42 3.1. Lá cây Tử châu lá to ............................................................................................. 42 3.1.1. Thu nhận các dịch chiết từ lá cây Tử châu lá to .................................................. 42 3.1.2. Phân lập và tinh chế các chất từ các cặn chiết của lá Tử châu lá to ................... 42 3.1.2.1. Cặn chiết n-hexane của lá cây Tử châu lá to (C. macrophylla) .......... 42 3.1.2.2. Cặn chiết ethyl acetate của lá cây Tử châu lá to (C. macrophylla) ..... 46 3.2. Lá cây Nàng nàng................................................................................................. 49 3.2.1. Thu nhận các dịch chiết từ lá cây Nàng nàng ..................................................... 49 3.3.2. Phân lập và tinh chế các chất từ các cặn chiết của lá Nàng nàng ....................... 49 3.3. Xác định thành phần tinh dầu lá Tử châu lá to và Nàng nàng ............................. 55 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào của các cặn chiết và hợp chất phân lập được ............... 55 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 56 4.1. Thành phần hóa học của tinh dầu cây Nàng nàng và cây Tử châu lá to ............. 56 4.1.1. Thành phần hóa học tinh dầu lá và hoa Nàng nàng ............................................ 56 4.1.2. Thành phần hóa học của tinh dầu lá Tử châu lá to (C. macrophylla) ................ 69 4.2. Các hợp chất phân lập được từ lá cây Tử châu lá to và Nàng nàng ..................... 76 4.2.1. Các hợp chất diterpenoid ...................................................................................... 77 4.2.1.1. Hợp chất callimacrophylla A (M1) – Hợp chất mới ........................... 77 4.2.1.2. Hợp chất ent-1β-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) . 86 4.2.1.3. Hợp chất seco-hinokiol (C5) ............................................................... 88 4.2.1.4. Hợp chất methyl seco-hinokiol (C6) ................................................... 89 4.2.2. Các hợp chất triterpenoid ...................................................................................... 91 4.2.2.1. Hợp chất callimacrophylla B (M8)- Hợp chất mới ............................. 91 4.2.2.2. Hợp chất 3β-hydroxyolean-12-ene (M2) .......................................... 101 4.2.2.3. Hợp chất β-amyrin (M3) ................................................................... 102 4.2.2.4. Hợp chất oleanolic acid (M10)......................................................... 104 4.2.2.5. Hợp chất ursolic acid (M6) .............................................................. 107 4.2.2.6. Hợp chất 2α-hydroxy-ursolic acid (C7) ............................................ 109 4.2.2.7. Hợp chất 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8) ................ 111 4.2.3. Các hợp chất steroid ............................................................................................ 113 4.2.3.1. Hợp chất spinasterol (M5) ................................................................. 113 4.2.3.2. Hợp chất β-sitosterol (M4) ................................................................ 114 4.2.3.3. Hợp chất daucosterol (M9) ............................................................... 115 4.2.4. Các hợp chất flavonoid ....................................................................................... 115 4.2.4.1 Hợp chất 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1) ............................... 115 4.2.4.2. Hợp chất 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3).......................... 117 4.2.4.3. Hợp chất genkwanin (C9) ................................................................. 119 4.2.4.4. Hợp chất cynaroside (C10) ............................................................... 121 4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của Nàng nàng và lá Tử châu lá to ....................... 128 4.3.1. Đánh giá hoạt tính sinh học của tinh dầu lá Nàng nàng và lá Tử châu lá to... 128 4.3.1.1. Đánh giá hoạt tính sinh học của tinh dầu lá cây Nàng nàng ............. 128 4.3.1.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của tinh dầu lá cây Tử châu lá to ......... 129 4.3.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của cao chiết từ loài Tử châu lá to và Nàng nàng ................................................................................................................. 129 4.3.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất sạch phân lập được từ lá Tử châu lá to và Nàng nàng .................................................................................. 131 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 134 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................ 139 1 MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên có nguồn thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loài dược liệu quý. Việc sử dụng các loại thảo dược theo y học cổ truyền hay từ các hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học. Những bài thuốc sử dụng thảo dược là đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên, các kết quả nghiên cứu sẽ góp phần giải thích rõ hơn về tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền vẫn hay được sử dụng trong dân gian Trên thế giới những nghiên cứu về các loài chi Callicarpa chủ yếu tập trung nghiên cứu về: thực vật học, dược lý, hóa thực vật và lâm sàng của nó. Nghiên cứu dược lý được thực hiện trên dịch chiết thô hoặc các hợp chất tinh khiết đã cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng truyền thống. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học chủ yếu tập trung vào các hoạt tính: kháng viêm, cầm máu, mất trí nhớ, oxi hóa, kháng khuẩn. Điều đáng chú ý, các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới chỉ ra rằng, các hợp chất diterpenoid và triterpenoid có hoạt tính chống ung thư rất tốt mà các hoạt chất này là một trong các thành phần hóa học phong phú nhất trong chi Callicarpa. Việc nghiên cứu nhằm tìm ra những hoạt chất có ích của thực vật đã và đang nhận được sự quan tâm của giới khoa học nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Đây cũng là lý do đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và loài Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla ) ở Việt Nam” được lựa chọn để nghiên cứu với mục tiêu: 1. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ lá loài Nàng nàng (C. candicans) và Tử châu lá to (C. macrophylla) thu hái ở Việt Nam.. 2. Nghiên cứu thành phần hóa học trong tinh dầu loài Nàng nàng (C. candicans) và loài Tử châu lá to (C. macrophylla). 3. Đánh giá hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư: gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) của các hợp chất sạch phân lập được 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm chung về thực vật học chi Callicarpa Họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) tuy là họ không lớn nhưng cũng rất đa dạng trong hệ thực vật Việt Nam, tác giả Vũ Xuân Phương (2007) đã xây dựng khóa định loại và mô tả khá đầy đủ cho 26 chi với khoảng 140 loài và 21 thứ. Theo y học cổ truyền ở nước ta cũng như nhiều nước trong khu vực, nhiều loài trong họ Cỏ roi ngựa như: các chi Mò (Clerodendrum), Cách (Premna), Tử châu (Callicarpa), Bình linh (Vitex), Cỏ roi ngựa (Verbena), Lõi thọ (Gmelina) đã được coi là những cây thuốc chữa trị các bệnh về gan, mật, vàng da, đau dạ dày, kinh nguyệt không đều, bạch đới, viêm loét tử cung, viêm não B, truyền nhiễm, huyết áp cao, lao phổi, viêm đường hô hấp, phong thấp. Những nghiên cứu về hóa học tuy chưa nhiều, song các kết quả thu được có tác dụng sinh học trong nhiều loài của một số chi thuộc họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae), cho thấy đây là một họ có nhiều triển vọng trong tương lai. [1] Trên Thế giới, chi Callicarpa L. (Chi Tu hú, Nàng nàng hay Tử châu) có khoảng 140 loài, thuộc họ Verbenaceae, bao gồm các cây thân gỗ nhỏ và cây bụi, hay gặp phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chủ yếu là ở các nước thuộc châu Á, một số loài cũng gặp ở vùng xích đạo châu Mỹ và Australia [2]. Có nhiều loài cây thuộc chi Callicarpa được sử dụng trong y học dân gian nhiều dân tộc, ở các nước châu Á, Australia và Mỹ. Khoảng 20 loài thực vật chi Callicarpa được công bố về tác dụng và được sử dụng trong y học dân gian. Trong đó, một số loài biết đến hay được sử dụng trong y học cổ truyền của Trung Quốc và Nam Á trong việc điều trị bệnh viêm gan, bệnh thấp khớp, sốt, nhức đầu, khó tiêu và các bệnh khác. Một số loài Callicarpa đã được công bố được sử dụng chống lại ung thư (ví dụ, rễ cây Callicarpa americana để điều trị bệnh ung thư da và vỏ cây Callicarpa rubella để điều trị khối u của ruột già). Các dịch chiết thu được từ 14 loài trong chi Callicarpa đã được đánh giá tác dụng sinh học gồm khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống côn trùng sinh trưởng, gây độc tế bào và các hoạt động phytotoxic. Ngoài các acid amin, benzenoid, carbohydrate đơn giản, lipid, diterpene, flavonoid, phenylpropanoid, phytosterol, sesquiterpene, và triterpene đã được phát hiện, phân lập từ chi Callicarpa [3]. Ở Việt Nam, Theo tác giả Võ Văn Chi, chi Callicarpa có 14 loài [4], tác giả Phạm 3 Hoàng Hộ thống kê chi Callicarpa có 26 loài [5], còn theo các nhà thực vật học thuộc Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật đã thống kê được 21 loài [6]. Được phân bố rải rác trong khắp cả nước ở Phía Bắc như Tuyên Quang, Lạng Sơn, Sơn La, Bắc Cạn, Phú Thọ, Bắc Giang, Ba Vì, Thái Nguyên, một số vùng miền trung như Nghệ An, Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Kon Tum, Đắc Lắc, Gia Lai, Ở phía Nam có Bình Dương, Đồng Nai [ 6,7 ]. Trong y học hiện đại, những kết quả nghiên cứu và thử nghiệm hoạt tính sinh học một số loài thực vật Callicarpa đã chứng minh rằng chúng chứa nhiều hoạt chất có tác dụng sinh học quý góp phần làm sáng tỏ việc sử dụng các thực vật chi này trong dân gian và cho thấy nó cung cấp một lượng lớn các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học. 1.2. Tác dụng dược lý của chi Callicarpa Các thực vật chi Callicarpa được sử dụng trong y học cổ truyền, chủ yếu ở châu Á (Bảng 1.1). Thành phần hóa học tinh dầu chính của loài Callicarpa americana được công bố có tác dụng chống đầy bụng khó tiêu, một số chất phân lập được từ loài Callicarpa americana và Callicarpa japonica có tác dụng chống muỗi đốt [8]. Gần đây, kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài C. americana cho biết một số hợp chất khung clerodanediterpene là thành phần chính thể hiện hoạt tính. Một số loài Callicarpa được nghiên cứu sử dụng trong phòng chống ung thư như rễ loài C. americana để điều trị ung thư da và vỏ loài C. rubella để điều trị khối u ruột già [3]. Ở Ấn Độ, vỏ loài C. arborea Roxb. chữa bệnh ngoài da [9] còn ở Nepal sử dụng vỏ cây để giảm sốt và vỏ quả chữa chứng khó tiêu [10]. Lá loài C. lanata có tác dụng như lá trầu ở Đông Ấn Độ [11]. Trong y học dân gian Đài Loan, loài C. formosana Rolfe được sử dụng để điều trị bệnh thấp khớp và rối loạn đường tiêu hóa (nhiễm trùng răng miệng, rối loạn dạ dày và đường ruột) [12]. Loài C. macrophylla Vahl được sử dụng rộng rãi trong các hệ thống của y học cổ truyền Ấn Độ và Trung Quốc. Hạt C. macrophylla được sử dụng trong y học cổ truyền Ấn Độ, để điều trị nhiễm trùng răng miệng và đường ruột, lá được sử dụng để điều trị bệnh thấp khớp, nước ép trái cây được sử dụng để giảm sốt và dầu thơm từ rễ được sử dụng để điều trị rối loạn chức năng dạ dày [13,14,15]. Trong y học cổ truyền Trung Quốc loài C. macrophylla được sử dụng kết hợp với hai loài C. pedunculata R.Br. và C. cathayana Chang để ngăn ngừa xuất huyết trong và điều trị bỏng [16]. Ngoài ra, C. macrophylla cũng được sử dụng kết hợp với 4 một số thảo dược khác để điều trị các bệnh như tiêu chảy, kiết lỵ, sâu ruột, viêm da, lọc máu và đào thải chất độc [17]. Một số loài Callicarpa được sử dụng gây vô sinh như bộ lạc ở thung lũng Torres (nằm giữa Papua New Guinea và Australia) sử dụng nước ép lá của một loài Callicarpa (tên địa phương, "argerarger", có thể là C. thozetii AA Munir) trộn lẫn với lá của một số loài cây khác để gây ra vô sinh vĩnh viễn [18]; Bộ lạc Marma ở Bangladesh đã sử dụng rễ loài C. lanata L. (hay còn gọi là C. tomentosa (L.) Murr.) kết hợp với rễ loài Streblus asper Laur. (Moraceae) để điều trị kinh nguyệt không đều và lá nhai với muối có tác dụng diệt tinh trùng [19,20]. Theo một số tài liệu thực vật ở Bắc Mỹ, quả loài Callicarpa americana L. được sử dụng thường xuyên như một loại thức ăn. Trong những năm đầu thế kỷ XIX, Rafinesque cho rằng lá C. mericana đã được sử dụng để điều trị bệnh phù, và quả để ăn mặc dù có tính axit, mặt khác quả cũng được coi là một nguồn thuốc nhuộm làm cho len có màu tím [21,22]. Theo y học cổ truyền ở Bắc Mỹ, nước sắc từ rễ và cành của C. americana L. để sử dụng trị bệnh thấp khớp, ra mồ hôi, giải nhiệt và đặc biệt chữa sốt rét. Một số vùng còn sử dụng nước sắc gồm rễ và quả loài C. americana để điều trị đau bụng [23]. Nước sắc kết hợp rễ cây C. americana với Rubus sp. được sử dụng để điều trị bệnh hoa mắt, chóng mặt. Ngoài ra, nước sắc từ rễ cũng được sử dụng điều trị bệnh đau dạ dày [24, 25]. Lá cây C. candicans (Burm. f.) Hochr ở Philippine được người bản địa sử dụng làm chất độc cá [26]. Bảng 1.1. Một số loài chi Callicarpa sử dụng trong y học cổ truyền dân tộc [2] Loài C. americana C. arborea C. bodinieri C. cana Bộ phận Vỏ Quốc gia Mỹ Tác dụng Sốt Lá Rễ Rễ Mỹ Mỹ Mỹ Chứng thủng nước Ung thư da Kiết lỵ Rễ và quả Rễ và cành Vỏ Mỹ Mỹ Ấn Độ Đau bụng Sốt, sốt rét, thấp khớp Bệnh ngoài da Vỏ Ép vỏ Lá Không xác định Nepal Nepal Trung Quốc Papua New Guinea Sốt Đường tiêu hóa Vết thương Chống đông 5 C. candicans C. cathayana C. flavida C. formosana Quần đảo Palau Malaysia Trung Quốc Philippines Đài Loan Đài Loan Ngộ độc cá Điều hòa kinh Vết thương Đau răng Bệnh dạ dày Nhiễm trùng, rối loạn tiêu hóa Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Nhật Bản Trung Quốc Ấn Độ Bangladesh Trung Quốc Trung Quốc Vết thương Vết thương Vết thương Vết thương Vết thương Chất độc cá Vết thương Giun sán Sốt, sốt rét Vết thương Vết thương Papua New Guinea Trung Quốc Nepal Trung Quốc Giun sán Vết thương Sốt Vết thương Lá Ấn Độ Trung Quốc Đau đầu Sốt Rễ tươi Ấn Độ Sốt, loét miệng, ho Rễ Rễ Nepal Nepal Nhiễm trùng Đường tiêu hóa Lá Lá Lá Vỏ Trên mặt đất Không xác định Lá C. giraldii Lá C. giraldii Lá C. integerrima Lá Lá C. japonica Lá C. kochiana Lá Lá C. lanata Rễ tươi C. lingii Lá Lá C. longifolia Không xác định C. longissima Lá Quả tươi Lá C. macrophylla Hạt C. pedunculata Không xác định C. purpurea Lá C. reevesii Lá Vỏ C. rubella Lá Trên mặt đất Lá Callicarpa sp. Lá và cành Nhiễm trùng, thấp khớp Papua New Guinea Trung Quốc Trung Quốc Ấn Độ Trung Quốc Trung Quốc Papua New Guinea Giun sán Vết thương Vết thương Khối u của ruột già Vết thương Bỏng Đau vai gáy, giun sán Papua New Guinea Giun sán 6 1.3 Thành phần hóa học thực vật chi Callicarpa  Tình hình nghiên cứu trên thế giới Những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thực vật chi Callicarpa cho thấy sự có mặt của hơn 200 hợp chất. Bao gồm các lớp chất chính: terpenoid (diterpenoid và triterpenoid) và flavonoid với nhiều hoạt tính sinh học đáng được quan tâm chú ý. Thực vật chi Callicarpa có thành phần hóa học phong phú và đa dạng với nhiều lớp chất khác nhau như: terpenoid (monoterpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid), flavonoid, phenylethanoid và phenypropanoid. Trong đó các hợp chất terpenoid được quan tâm nhiều, đặc biệt là diterpenoid và triterpenoid là các thành phần phong phú nhất trong chi này. 1.3.1. Monoterpenoid Một số hợp chất iridoid phân lập được từ loài C. nudiflora như nudifloside và linearoside được chứng minh có tác dụng ức chế tế bào ung thư máu K562 [28]. Ngoài ra các hợp chất khác phân lập được từ loài C. kochiana và C. japonica cũng đã được báo cáo [29,30]. Bảng 1.2. Một số hợp chất monoterpennoid phân lập được từ chi Callicarpa Tên chất KH Loài TLTK 1 4-terpineol C. kochiana [30] 2 α-terpineol C. kochiana [30] 3 α -pinene C. japonica [33] 4 β-pinene C. japonica [33] 5 p-cymene C. candicans [32] 6 Limonene C. candicans [32] 7 6-O-benzoylphlorigidoside B C. formosana [27] 8 6-O-trans-cinnamoylphlorigidoside B C. formosana [27] 9 6-O-trans-p-coumaroylshanzhiside methyl ester C. formosana [27] 10 4-O-trans-p-coumaroylmussaenoside C. formosana [27] 11 6 β-Hydroxyipolamiide C. formosana [27] 12 Phlorigidosides C. formosana [27]