Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hoa sữa tại thành phố đồng hới trong dung môi n-hexan và clorofom

LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp là thành quả kiến thức cũng như kĩ năng mà em thu được sau 4 năm ngồi trên ghế giảng đường đại học. Thành quả này không thể chỉ riêng một mình em có thể làm được, đó là nhờ công ơn dạy dỗ, những kinh nghiệm quý báu mà thầy cô đã truyền đạt lại cho em trong những năm học qua, cũng như sự quan tâm, ủng hộ của gia đình và bạn bè. Để hoàn thành khóa luận này em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giáo đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, rèn luyện ở Trường Đại học Quảng Bình, nhất là những thầy cô giáo ở tổ bộ môn Hóa, Khoa Khoa học tự nhiên. Đặc biệt em chân thành cảm ơn cô giáo hướng dẫn Thạc sĩ Lý Thị Thu Hoài đã tận tình hướng dẫn em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất song do điều kiện thực tế cũng như hạn chế về mặt kiến thức và kinh nghiệm nên bản thân em có thể có những sai sót mà bản thân không thấy được, rất mong sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn để khóa luận có thể hoàn chỉnh hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Đồng Hới, tháng 6 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Tuyết Trinh 1 MỤC LỤC Trang DANH MỤC ....................................................................................................... i MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1. Lí do chọn đề tài........................................................................................ 1 2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................. 1 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 1 4. Giả thuyết khoa học .................................................................................. 1 5. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................ 2 6. Các phương pháp nghiên cứu .................................................................... 2 7. Bố cục khóa luận ....................................................................................... 2 NỘI DUNG ......................................................................................................... 3 Chương 1: TỔNG QUAN ................................................................................. 3 1.1. Giới thiệu về cây hoa sữa ........................................................................ 3 i) Sơ lược nguồn gốc cây hoa sữa trong giới thực vật ................................... 3 ii) Cây hoa sữa ............................................................................................... 4 1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây hoa sữa ................. 6 1.3. Hợp chất Ancaloit ................................................................................... 6 i) Khái niệm.................................................................................................. 6 ii) Thành phần nguyên tố và cấu tạo của Ancaloit.......................................... 7 iii) Phân loại Ancaloit ..................................................................................... 7 iv) Tính chất chung của Ancaloit .................................................................... 8 v) Sự tạo thành Ancaloit trong cây ................................................................ 9 vi) Thuốc thử Ancaloit ................................................................................... 9 1.4. Flavonoit .............................................................................................. 10 i) Đại cương về flavonoit ........................................................................... 10 ii) Hợp chất flavonoit có trong cây hoa sữa................................................. 12 1.5. Phương pháp tách một số hợp chất hữu cơ có trong hoa sữa ............ 12 i) Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.............................................. 12 ii) Phương pháp chiết .................................................................................. 13 iii) Phương pháp sắc ký ............................................................................... 17 iv) Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) ....................................................... 20 2 Chươ ng 2: NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM ............................. 22 2.1. Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất ............................................................ 22 2.1.1. Nguyên liệu chính .................................................................................. 22 2.1.2. Thu mẫu hoa và phương pháp xử lý ....................................................... 22 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất.................................................................. 22 2.2. Quy trình nghiên cứu ........................................................................... 22 2.2.1. Tách, chiết tinh dầu ................................................................................ 22 2.2.2. Tách, chiết bằng dung môi hữu cơ.......................................................... 24 2.2.3. Tách, chiết bằng dung dịch axit ............................................................. 26 2.2.4. Pha thuốc thử ......................................................................................... 27 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 28 3.1. Hàm lượng tinh dầu ............................................................................. 28 3.2. Thành phần trong dịch chiết nước, chiết bằng dung dịch axit .......... 28 3.2.1. Dịch chiết nước ...................................................................................... 28 3.2.2. Dịch chiết dung dịch axit........................................................................ 29 3.3. Thành phần Ancaloit trong dịch chiết n-hexan .................................. 30 3.3.1. Hàm lượng ............................................................................................. 30 3.3.2. Trạng thái vật lý ..................................................................................... 31 3.3.3. Phản ứng với thuốc thử .......................................................................... 31 3.4. Thành phần trong dịch chiết clorofom ............................................... 32 3.4.1. Hàm lượng ............................................................................................. 32 3.4.2. Trạng thái vật lý ..................................................................................... 32 3.4.3. Phản ứng với thuốc thử .......................................................................... 33 3.5. Kết quả khảo sát điều kiện chiết Ancaloit .......................................... 34 3.5.1. Kết quả lựa chọn thuốc thử..................................................................... 34 3.5.2. Kết quả lựa chọn dung môi chiết ............................................................ 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 36 1. Kết luận.................................................................................................. 36 2. Kiến nghị .............................................................................................. 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 37 3 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1: Các loại pha động và pha tĩnh thường được sử dụng trong kỹ thuật sắc ký .......................................................................................... 18 Bảng 2: Tóm tắt các cấu hình sắc ký khác nhau ................................................. 19 Bảng 3: Kết quả khi thử sản phẩm chiết với thuốc thử ....................................... 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cây hoa sữa ở thành phố Đồng Hới ....................................................... 4 Hình 2: Hoa sữa ................................................................................................. 5 Hình 3: Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước ................................................... 13 Hình 4: Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước Hoa sữa trong phòng thí nghiệm ............ 23 Hình 5: Chiết n-hexan ........................................................................................ 25 Hình 6: Thuốc thử nhận biết Ancaloit ................................................................ 27 Hình 7: Kết quả thử thuốc thử của dịch nước khi chiết trong dung môi hữu cơ .................... 28 Hình 8: Hòa tan cao etanol vào nước cất, thử thuốc thử ..................................... 29 Hình 9: Cao etanol hòa tan trong dung dịch HCl 5% ......................................... 30 Hình 10: Dịch chiết n-hexan............................................................................... 31 Hình 11: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Wagner............................................ 31 Hình 12: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Mayer ................................................ 32 Hình 13: Dịch chiết clorofom ............................................................................. 33 Hình 14: Dịch chiết clorofom phản ứng với thuốc thử Mayer ............................ 33 4 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Hoa sữa là cây khá phổ biến ở Việt Nam. Cây thường được trồng lấy bóng mát ở nhiều địa phương. Từ xa xưa ông cha ta đã biết dùng vỏ cây hoa sữa làm thuốc chữa bệnh. Các nghiên cứu gần đây chủ yếu là nghiên cứu về thành phần của vỏ cây hoa sữa và cho thấy vỏ của chúng chứa Ancaloit có tác dụng dược lý. Một bộ phận khác của cây là hoa thì lại được ít nghiên cứu đề cập đến. Hoa sữa là loài hoa có mùi thơm nồng nên nghiên cứu xác định thành phần có trong hoa có thể làm phong phú thêm nguồn hương liệu phục vụ công nghiệp sản xuất. Mặt khác, ngoài vỏ cây có tác dụng dược lý thì hoa cũng có thể chứa thành phần tương tự, xác định được thành phần đó làm phong phú thêm nguồn dược liệu phục vụ trong y học. Ở địa bàn thành phố Đồng Hới là nơi có nhiều hoa sữa, làm nguồn nguyên liệu phong phú phục vụ cho quá trình nghiên cứu và ứng dụng. Việc thực hiện nghiên cứu xác định thành phần dịch chiết hoa sữa trong dung môi n-hexan và clorofom là hướng nghiên cứu tách chiết mới các hợp chất thiên nhiên. Vì vậy, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hoa sữa tại thành phố Đồng Hới trong dung môi n-Hexan và Clorofom”. 2. Mục đích nghiên cứu - Xác định thành phần hoá học các hợp chất trong dịch chiết hoa sữa bằng dung môi n-Hexan và Clorofom. - Xây dựng qui trình chiết tách Ancaloit trong hoa sữa. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Cây hoa sữa, được chọn một cách ngẫu nhiên trên địa bàn thành phố Đồng Hới. - Hoa của cây hoa sữa lấy trong khoảng thời gian tháng 11/2014 - 01/2015. 4. Giả thuyết khoa học 5 - Hoa sữa là cây thuộc họ trúc đào, là cây có hàm lượng Ancaloit lớn trong tự nhiên. Theo các nghiên cứu trước đây cho thấy thành phần vỏ cây chứa Ancaloit, mà trong thực vật Ancaloit không chỉ tập trung ở một bộ phận mà phân bố ở nhiều bộ phân khác của cây. Hoa của cây hoa sữa có thể chứa thành phần Ancaloit. - Hoa sữa đã được sử dụng nhiều trong y dược, vì vậy nó có hợp chất có tác dụng dược lý. - Đề tài này xác định thành phần có trong dịch chiết hoa sữa để biết rõ những hợp chất có trong dịch chiết n-Hexan và Clorofom. 5. Nhiệm vụ nghiên cứu - Xây dựng hệ thống lý thuyết về tách chiết các hợp chất trong các dung môi làm cơ sở cho thực nghiệm. - Tìm hiểu đối tượng cần nghiên cứu là hoa sữa. - Lập kế hoạch, quy trình nghiên cứu thành phần dịch chiết hoa sữa trong dung môi n-hexan và clorofom. - Tổ chức thực hiện kiểm chứng lại giả thuyết đã nêu. 6. Các phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu lý thuyết - Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: + Phương pháp chọn mẫu + Chiết bằng các dung môi n-hexan và clorofom + Xác định thành phần các hợp chất trong dịch chiết từ vỏ hoa sữa trong dung môi chiết bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS. 7. Bố cục khóa luận Đề tài có cấu trúc gồm có 3 phần: - Phần mở đầu - Phần nội dung + Chương 1: Tổng quan + Chương 2: Những nghiên cứu thực nghiệm + Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận - Phần kết luận và kiến nghị 6 NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây hoa sữa 1.1.1. Sơ lược nguồn gốc cây hoa sữa trong giới thực vật Hoa sữa, hay còn gọi là mò cua, mù cua (danh pháp khoa học Alstonia scholaris (L.) R.Br) là một loài thực vật nhiệt đới thuộc chi Hoa sữa, họ Trúc đào, bộ Hoa vặn (Contortae) hay bộ Long đởm (Gentianales). Họ Trúc đào - Apocynaceae, là cây gỗ hay cây nhỏ, nhiều bộ phận của cây có nhựa mủ trắng. Lá thường mọc đối hoặc mọc vòng, đôi khi mọc cách, không có lá kèm. Hoa đơn độc hoặc tập hợp thành cụm hoa vô hạn hay cụm hoa xim. Hoa trừ bộ nhụy gồm 2 lá noãn (đôi khi 3-5). Hoa đều, tràng hợp hình ống, thường có phần phụ dạng vảy hoặc lông ở bên ống tràng, các thùy tràng xếp vặn. Số nhị bằng số cánh hoa, chỉ dính vào ống tràng, bao phấn hình mũi tên, trung đới có thể mang phần phụ là lông dài, hạt phấn rời nhau. Bầu trên, thường rời hoặc phân thùy, 1 vòi và 1 đầu nhụy. Đầu nhụy thường loe rộng, hình nón cụt và các bao phấn thường dính vào đó. Trong mỗi lá noãn hoặc trong mỗi ô của bầu có từ 2 đến nhiều noãn đảo. Quả thường gồm 2 đại, có khi quả hạch. Hạt có cánh hay chùm lông tơ, dễ phát tán. Phôi nhỏ và có nội nhủ. [1] Trúc đào là một họ lớn, có tới gần 200 chi và 2000 loài, phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở nước ta tìm thấy khoảng 50 chi và 170 loài, thường mọc trên các đồi hoặc rừng thưa, có một số loài cây trồng. Chất nhựa mủ ở trong cây họ Trúc đào thường có tính độc (như ở các chi Nerium, Strophanthus), có vị đắng, y học dùng làm thuốc. Ở một số ít cây, chất nhựa mủ này lại có tính đàn hồi như cao su. Trong cây, sợi libe rất vững chắc, do đó có thể dùng lấy sợi. Một số cây quen thuộc trong họ Trúc đào như: - Dây huỳnh (Allamanda cathartica L.): Cây bụi leo lá mọc vòng 4 chiếc một, hoa to, màu vàng. Cây trồng làm cảnh. - Trúc đào (Nerium odrorum L.): Cây nhỏ, lá mọc vòng 3 chiếc một, màu lục thẩm, dai cứng. Hoa thường có cánh kép, màu đỏ hồng hay trắng. Lá có chất độc, chứa neriolin, có thể dùng để chữa bệnh tim. Cây trồng làm cảnh. - Đại (Plumeria rubra L. var. acutifolia (Ait.) Woods.): Cây nhỡ, cành khỏe, lá lớn mọc cách, để lại những vết sẹo sau khi rụng. Hoa khá lớn, ngoài màu trắng, trong vàng, thơm. Một vài bộ phận cây được dùng làm thuốc: vỏ thân và vỏ rể có 7 tác dụng tẩy mạnh, hoa dùng chữa ho, lá dã đắp chữa sai khớp, bong gân, mụn nhọt, nhựa dùng như vỏ thân nhưng liều thấp hơn, còn dùng chữa chai chân và vết loét. Cây thường được trồng ở đình chùa làm cảnh. - Thông thiên (Thevetia peruviana (Pers.) K.Schum.): Cây nhỡ, lá mọc cách màu lục bóng. Hoa màu vàng, hình chuông. Quả màu lục. Cây trồng làm cảnh. Hạt chứa dầu và một số heterozit trong đó có chất thevetin được dùng chế thuốc chữa bệnh tim. Có nơi dùng hạt dã nát làm thuốc trừ sâu. Tuy nhiên, việc dùng thuốc chế từ cây này phải hết sức thận trọng vì rất độc. Ở đồi và rừng thưa ta hay gặp các loài như: - Sừng trâu (Strophantus divaricatus (Lour.) Hook. Et Arn.): Cây nhỏ, cao độ 3 - 4m, lá xanh bóng, hoa màu vàng nhạt, quả khô gồm 2 đại dính nhau ở gốc, nom như chiếc sừng trâu. Cây độc, hạt dùng chế thuốc chữa bệnh tim. - Thừng mức hay lồng mức (Wrightia annamensis Dub. et Eberh.): Cây gỗ nhỡ, hoa màu trắng hay vàng nhạt, mọc thành xim. Gỗ trắng, thớ mịn và nhẹ, dùng làm guốc và khắc dấu. Cây mọc nhiều ở rừng thưa và tái sinh khỏe ở các đồi hoang các tỉnh miền Bắc, miền Trung. [1] 1.1.2. Cây hoa sữa Hoa sữa hay mò cua (Alstonia scholaris (L.) R.Br.): Cây to cao khoảng 10 20m, vỏ nứt nẻ màu xám. Cành mọc vòng. Lá mọc vòng 5 - 8 cái, tập trung ở đầu cành; phiến lá dày, hình bầu dục. Hình 1: Cây hoa sữa ở thành phố Đồng Hới Hoa nhỏ, màu trắng đục, mọc thành xim tán ở nách lá, mùi thơm hắc, nhất là về đêm. Quả gồm hai đại dài và hẹp, chứa nhiều hạt. Hạt có mào lông ở hai đầu. 8 Hình 2: Hoa sữa Loài cổ nhiệt đới, mọc hoang và cũng được trồng khắp ở nước ta. Cây ưa sáng, sinh trưởng nhanh thường mọc ở ven rừng và ở những nơi ẩm như ven sông, ven suối. Tái sinh bằng chồi mạnh. Có thể trồng bằng cây con hay bằng cành, ra hoa vào tháng 10 - 11 và có quả chính tháng 1 - 2 hàng năm. Gỗ có thể làm gỗ dán và các đồ dùng thông thường. Thường được trồng làm cảnh, trồng ven đường phố và quanh các công trình công cộng để lấy bóng mát. Vỏ thân chứa nhiều Ancaloit (0,16 - 0,27%), được dùng nhiều làm thuốc. Thường dùng làm thuốc bỗ chữa thiếu máu, kinh nguyệt không đều, sốt rét cấp và mạn tính, đau bụng, ỉa chảy, kiết lỵ, viêm khớp có sưng nóng đỏ đau, bệnh ngoài da, lở ngứa. Vỏ cây sắc đặc dùng ngậm chữa sâu răng. Ở nước ta, vỏ cây hoa sữa được dùng làm dược liệu chế rượu bổ Dikatina. Ở Ấn Độ, vỏ được dùng trị sốt rét và cũng dùng trị ỉa chảy, kiết lỵ, và trị rắn cắn; dịch cây đáp các vết loét. Ở Thái Lan, vỏ cây dùng trị lỵ, trị cảm và viêm phế quản. Ở Trung Quốc, vỏ và lá dùng trị ho gà, viêm khí quản mạn tính, suyễn khan, sốt rét, cảm mạo phát sốt, sưng amygdal, viêm gan cấp tính, phong thấp, đòn ngã, gãy xương, mụn nhọt sưng đỏ. [5] 9 1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây hoa sữa Hoa sữa là một loài khá phổ biến ở Ấn Độ, vùng Nam Á, Đông Nam Á... vì vậy nhà khoa học trong và ngoài nước đã có các bài báo cáo, nghiên cứu về nó. Các nhà hóa học nghiên cứu về cây hoa sữa chủ yếu là nghiên cứu xác định thành phần hóa học trong các bộ phận của cây. Nhiều đề tài chủ yếu nghiên cứu về thành phần trong vỏ cây, lá. Một số nhà khoa học đã phân lập được một số chất có trong đó. Những nghiên cứu đó đã chỉ ra rằng trong thành phần hóa học của cây, các bộ phận trong cây có chứa Ancaloit. Hoa sữa được biết đến là thực vật giàu Ancaloit và có giá trị trong điều trị bệnh. Trong thành phần hóa học có ở các loài cây thì Ancaloit đóng vai trò quan trọng đến việc phát triển các loài thuốc mới, vì Ancaloit có một loạt cấu trúc hóa học và đã được xác định là quyết định đến tính chất dược lý của cây đó. Hầu như tất cả các bộ phận của cây như vỏ, rễ, lá, hoa, quả đều được phát hiện có chứa Ancaloit. Từ các bộ phận của cây hoa sữa, các nhà khoa học ở nhiều nước khác nhau trên thế giới đã phân lập các chất Ancaloit như sau: picirinine; scholaricine; echitamine; clorua echitamine; rhazine; nareline; dihydrocondylocarpine; 19,20-Zvallesamine; 19,20-E-vallesamine; alschmine và isoalschomine; mataranine A và B. Ngoài ra trong thành phần hóa học của hoa sữa còn có một số thành phần khác như: linalol; cis và trans oxit linalol; α – tecpineol; tecpinen-4-ol được tìm thấy trong hoa sữa. Một số hợp chất như: iridois; coumarin; flavonid; leucoanthocyanis; đường khử; phenolics đơn giản, steroids, saponin và tanin cũng được tìm thấy. [6], [7] 1.3. Hợp chất Ancaloit 1.3.1. Khái niệm Ancaloit là những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ, thường gặp ở trong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài động vật. Trên thực tế có rất nhiều loại thực vật có Ancaloit nhưng ở mức độ vết hoặc tỉ lệ phần vạn. Để giới hạn với thực tiễn, một cây được xem là có Ancaloit phải chứa ít nhất 0,05% Ancaloit so với mẫu cây khô. Đặc biệt của Ancaloit là có tác dụng hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là đối với hệ thần kinh. Với một lượng nhỏ, có Ancaloit là chất độc gây chết người, nhưng có khi lại là thần dược trị bệnh đặc hiệu. [2] 10 1.3.2. Thành phần nguyên tố và cấu tạo của Ancaloit a. Thành phần nguyên tố của Ancaloit Có 3 loại Ancaloit: - Loại chứa 3 nguyên tố: C, H, N. - Loại chứa 4 nguyên tố: C, H, N, O hoặc C, H, N, S. - Loại chứa 5 nguyên tố: C, H, N, O, S loại này có độc tính rất cao trong các loài nấm độc. [2] b. Cấu tạo của Ancaloit - Các Ancaloit thường có cấu tạo khác nhau, nhưng thường có nhân chứa dị vòng có nitơ như: - Các Ancaloit trong cùng một cây hoặc cùng một họ thực vật thường có công thức cấu tạo gần giống nhau. - Các Ancaloit trong cây thường kết hợp với các axit như axit oxalic, axit tacric, axit lactic, axit malic để tạo thành dạng muối. - Thành phần của các Ancaloit trong cây phụ thuộc nhiều vào từng vùng, khí hậu, địa lí, các mùa và các năm. Ancaloit thường chứa trong môt số bộ phận như: lá, hạt, rễ, vỏ... [4] 1.3.3. Phân loại Ancaloit Do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng được cho số lượng Ancaloit rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi, các Ancaloit được chia chia thành ba loại: - Ancaloit thật: Là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính bazơ, thường có chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp từ amino axit, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một axit hữu cơ, ngoại trừ: colchicin, axit aristolochic, Ancaloit tứ cấp. Các Ancaloit loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng hơn là theo dị vòng hoàn. - ProtoAncaloit: Được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescalin và N, N-đimetyltryptamin. Chúng là những amin đơn giản, được tổng 11 hợp từ các amino axit, trong đó nguyên tở nitơ không ở trong vòng dị hoàn. - Giả Ancaloit: là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino axit, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn là Ancaloit steroid và Ancaloit terpenoid. Hầu hết các Ancaloit hiện diện trong cây có hoa, loại 2 lá mầm, nhưng người ta cũng thấy Ancaloit trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật... Chỉ một đặc điểm chung thường gặp là tên của các Ancaloit thường tận cùng bằng chữ “ine”. [4] 1.3.4. Tính chất chung của Ancaloit a. Trạng thái Đa số Ancaloit không màu, ở trạng thái kết tinh rắn với điểm nóng chảy xác định hoặc có khoảng nhiệt độ phân hủy. Một vài Ancaloit ở dạng nhựa vô định hình, một vài Ancaloit ở dạng lỏng (nicotin, coniin) và một vài Ancaloit có màu (berberin màu vàng, betanidin màu đỏ). [4] b. Tính bazơ mạnh - Ancaloit là những hợp chất có tính bazơ yếu, do có sự có mặt của các nguyên tử nitơ. Tính bazơ của các Ancaloit cũng khác nhau tùy thùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R (mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nitơ. - Các Ancaloit thường có tính bazơ mạnh có thể làm xanh quỳ tím. - Các Ancaloit có thể tạo muối với các axit. - Một số Ancaloit có thể làm kết tủa Fe(OH)3, Al(OH)3 trong dung dịch. - Một số Ancaloit có tính bazơ mạnh đẩy được các bazơ trung bình ra khỏi muối của chúng. [2] c. Tính tan - Các Ancaloit tính bazơ yếu thì phải cần môi trường axit mạnh để tạo thành muối, tan trong nước. - Các Ancaloit ở dạng bazơ tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan tốt trong các dung môi hữu cơ như clorofom, dietyl eter, alcol bậc thấp. Các muối của Ancaloit thì tan trong nước, ancol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như clorofom, dietyl eter, benzen. Các protoancaloit và giả Ancaloit thường dễ tan trong nước. [4] 12 d. Tác dụng của ánh sáng Một số Ancaloit không bền ở ngoài ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại; có một số bị thái hóa khi chiếu tia sáng có bước sóng nhất định. [2] e. Hoạt tinh sinh lí cao Các Ancaloit có tác dụng vào hệ thần kinh rất mạnh và có tác dụng lý hóa đối với cơ thể người và động vật. Con người đã sử dụng các Ancaloit với liều lượng nhỏ để chữa bệnh hay giải khát như cacao, cà phê,... Nhiều Ancaloit là chất gây nghiện cực kỳ nguy hiểm đối với con người như thuốc phiện, heroin... Các Ancaloit có chứa S thường cố độc tính rất mạnh, người ta thấy các Ancaloit này trong các loài nấm độc. [4] 1.3.5. Sự tạo thành Ancaloit trong cây Trước đây người ta cho rằng nhân cơ bản của các Ancaloit hay thuộc chất chất của đường kết hợp với amoniac để có nitơ mà sinh ra. Ngày nay bằng các phương pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng xạ) người ta chứng minh được Ancaloit tạo ra từ các axit amin. Qua định tính và định lượng Ancaloit trong các bộ phận khác nhau của cây người ta thấy nơi tạo ra Ancaloit không phải luôn luôn là nơi tích tụ Ancaloit. Nhiều Ancaloit được tạo ra ở rễ lại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả hoặc hạt. [8] 1.3.6. Thuốc thử Ancaloit Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng tạo màu hoặc tạo kết tủa với Ancaloit, nhưng các thuốc thử này có thể cho kết quả dương tính với các hợp chất như: coumarin, polyphenol, purin, amino axit, protein, axit triterpen, hợp chất có chứa nitơ... Có ba thuốc thử thông dụng là: Mayer, Dragendorff, Wagner, ngoài ra còn có một số thuốc thử khác để phát hiện các loại Ancaloit đăc thù. [4] a. Thuốc thử Mayer Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất và hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất. Hỗn hợp hai dung dịch và thêm nước cho đủ 100ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch axit loãng có chứa Ancaloit, nếu có Ancaloit sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành sẽ hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi AcOH, etanol có sẵn trong dung dịch thử. 13 b. Thuốc thử Dragendorff Hòa tan 8,0 g nitrat bismuth Bi(NO3)3.H2O trong 25 ml HNO3 30% (d = 1.18). Hòa tan 28 g KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Hỗn hợp 2 dung dịch, để yên trong tủ lạnh 5oC cho tủa màu nâu sậm và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam đỏ được chứa trong chai màu nâu để che ánh sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu được vài tuần. Dung dịch dùng để định tính sự hiện diện của Ancaloit bằng ống nghiệm hoặc để làm dung dịch phun xịt lên bản mỏng. - Để định tính bằng ống nghiệm: Dung dịch axit loãng có chứa Ancaloit đựng trong ống nghiệm, nhỏ vài giọt thuốc thử Dragandorff vào ống nghiệm nếu có Ancaloit sẽ xuất hiện kết tủa màu cam nâu. (Tủa Ancaloit có thể được thu hồi bằng cách xử lý vơi Na2CO3 và chiết với dietyl eter). Thuốc thử không phản ứng với hợp chất amino axit, nhưng có thể cho kết quả dương tính với hợp chất có nhóm cacbonyl tiếp cách như pyron, cinamadehyd... - Để phun xịt lên tấm bản mỏng: Pha dung dịch phun xịt: trong một bình phun xịt, cho vào lần lượt theo thứ tự: 20ml nước; 5ml HCl 6N; 2 ml dung dịch thuốc thử Dragendorff ở trên và 5 ml NaOH 6 N. Dung dịch nếu trữ trong tủ lạnh có thể để lâu 10 ngày. Sử dụng dung dịch này phun xịt lên bản mỏng, nếu có Ancaloit sẽ cho vết màu cam đỏ. c. Thuốc thử Wagner Hòa tan 1,27 g I2 và 2 g KI trong 20 ml nước cất. Thêm nước cho đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch axit loãng có chứa Ancaloit, nếu có Ancaloit sẽ xuất hiện tủa màu nâu. d. Thuốc thử Iodoplatinat (dung dịch để phun xịt lên bản mỏng, phát hiện Ancaloit có nitơ trong vòng dị hoàn) Dung dịch clorua platin 10% (3ml) và 97 ml nước. KI 6 g và 94 ml nước. Hỗn hợp hai dung dịch này này lại, trữ dung dịch trong chai lọ màu nâu. 1.4. Flavonoit 1.4.1. Đại cương về flavonoit Flavonoit là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa... Phần lớn các flavonoit có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy, một số sắc tố có màu xanh, tím đỏ, không màu cũng xếp vào nhóm này vì 14 về mặt hóa học, chúng có cùng khung sườn căn bản. Flavonoit có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen A và B nối nhau qua một dây có 3 cacbon, nên thường được gọi là C6 – C3 – C6. Cách đánh số tùy theo dây C3 đóng hay hở. Nếu dây C3 đóng, thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxigen mang số 1 rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ. Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A. Thường flavonoit có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoit có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng glycosid. Các đường thường gặp nhất là đường D-glucose, kế đó là Dgalactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose và aixt uronic. Chalcon hiện diện ít trong tự nhiên, flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp; flavon và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Do có nhiều nhóm –OH phenol nên các flavonoit có thể liên kết với nhau để tạo thành phức tạp hơn hoặc tạo với các hợp chất khác có trong cây thí dụ kết hợp với đường để tạo thành glycosid... Các thuốc thử để định tính sự hiện của flavonoit: Có nhiều phương pháp để phát hiện flavonoit. - Phân biệt sơ bộ bằng hơi amoniac: Dưới ánh đèn tử ngoại UV365 và sự hiện diện của hơi amoniac, các flavonoit sẽ thay đổi màu sắc. Cao chiết cây được chấm hai chấm riêng biệt lên trên cung cùng một tấm sắc ký lớp mỏng, giải ly. Cắt bản mỏng ra làm đôi: một bản để tự nhiên, còn một bản đặt trong bình kính bão hòa bằng hơi bão hòa bằng amoniac và tiếp theo phun xịt bản bởi dung dịch 1% KOH/etanol. Lần lượt quan sát màu sắc của các vết trên 2 bản: dưới ánh sáng thường và dưới ánh đèn tở ngoại 365nm. Sự khác nhau về màu tùy theo hợp chất flavonoit. - Tác dụng với H2SO4 đậm đặc: Hòa tan hợp chất flavonoit vào H2SO4 đậm đặc; flavon và flavovol cho màu vàng đậm đến màu vàng cam và có phát huỳnh 15 quang đặc biệt. Chalcol, auron cho màu đỏ hoặc xanh dương – đỏ. Flavanon cho màu từ cam đến đỏ. - Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/etanol: Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch flavonoit hòa tan trong etanol, sẽ có màu vàng đến màu cam đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng. Flavonol cho màu từ vàng đến cam. Auron cho màu đỏ đến tím. - Tác dụng với dung dịch 1% AlCl3/ etanol: Tùy theo số lượng, vị trí của các nhóm hydroxy - OH, hợp chất flavonoid có màu khác nhau từ xanh lục đến xanh đen. - Tác dụng với dung dịch axetat chì (có tính kiềm) pha bão hòa trong nước: Phun xịt dung dịch lên bản mỏng, sấy bản 110oC trong 10 phút. - Phản ứng Cyanidin của Wilstatter: Phản ứng khử bột Mg trong HCl/etanol trên các dẫn xuất flavonoit. Cách thực hiện như sau: Chuẩn bị hai ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2ml cao chiết hòa tan trong metanol, ống 1 làm đối chứng. Với ống số 2: cho thêm 1ml ancol tert-butyl hoặc ancol isoamyl; 0.5ml HCl đậm đặc; 3 - 5 hạt magie kim loại. Đun nhẹ trong vài phút, sẽ xuất hiện màu ở lớp ancol phía trên. Nếu cao chiết có chứa flavon, flavanon, flavonol, flavanonol, xanthon dung dịch trong 2 ống sẽ có màu cam, đỏ hoặc tím. Nếu cao chiết có isoflavon, isoflavanon, auron dung dịch không đổi màu (kết quả âm tính). Nếu sử dụng bột Zn thay thế cho bột Mg, thì chỉ có flavanonol cho màu đỏ xậm, còn flavanon cho màu hồng nhạt hoặc không màu. [4] 1.4.2. Hợp chất flavonoid có trong cây hoa sữa Nghiên cứu trước đây cho thấy có 8 loại flavonoid trong cây hoa sữa gồm: kaempferol, quercetin, isorhamnetin, kaempferol-3-0-beta-D-galactopyranoside, quercetin-3-0-beta-D-galactopyranoside, isorhamnetin-3-0-beta-D-galactopyranoside,kaempferol-3-0-beta-D-xylopyranosyl-(2-1)-0beta-D-galac-topyranoside, quercetin-3-0-beta-D-xylopyranosyl-(21)-0-beta-D-galac-topyranoside. [3] 1.5. Phương pháp tách một số hợp chất hữu cơ có trong hoa sữa 1.5.1. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Áp suất hơi bão hòa của hỗn hợp chất lỏng tan vào nhau được xác định theo áp suất hơi của các cấu tử riêng theo định luật Raun: P = PA + PB Áp suất hơi của hỗn hợp, nếu không tạo thành hỗn hợp đẳng phí, nằm giữa áp suất hơi của các cấu tử riêng, còn nhiệt độ sôi của hỗn hợp nằm giữa nhiệt độ 16 sôi của hai cấu tử. Ngược lại, nếu hai chất thực tế không hòa tan vào nhau thì chúng không ảnh hưởng gì tới áp suất hơi bão hòa của hỗn hợp. Áp suất hơi bão hòa P được xác định bằng tổng áp suất hơi của từng cấu tử riêng, nên áp suất hơi của hỗn hợp lớn hơn áp suất hơi của từng cấu tử, còn nhiệt độ sôi luôn luôn thấp hơn nhiệt độ sôi của từng cấu tử. Trường hợp quan trọng nhất là chưng cất lôi cuốn hơi nước (hơi nước lôi cuốn cùng với chất hữu cơ). Chưng cất lôi cuốn hơi nước dùng để tách biệt hỗn hợp chất, trong đó có một chất dễ bay hơi với nước, để tinh chế chất khỏi chất phụ dạng nhựa, để phân tích hoàn toàn chất dễ bay hơi mà không chưng cất được dưới áp suất thường. Chưng cất lôi cuốn hơi nước có thể tiến hành dưới áp suất thường hay trong chân không. Phương pháp này dùng để tách, chiết các hợp chất terpen, dễ bay hơi có trong hoa sữa. Dụng cụ để cất lôi cuốn hơi nước gồm một bộ phận: bình cầu để tạo hơi nước, bình chứa hỗn hợp chất hữu cơ, bình cầu hứng, ống sinh hàn nước, ống bảo hiểm, ống nối. [2] Hình 3: Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước 1.5.2. Phương pháp chiết Phương pháp chiết là phương pháp thu lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để tách biệt, cô và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành cấu tử riêng. Có thể chiết từ hỗn hợp dung dịch hay từ chất rắn. Phương pháp để chiết các Ancaloit trong hoa sữa là sử dụng chiết chất lỏng. 17 Chiết từ dung dịch là quá trình chuyển từ chất lỏng này sang chất lỏng khác. Sự chuyển đó là tuân theo định luật phân bố chất tan giữa 2 tướng theo định luật phân bố của Nertz: K = CA / CB Trong đó: K - là hằng số phân bố CA, CB - là nồng độ chất tan trong dung môi A và B Chiết thực hiện được khi hệ số K khác 1 Chiết chất hữu cơ từ dung dịch (phần lớn là từ nước) là lắc dung dịch với dung môi thích hợp không trộn lẫn với dung môi cũ (thường là nước) và có khả năng hòa tan tốt chất hữu cơ hơn dung môi cũ. Dung môi phải chọn là dung môi có khả năng hòa tan lớn chất hơn dung môi cũ, dễ tách ra khi tinh chế lại thành chất tinh khiết không trộn lẫn vào dung môi cũ, có sự khác nhau về tỉ khối so với dung môi cũ; ít có khả năng tạo nhũ tương, ít nguy hiểm. Nếu chất tan xấu trong nước thì chỉ cần chiết một lần, ngược lại thì phải chiết nhiều lần, có khi phải dùng phương pháp chiết liên tục. Sau khi thu được dung dịch chiết, làm khô bằng chất làm khô rồi tinh chế bằng các phương pháp tinh chế thường. [2] Để tách chiết Ancaloit trong cây người ta thường dùng hai phương pháp chủ yếu là chiết tách bằng dung môi hữu cơ và chiết tách bằng dung dịch nước axit. a. Chiết với dung dịch axit: * Nguyên tắc tổng quát: Bột cây được tận chiết với metanol, dung môi rất tốt có thể chiết hết tất cả các Ancaloit ở dạng baz tự do, Ancaloit dạng tứ cấp N+, dạng N-oxit (N+→O), dạng glycosid, Ancaloit loại phân cực mạnh. * Ưu và nhược điểm của phương pháp: Khi sử dụng dung môi metanol hoặc etanol, sẽ chiết hết tất cả, nên sẽ khó khăn trong qua trình tách riêng các Ancaloit và các hợp chất hữu cơ. Phương pháp này không chiết tốt các Ancaloit có tính bazơ yếu, vì cần môi trường axit mạnh mới có thể tạo thành muối, tan trong nước. [4] * Quy trình thực hiện: 18 b. Chiết bằng dung môi hữu cơ * Nguyên tắc tổng quát: Bột cây được tẩm với dung dịch kiềm để chuyển đổi các Ancaloit ở dạng muối trở thành dạng bazơ tự do; kế tiếp bột cây này được chiết với một trong các loại dung môi hữu cơ như: benzen, dietyl eter, clorofom, etyl axetat... * Ưu nhược điểm của phương pháp Do tẩm với dung dịch kiềm để biến các muối (N+) thành dạng Ancaloit bazơ tự do, rồi chiết với clorofom nên phương pháp này không chiết được với những dạng N-oxit (N+→O); dạng N+ tứ cấp. Thêm nữa, việc sử dụng dung môi có tính phân cực trung bình như clorofom sẽ không chiết tốt các Ancaloit glycosid, các Ancaloit loại phân cực mạnh. Muốn khắc phục, trước khi chiết tách cần sử dụng bột kẽm Zn/HCl để khử dạng N-oxit thành dạng N tự do hoặc thủy giải Ancaloit glycosid bằng dung dịch axit; hoặc đổi dung môi clorofom bằng loại dung môi khác có tính phân cực mạnh hơn. Việc lựa chọn nồng độ kiềm cho giai đoạn này cần phải nghiên cứu kỹ. Việc tẩm bột cây bằng kiềm với nồng độ mạnh/ yếu khác nhau có thể có những ảnh hưởng. Đối với Ancaloit có tính baz tương đối mạnh, nếu dùng dung dịch kiềm yếu để kiềm hóa thì có thể không đẩy được Ancaloit ra khỏi muối của nó. Đối với Ancaloit chứa nhóm chức ester, amid... nếu dùng kiềm nồng độ quá mạnh có thể cắt đứt nối này. Đối với 19 Ancaloit có nhóm –OH phenol như morphin, nếu dùng kiềm mạnh như NaOH, sẽ tạo muối phenolat không tan trong dung môi hữu cơ như clorofom. [4] * Quy trình thực hiện 1.5.3. Phương pháp sắc ký 20