Tài liệu Nghiên cứu tách chiết và thu nhận exopolysaccharide sinh tổng hợp bởi lactobacillus fermentum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI ----------***---------- LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 8420201 TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ THU NHẬN EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP BỞI LACTOBACILLUS FERMENTUM HỌC VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN NGỌC BẢO NIÊN KHOÁ: 2019-2021 HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐỖ PHƢƠNG KHANH Hà Nội, 03/2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn Nguyễn Ngọc Bảo i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các giảng viên cao học của Khoa Công nghệ Sinh học – Trƣờng Đại học Mở Hà Nội, những ngƣời đã bền bỉ truyền đạt cho tôi nhiều kinh nghiệm, kiến thức, kỹ năng quý báu và đa dạng trong suốt khoá học. Tôi muốn dành lời cảm ơn đặc biệt tới PGS.TS. Tạ Thị Thu Thuỷ, Trƣởng Khoa Công nghệ sinh học. Không có sự giúp đỡ, định hƣớng kịp thời về chuyên môn của Cô, tôi đã không thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi trân trọng cảm ơn TS. Đỗ Phƣơng Khanh và ThS. Nguyễn Thị Phƣơng Thảo đã nhiệt tình hƣớng dẫn tôi làm thí nghiệm, trình bày luận văn và tập luyện thuyết trình. Tôi khắc ghi trong lòng tất cả sự động viên, hỗ trợ thầm lặng của đồng nghiệp, bạn bè và gia đình trong suốt quá trình tôi học thạc sĩ và tìm tòi theo đuổi đề tài thú vị này. Hà Nội, tháng 03 năm 2022 Học viên Nguyễn Ngọc Bảo ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................ii MỤC LỤC .......................................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. v DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................... vii MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.............................................................................................. 3 1.1 Giới thiệu về Lactobacilus fermentum ..................................................................... 3 1.2 Expolysacharide từ vi khuẩn LAB ............................................................................ 4 1.2.1 Cấu trúc EPS .............................................................................................................. 4 1.2.2 Sinh tổng hợp exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic ............................................. 7 1.2.3 Sự chuyển hóa tạo nên các loại đường trung gian ................................................ 8 1.2.4 Sự hoạt hóa và liên kết của các loại đường............................................................ 8 1.3 Điều kiện lên men chủng lactobacillus fermentum ............................................... 9 1.4 Tình tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic................10 1.4.1 Quá trình tách chiết và tinh chế EPS ....................................................................10 1.5 Ứng dụng của EPS ...................................................................................................11 1.5.1 Ứng dụng lĩnh vực y dược.......................................................................................11 1.5.2 Ứng dung EPS trong công nghệ thực phẩm .........................................................12 1.5.3 Ứng dụng tạo vật liệu nghiên cứu thí nghiệm sinh học ......................................12 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................14 2.1 Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................................14 2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ ...................................................................................14 2.2.1 Hóa chất ....................................................................................................................14 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ ......................................................................................................14 2.3 Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................16 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối ...........................................................16 2.3.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phép đo mật độ quang ..16 2.3.3 Phương pháp thu nhận và tách EPS (Vivek K.B. và cộng sự, 2016).................16 2.3.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TCA lên khả năng loại bỏ protein trong dịch lên men ...............................................................................................17 iii 2.3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thể tích ethanol và thời gian tủa lên quá trình thu nhận EPS tủa từ dịch nổi ..........................................................................17 2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng EPS bằng phenol-sulfuric...........................18 2.3.7 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford .................................21 2.3.8 Phương pháp phân tích thành phần monosaccharide của EPS bằng sắc ký lớp mỏng ....................................................................................................................................23 2.3.9 Phương pháp xử lý thống kê ...................................................................................25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ ..................................................................................................26 3.1 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng thu nhận EPS......................26 3.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến sinh tổng hợp EPS...................................26 3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp EPS ................................................27 3.1.3 Ảnh hưởng của môi trường lên men ......................................................................29 3.2 Khảo sát điều kiện thu nhận EPS từ dịch lên men ..............................................30 3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) tới khả năng loại bỏ protein .................................................................................................................................30 3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol đến khả năng tách EPS.................32 3.2.3 Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS .........33 3.3 Xây dựng quy trình tách và thu nhận EPS............................................................35 3.4 Phân tích EPS thu được bằng sắc ký lớp mỏng: ..................................................37 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN ................................................................................................39 4.1 Kết luận ........................................................................................................................39 4.2. Kiến nghị ....................................................................................................................39 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................40 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Abs BSA C CFU/mL EPS EtOH Fruc FTF Gal GalNAc GDP Glc Glc-1-P Glc-6-P GlcNAc GlcA Tiếng Anh Absorbance Bovine Serum Albumin Carbon Colony-Forming Unit/Ml Exopolysaccharide Ethanol Fructose Fructosyltransferase Galactose N-acetyl-D-galactosamine Galactose 1-phosphateuridyltransferase Guanosine diphosphate Glucose Glucose-6-phosphate Glucose-1-phosphate N-acetyl-D-glucosamine Glucuronic acid GRAS Generally Recognized As Safe GTF Glycosyltransferase HePS Heteropolysaccharide HMBC Heteronuclear Multiple – Bond Correlation HoPS Homopolysaccharide La. Lactococcus GalT Tiếng Việt Độ hấp thụ quang Cacbon số lƣợng tế bào/mL Cồn etylic Đƣợc công nhận là an toàn Polysaccharide phức tạp Polysaccharide dị thể Polysaccharide thuần Polysaccharide đồng thể v LAB Lac Lb. Leu. Man-6-P Man-1-P MRS N NDP OD PEP-PTS PGM PMM PS Rha S. Suc TCA TDP TFA TGP TLC TMS UDP Lactic Acid bacteria Lactose Lactobacillus Leuconostoc Mannose-6-Phosphate Mannose-1-Phosphate Man Rogosa Sharpe Nitrogen Diphosphate nucleoside Optical Density Phosphoenolpyruvatephosphotransferase Phosphoglucomutase Phosphomannomutase Polysaccharide Rhamnose Streptococcus Sucrose Trichloroacetic acid Tyrosine diphosphate Ttrifluoroacetic acid TDP-glucose pyrophosphorylase Thin Layer Chromatography Tetramethylsilan Uridine diphosphate vi Vi khuẩn lactic Nitơ Mật độ quang Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm ................................................ 14 Bảng 2.2: Nồng độ của các dung dịch dùng trong xây dựng đƣờng chuẩn D-glucose .... 19 Bảng 2.3: Nồng độ của các dung dịch dùng trong xây dựng đƣờng chuẩn BSA .............. 21 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến sinh trƣởng và tổng hợp EPS ...... 27 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng cacbon đến sinh tổng hợp EPS: ...................... 29 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) lên khả năng loại bỏ protein và hàm lƣợng EPS thu đƣợc .............................................................................. 31 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của thể tích ethanol so với dịch nuôi cấy đến khả năng tách chiết EPS............................................................................................................................ 34 Bảng 3.5: Kết quả phân tích thành phần EPS bằng TLC ............................................ 37 vii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Sơ đồ lên men thu nhận và tách EPS ............................................................ 17 Hình 3.1: Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS ......... 26 Hình 3.2: Ảnh hƣởng của thời gian thuỷ phân lên khả năng thu nhận EPS.............. 32 Hình 3.3: Ảnh hƣởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS ........ 33 Hình 3.4. Hình ảnh EPS sau khi tinh s ạch và thu nhận ............................................... 35 Hình 3.5: Sơ đồ qui trình cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ chủng Lb.fermentum...... 36 Hình 3.6: Kết quả chạy TLC Trong đó: 1-Mẫu EPS; 2-Chất chuẩn Glucose; 3-Chất chuẩn Mantose; 4-Chất chuẩn Galactose....................................................................... 37 viii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài: Exopolysaccharid (EPS) đƣợc phân lập từ vi sinh vật đặc biệt từ vi khuẩn Lactobacillus fermentum (LAB) có rất nhiều ứng dụng quan trọng. Nhiều ứng dụng thực tế đã đƣợc rõ tác dụng chống ung thƣ, điều hòa miễn dịch và kháng khuẩn nhƣ ức chế tế bào ung thƣ biểu mô (dòng SiHa) và kích thích sản xuất Il-6 và TNF- α bởi dòng đại thực bào THP-1. Các nghiên cứu khác chỉ ra rằng tính kháng khuẩn cũng chỉ ra đặc tính khử trùng tốt của các exopolysaccharid đƣợc nghiên cứu chống lại S. aureus và V. fischeri. Một số ứng dụng hoạt tính sinh học đƣợc mô tả có tác dụng hạ cholesterol máu. Việc thu nhận, tạo chế phẩm từ EPS đáp ứng nhu cầu sử dụng gia tăng các polymer tự nhiên ứng dụng trong công nghệ thực phẩm và công nghệ mỹ phẩm, EPS đóng vai trò là tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel. Những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS nhƣ khả năng chống oxy hóa, chống ung thƣ, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng đƣợc nghiên cứu. Do đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng nhƣ sự an toàn đối với sức khỏe con ngƣời thì vi khuẩn lactic lactic (LAB) đƣợc "công nhận là vi sinh vật an toàn" (GRAS-Generally Recognized As Safe). Vì vậy các chủng LAB đƣợc quan tâm nhiều để lên men sinh tổng hợp EPS và đồng thời chủng này có lợi thế hơn với EPS từ các loài khác (Vivek và cộng sự, 2016). Bên cạnh nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học đã đƣợc ghi nhận, EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhƣợc điểm là năng suất thu nhận thấp là lý do chính khiến khả năng thƣơng mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic Acid Bacteria) nói riêng. Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết ra bên ngoài môi 1 trƣờng. Các PS tách chiết đƣợc có sự đa dạng về cấu trúc và tính chất, chức năng (Zhou và Li, 2015). Việc nghiên cứu, lên men tăng hiệu suất sinh tổng hợp EPS và cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS đƣợc coi là điểm mấu chốt để sản xuất EPS nhằm ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm, y học. Để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS từ lên men, đến thu nhận, tách chiết EPS sinh tổng hợp từ một chủng LAB là chủng Lactobacillus fermentum BR11, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tách chiết và thu nhận exopolysaccharide sinh tổng hợp bởi Lactobacillus fermentum”. Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát đƣợc các điều kiện lên men thích hợp và xây dựng đƣợc quy trình thu nhận và tách chiết exopolyschacaride tạo ra từ chủng Lactobacillus fermentum BR11. Nội dung nghiên cứu:  Nghiên cứu các điều kiện thích hợp lên men thu nhận EPS từ chủng Lactobacillus fermentum.  Xây dựng quy trình tách và thu nhận EPS. Thời gian và địa điểm nghiên cứu: Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2020 đến tháng 11/2021. Địa điểm nghiên cứu: Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử của Khoa Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Mở Hà Nội tại Nhà C, 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về Lactobacilus fermentum Lactobacillus fermentum là chủng vi khuẩn Gram dƣơng thuộc chi Lactobacillus, thƣờng đƣợc tìm thấy trong lên men từ động vật hoặc thực vật (Ramchandran cs, 2009, Amjres và cs., 2015). Lactobacillus fermentum là những vi khuẩn ƣa ẩm, có nhu cầu dinh dƣỡng phức tạp, lên men dị hình và có thể lên men đƣờng nhƣ glucose (glc), fructose (fruc), maltose, sucrose, lactose. Lactobacillus fermentum (LAB) là vi khuẩn Gram (+), là vi khuẩn đƣờng ruột lên men hữu ích thuộc chi Lactobacillus, thƣờng có mặt trong hệ tiêu hoá của ngƣời và động vật. Một số chủng Lactobacillus đƣợc coi là vi khuẩn có lợi hoặc vi khuẩn thân thiện ở động vật. Chủng đã đƣợc "công nhận là vi sinh vật an toàn" theo đánh giá cục dƣợc của Mỹ (GRAS-Generally Recognized As Safe) (hình 1.1). Vi khuẩn lactic có dạng lƣỡng cầu, tứ cầu, liên cầu hoặc hình que, đứng đơn độc hoặc thành chuỗi. Chúng có nhu cầu dinh dƣỡng cao và khả năng sinh tổng hợp thuộc dạng yếu. Hầu hết các vi sinh vật sinh axít lactic đều thuộc họ Lactobacillaceae và đƣợc xếp vào 4 chi: Streptoccocus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc. Vi khuẩn Lactobacillus sinh axít lactic và các cơ chất khác nhau tạo môi trƣờng bất lợi cho vi khuẩn gây thối phát triển trong đƣờng tiêu hoá. Những vi khuẩn gây thối rữa ở ruột kết (ruột già, đại tràng) tạo ra các enzyme beta-glucuronidase, azoreductase và nitroreductase, thúc đẩy sự xuất hiện của carcinogen (chất có vai trò trong việc hình thành và phát triển khối u) bằng các ức chế cạnh tranh và tạo môi trƣờng axít không thuận lợi. Ngƣợc lại, vi khuẩn Lactobacillus kìm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn trong ruột kết dẫn tới làm giảm sự hình thành carcinogen gây ung thƣ đại tràng. Chủng Lb. fermentum có thể tạo thành các khuẩn lạc màu trắng xám với đƣờng kính khoảng 1μm (Hình 1.1a).. Hình dạng khuẩn lạc có thể lồi 3 lõm hoặc hơi lồi, bề mặt nhẵn (Hình 1.1b, 1.1c). Đặc điểm nổi bật của khuẩn lạc Lb. fermentum là có cấu trúc vòng tròn đồng tâm khi đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi (Hình 1.1c). Hầu hết các tế bào vi khuẩn đƣợc sắp xếp dƣới dạng đơn lẻ hoặc theo cặp, không có khả năng sinh bào tử và không di động Hình 1.1. Hình dạng khuẩn lạc Lactobacillus fermentum Từ lâu, Lb. fermentum đã đƣợc sử dụng nhƣ là giống khởi đầu cho quá trình lên men trong nhiều sản phẩm thực phẩm và đồ uống.Giống nhƣ các loài thuộc LAB khác, trong quá trình lên men carbonhydrate, ngoài sản phẩm chính là acid latic, Lb. fermentum còn tạo ra các hợp chất tạo hƣơng (diacetyl/acetoin) và đặc biệt là các EPS. Do có tính tạo gel, tạo kết cấu, tạo độ đặc trong thực phẩm nên chúng ngày càng quan trọng và có giá trị. Chúng có tiềm năng làm probiotic, làm giảm cholesterol, kích thích miễn dịch, chống ung thƣ. 1.2 Expolysacharide từ vi khuẩn LAB 1.2.1 Cấu trúc EPS Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate và thƣờng đƣợc coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng nhƣ là nguồn năng lƣợng dự trữ (tinh bột, glycogen), tạo nên cấu trúc vững chắc cho 4 thực vật hoặc động vật (cellulose, chitin), là chất bảo vệ (exopolysaccharide của vi sinh vật) (De Vuyst L. và cs., 1999). Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển, vi khuẩn có thể sinh tổng hợp nhiều loại PS khác nhau. Tùy theo vị trí trên tế bào, các PS đó có thể là nội bào hoặc ngoại bào. Những PS đƣợc tiết ra bên ngoài màng tế bào đƣợc gọi là PS ngoại bào. Chúng có thể tạo thành một chất dính bám chặt gọi là PS dạng màng bao, hoặc cũng có thể đƣợc gắn lỏng lẻo hay đƣợc bài tiết hoàn toàn ra môi trƣờng dƣới dạng chất nhờn gọi là EPS, theo các nghiên cứu đã công bố của Cerning J. (1995), Patel S. và cộng sự (2012). Cụ thể hơn, đây là những PS chuỗi dài, phân nhánh với các đơn vị lặp đi lặp lại của các monosaccharide hoặc các dẫn xuất của monosaccharide (Nwodo U.U. và cộng sự, 2012). Trong các nghiên cứu lần lƣợt bởi Sutherland I.W. (1972), Cerning J (1995); Tala., S. (2009); Badel S. và cộng sự (2011), căn cứ vào thành phần monosaccharide và đặc biệt là cơ chế sinh tổng hợp, các EPS từ vi khuẩn lactic đƣợc chia thành hai nhóm lớn là các polysaccharide dị thể heteropolysaccharide (HePS) và các polysaccharide đồng thể homopolysaccharide (HoPS). Hình 1.2: Cấu trúc dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS 5 - - Nhóm homopolysaccharide (HoPS) HoPS là những PS đƣợc cấu tạo từ một loại monosaccharide (dạng hexose) nhƣ D-glucose hoặc D-fructose. Các chi thuộc vi khuẩn lactic nhƣ Lactobacillus, Leuconostoc (Leu.), Streptococcus (S.) đƣợc biết đến nhƣ là nguồn sinh tổng hợp HoPS. Hình 1.2.1a. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS - Nhóm heteropolysaccharide (HePS) Khác với các HoPS, các HePS có sự đa dạng về thành phần, tỷ lệ monosaccharide và cấu trúc phân tử của các đơn vị lặp đi lặp lại, cũng nhƣ đặc điểm cấu tạo và khối lƣợng phân tử của polymer (Hình 1.3). Quá trình sinh tổng hợp của các HePS xảy ra trong tế bào, gồm một chuỗi các phản ứng phức tạp liên quan đến hệ enzyme nội bào của vi khuẩn lactic và thƣờng trải qua ba giai đoạn: (a) sự hấp thu cơ chất, (b) sự chuyển hóa đƣờng trung gian và (c) quá trình tổng hợp PS (Kumar và cộng sự, 2007). Hình 1.2.1b.Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS 6 1.2.2 Sinh tổng hợp exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic Quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng vi khuẩn lactic có thể xảy ra ở bên trong hoặc ở bên ngoài tế bào. Đây là một quá trình phức tạp với nhiều phản ứng sinh hóa đƣợc xúc tác bởi enzyme (Laws và cộng sự, 2008; Patel và Prajapati, 2013). Quá trình tổng hợp HoPS xảy ra ở bên ngoài tế bào nhờ sự xúc tác của các enzyme đặc hiệu glycosyltransferase (GTF - glucansucrase) hoặc fructosyl- transferase (FTF - fructansucrase). Các enzyme này từ nội bào di chuyển ra bên ngoài tế bào nhờ tín hiệu xuất. Sau đó, chúng xúc tác thủy phân sucrose thành glucose (glc) và fructose (fruc), tạo ra liên kết glycoside của glc hoặc fruc với một phân tử chất nhận thành chuỗi glucan hoặc fructan. Đây chính là các HoPS ngoại bào hay các EPS (Hình 1.2). Hình 1.3: Mô hình về quá trình sinh tổng hợp EPS 7 Một số vi khuẩn sản xuất một lƣợng lớn các phân tử polysaccharide có trọng lƣợng phân tử cao, còn gọi là exopolysaccharide. Lớp áo ngoại bào này đƣợc gọi là vỏ vi khuẩn. Khả năng sản xuất vỏ là một trong những yếu tố độc lực quan trọng nhất của vi khuẩn về phƣơng diện xâm nhập tại vị trí viêm. Cụ thể, vỏ vi khuẩn giúp vi khuẩn chống lại cơ chế phòng vệ của cơ thể cũng nhƣ đề kháng kháng sinh. 1.2.3 Sự chuyển hóa tạo nên các loại đƣờng trung gian Quá trình chuyển hóa này gồm hai giai đoạn: giai đoạn tổng hợp glucose-1-phosphate (Glc-1P) và giai đoạn hoạt hóa, liên kết của các loại đƣờng. Khi vào tế bào chất, glc trải qua quá trình glycolysis và phosphoryl hóa. Đây là chìa khóa trung gian quan trọng gắn kết các quá trình đồng hóa trong sự tổng hợp EPS và các quá trình dị hóa để phân giải đƣờng. Trƣớc hết, dƣới tác dụng của hexokinase, glc tạo thành glucose-6-phosphate (Glc-6P). Sau đó, dƣới tác dụng của phosphoglucomutase (PGM), Glc-6P đƣợc chuyển thành Glc-1P. 1.2.4 Sự hoạt hóa và liên kết của các loại đƣờng Glc-1P tiếp tục đƣợc chuyển hóa thành các nucleotide-đƣờng (NDP) nhƣ Uridine diphosphate glucose (UDP-glc) và Thymidine diphosphate glucose (TDPglc), nhờ xúc tác của các enzyme tƣơng ứng là UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP) và TDP-glucose pyrophosphorylase (TGP). Nhƣ vậy, khác với các HoPS, ngoài glc và fruc, HePS còn đƣợc cấu tạo bởi các monome đa dạng hơn nhƣ D-gal, L-rham, v.v. và có sự phân nhánh nhiều hơn. Thành phần của các tiểu đơn vị monosaccharide và cấu trúc của các đơn vị lặp lại thƣờng không cố định (Groben G.J. và cộng sự, 1996). Trong đó, D-gal, D-glc và L-rham hầu nhƣ luôn có mặt nhƣng với tỷ lệ khác nhau. Sự khác biệt giữa HoPS và HePS không chỉ thể hiện qua tính chất hoá học và bản chất của các mối liên kết, mà còn thể hiện thông qua các enzyme 8 tổng hợp và vị trí tổng hợp nên chúng (Nuria S. và cộng sự, 2008; Badel S. và cộng sự, 2011). 1.3 Điều kiện lên men chủng Lactobacillus fermentum a. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon: Nguồn carbon có ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp EPS nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới thảo luận về cách thức cải thiện quá trình sinh tổng hợp EPS từ vi khuẩn lactic, tiêu biểu nhƣ De Vuyst L. và De Vin F. (2007), Những nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc tối ƣu hóa quá trình sinh tổng hợp EPS. Tuy nhiên,vi khuẩn lactic rất đa dạng nên cần có những nghiên cứu chi tiết hơn về quá trình sinh tổng hợp EPS của từng chủng và quy trình thực hiện để cải thiện đáng kể năng suất sinh tổng hợp EPS. Grobben và cộng sự (1996) đã kết luận rằng, hàm lƣợng và thành phần của các EPS sinh tổng hợp bởi Lb. delbruckii. subsp. bulgaricus NCFB 2772 trong các môi trƣờng chứa nguồn C khác nhau là không giống nhau. Trong khi đó, công bố của Degeest và De Vuyst (1999) chỉ ra rằng, thành phần EPS tổng hợp từ S. thermophilis không có sự thay đổi khi chủng này đƣợc nuôi cấy trên các nguồn carbohydrate khác nhau. Theo nghiên cứu của De Vuyst L, sucrose chính là cơ chất đƣợc vi khuẩn lactic sử dụng để sinh tổng hợp EPS. Trong quá trình này, sucrose đƣợc thủy phân thành glc và fruc là những cơ chất mới. Phản ứng này cũng có vai trò cung cấp năng lƣợng cho quá trình tổng hợp nên các PS (De Vuyst L. và De Vin F, 2007). b. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen (N) Quá trình phát triển và sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn lactic cũng tăng lên khi bổ sung thêm vào môi trƣờng nuôi cấy các nguồn nitrogen (N) với tỷ lệ khác nhau hoặc các nguồn có chứa ni tơ khác nhau. Tỷ lệ N khác nhau 9 trong môi trƣờng dinh dƣỡng có ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu suất sinh tổng hợp EPS ( Harutoshi T, 2013), Patel A và cs, 2013, Vivek và cs, 2016). c. Ảnh hƣởng của pH theo thời gian lên men của LAB Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển, chủng Lb. fermentum chịu tác động bởi các yếu tố thời gian và pH. Lactobacillus fermentum có khả năng tác động nhƣ một lợi khuẩn nội tại trong hệ tiêu hóa, là thành viên của chi Lactobacillus, thuộc nhóm các vi khuẩn thƣờng đƣợc phân lập tại đƣờng ruột hoặc trong các sản phẩm lên men từ sữa, trong thực vật lên men, trong bột bánh mì. Lactobacillus có thể phát triển tốt ở môi trƣờng axít có pH 5,5 – 6,2. Tuy nhiên, ngay cả ở pH dƣới 5,0 chúng cũng có thể tồn tại đƣợc. 1.4 Tình tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 1.4.1 Quá trình tách chiết và tinh chế EPS Quá trình thu nhận các PS ngoại bào của vi khuẩn từ môi trƣờng lỏng thƣờng đƣợc thực hiện qua nhiều công đoạn, bắt đầu bởi việc loại bỏ protein, tế bào. (1) Loại bỏ protein, tế bào bằng ly tâm hoặc lọc: Việc sử dụng axít Tricloroacetic (TCA) để loại bỏ protein hoặc peptide trong môi trƣờng lên men đã đƣợc đề xuất bởi Garcia- Garibay M. và Marshall V.M.E. (1991). Phƣơng pháp này có ƣu điểm là nhanh hơn so với các kỹ thuật đã đề cập trƣớc đó. Tuy nhiên, một tỷ lệ lớn EPS sẽ đồng kết tủa trong TCA và do đó cần phải rửa kết tủa ít nhất một hoặc hai lần để thu nhận EPS đƣợc tốt nhất (Cerning J., 1995). (2) Tách polymer kết tủa: Các polyme kết tủa từ dịch nổi đƣợc thu nhận bằng cách cho thêm tác nhân kết tủa là một dung môi tan đƣợc trong nƣớc (ví dụ là methanol, ethanol, isopropanol hoặc acetone) trong khi các polyme thì không tan. Tỉ lệ dung môi sử dụng có thể là 1, 2 hoặc 3 so với dịch nuôi cấy (Welman A.D. và Maddox I.S., 2003). 10 (3) Thu polyme kết tủa bằng cách sấy đông khô trong phòng thí nghiệm hoặc sấy trống (quy mô công nghiệp): Đầu tiên, các EPS kết tủa đƣợc thu nhận bằng cách ly tâm, sau đó hòa tan lại với nƣớc cất và tiến hành thẩm tích để loại bỏ các loại đƣờng còn lại hoặc các thành phần hòa tan khác trong môi trƣờng. Các EPS này sau đó đƣợc đông khô ở nhiệt độ lạnh và bảo quản ở 4°C (Vivek và cộng sự, 2016). Tinh chế EPS theo cách này có thể làm giảm hiệu suất thu nhận sản phẩm, vì thế cần xem xét đầy đủ mối tƣơng quan giữa mức độ thu nhận sản phẩm, độ tinh khiết của sản phẩm và các tác động đến tính chất của sản phẩm để lựa chọn quy trình phù hợp. Các thông số liên quan trong từng phƣơng pháp tách chiết và tinh chế EPS từ vi khuẩn lactic đã đƣợc nhiều nhóm tác giả thảo luận nhƣ Nuria S. và cộng sự (2008), Seesuriyachan P. và cộng sự (2011). Tuy nhiên, các thông số chƣa đầy đủ nên rất cần có những nghiên cứu tiếp theo để làm sáng tỏ quy trình tách chiết và thu nhận EPS sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic đem lại hiệu suất cao, gồm EPS sinh tổng hợp bởi chủng Lactobaccillus fermentum. 1.5 Ứng dụng của EPS 1.5.1 Ứng dụng lĩnh vực y dƣợc - Hoạt động nhƣ là prebiotics và probiotics, đƣợc biết đến là những thành phần không phải dạng sống và không tiêu hóa đƣợc, có tác dụng kích thích vi khuẩn trong ruột. Chúng thƣờng là các oligosaccharide với mức độ polyme hóa trong phạm vi giữa 2 và 20 monome; đƣợc chuyển hóa bởi các vi khuẩn có lợi cho sức khỏe và cải thiện khả năng miễn dịch để chống lại các mầm bệnh (Laws và cộng sự, 2008). - Chống viêm loét dạ dày và làm giảm cholesterol. Tác động chống viêm loét dạ dày trên chuột của các sản phẩm sữa lên men từ các chủng S. thermophilus (CRL 1190 và CRL 804) có khả năng sinh tổng hợp EPS đã đƣợc công bố khi so sánh với sản phẩm lên men bởi các chủng không sinh 11