Tài liệu Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ loài sao biển acanthaster planci

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- ĐINH THỊ HÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, CHUYỂN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA STEROID TỪ LOÀI SAO BIỂN ACANTHASTER PLANCI LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội-2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- ĐINH THỊ HÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, CHUYỂN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA STEROID TỪ LOÀI SAO BIỂN ACANTHASTER PLANCI Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 9 44 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Trần Thị Thu Thủy 2. PGS. TS. Ngô Đại Quang Hà Nội-2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Trần Thị Thu Thủy và PGS. TS. Ngô Đại Quang. Các số liệu và kết quả được nêu trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Đinh Thị Hà LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới hai người thầy hướng dẫn là PGS. TS. Trần Thị Thu Thủy – Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên (INPC), Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, và PGS. TS. Ngô Đại Quang – Tập đoàn hóa chất Việt Nam, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, định hướng nghiên cứu một cách khoa học cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Lãnh đạo Học Viện Khoa học và Công nghệ, Ban Lãnh đạo Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn tạo điều kiện cho tôi được học tập và sử dụng các thiết bị tiên tiến của Viện để hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra của luận án. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Hội đồng Khoa học Viện hóa học các Hợp chất thiên nhiên, GS. TS. Phạm Quốc Long, GS. TS. Lê Mai Hương, PGS. TS. Nguyễn Mạnh Cường về những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc hoàn thiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Viện sĩ Valentin A. Stonik, TSKH Alla A. Kicha – Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), Viện Hàn lâm Khoa học liên bang Nga đã tạo điều kiện cho tôi được thực tập, học hỏi và tiếp cận các phương pháp nghiên cứu cũng như các trang thiết bị tiên tiến của Viện trong quá trình làm thực nghiệm và hoàn thiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Lee Jae Wook - Viện Khoa học và Công nghệ Hàn Quốc (KIST) tại Gangneung, Hàn Quốc và TS. Đỗ Hữu Nghị (INPC) đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thử nghiệm các nghiên cứu về hoạt tính sinh học. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Đoàn Lan Phương và tập thể cán bộ Phòng Hóa sinh hữu cơ (INPC), bạn bè đồng nghiệp và gia đình đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Tác giả luận án Đinh Thị Hà i MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................v DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................... vii DANH MỤC BẢNG....................................................................................................viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .....................................................................................x MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3 1.1. Giới thiệu chung về sao biển (Asteroidea) ............................................................... 3 1.2. Các nghiên cứu về lớp chất steroid phân cực từ các loài sao biển ........................... 4 1.2.1. Polyhydroxysteroid ........................................................................................ 4 1.2.2. Steroid sulfate ................................................................................................ 6 1.2.3. Steroid glycoside ........................................................................................... 7 1.2.3.1. Polyhydroxysteroid glycoside .................................................................. 8 1.2.3.2. Asterosaponin ......................................................................................... 12 1.2.3.3. Cyclic steroid glycoside ......................................................................... 13 1.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid phân cực từ sao biển ......................... 14 1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư ..................................................... 15 1.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus .................................... 16 1.3.3. Hoạt tính điều hòa miễn dịch ....................................................................... 16 1.4. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 17 1.4.1. Đặc điểm sinh học và phân bố của loài sao biển Acanthaster planci.......... 17 1.4.2. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học loài sao biển Acanthaster planci trên thế giới............................................................................................................. 18 1.4.2.1. Steroid tự do (sterol và polyhydroxysteroid) ......................................... 19 1.4.2.2. Polyhydroxysteroid glycoside ................................................................ 20 1.4.2.3. Asterosaponin ......................................................................................... 20 1.4.2.4. Glycosphingolipid .................................................................................. 21 1.4.2.5. Các hợp chất khác .................................................................................. 24 1.4.3. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài sao biển Acanthaster planci 25 1.4.3.1. Hoạt tính tán huyết ................................................................................. 25 1.4.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ........................................................................ 25 1.4.4. Tình hình nghiên cứu loài sao biển Acanthaster planci tại Việt Nam ........ 26 ii 1.5. Tình hình cứu tổng hợp các hợp chất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid từ steroid tự nhiên trên thế giới ......................................................................................... 27 1.5.1. Tổng hợp các hợp chất polyhydroxysteroid từ steroid tự nhiên .................. 28 1.5.2. Tổng hợp các hợp chất hydroximinosteroid từ steroid tự nhiên.................. 31 1.6. Tình hình nghiên cứu tổng hợp các hợp chất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid từ steroid tự nhiên tại Việt Nam ................................................... 35 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................37 2.1.Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................. 37 2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................ 37 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất ............................................................. 37 2.2.2.Phương pháp xác định cấu trúc ..................................................................... 38 2.2.3. Các phương pháp đánh giá hoạt tính ........................................................... 39 2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào .................................... 39 2.2.3.2. Phương pháp thử nghiệm khả năng ức chế hình thành khối u trên thạch mềm 41 2.2.3.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú bằng xét nghiệm chữa lành vết thương (wound-healing assay) ...................... 41 CHƯƠNG III - THỰC NGHIỆM ..............................................................................42 3.1. Phân lập các hợp chất từ loài sao biển Acanthaster planci .................................... 42 3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được ............................. 47 3.2.1. Hợp chất Planciside A (AP1)(Hợp chất mới). ............................................. 47 3.2.2. Hợp chất Planciside B (AP2) (Hợp chất mới) .............................................. 48 3.2.3. Hợp chất Planciside C (AP3) (Hợp chất mới) .............................................. 48 3.2.4. Hợp chất Planciside D (AP4) ....................................................................... 49 3.2.5. Hợp chất AP11: Acanthaglycoside G (Hợp chất mới) ................................. 49 3.2.6. Hợp chất AP12: Pentareguloside G.............................................................. 50 3.2.7. Hợp chất AP13: Acanthaglycoside A .......................................................... 50 3.2.8. Hợp chất AP14: Maculatoside ..................................................................... 50 3.2.9. Hợp chất AP5: 3-O-sulfothornasterol A ...................................................... 51 3.2.10. Hợp chất AP6: 5-ergost-7-en-3-ol ......................................................... 51 3.2.11. Hợp chất AP7: Cholesterol ......................................................................... 51 3.2.12. Hợp chất AP8: Astaxanthin ........................................................................ 51 3.2.13. Hợp chất AP9: Thymine ............................................................................. 51 3.2.14. Hợp chất AP10: Uracil ............................................................................... 51 3.3. Tổng hợp các dẫn xuất của cholesterol .................................................................. 51 iii 3.3.1. Tổng hợp các dẫn xuất polyhydroxysteroid từ cholesterol .......................... 51 3.3.1.1. Tổng hợp chất cholest-3β,6α-diol (15c) và cholest-3β,6β-diol (16c) .... 51 3.3.1.2. Tổng hợp chất cholestan-5-ene-3β,4β-diol (17c), cholestan-5-ene-3β,7βdiol (18c) và cholestan-5-ene-3β,4β,7β-triol (19c) .............................................. 52 3.3.1.3. Tổng hợp chất cholestane-3β,5α,6α-triol (20c) ..................................... 54 3.3.1.4. Tổng hợp chất cholestane-3β,5α,6β-triol (21c)...................................... 54 3.3.2. Tổng hợp các dẫn xuất hydroximinosteroid từ cholesterol ......................... 55 3.3.2.1. Tổng hợp chất cholest-4-ene-3,6-dione (22c) và cholestane-3,6-dione (24c) ......... 55 3.3.2.2. Tổng hợp chất cholest-4-ene-3β,6α-diol (26c) ...................................... 56 3.3.2.3. Tổng hợp chất 6α-hydroxy-4α,5α-epoxycholeatane-3-one (27c) và 4α,5α-epoxycholeatane-3,6-dione (28c) .............................................................. 56 3.3.2.4. Tổng hợp các hydroximinosteroid (23c, 25c,29c,31c) và chất 30c ....... 57 3.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và các dẫn xuất tổng hợp được ...... 59 3.4.1. Hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid phân cực phân lập từ sao biển Acanthaster planci .................................................................................................. 59 3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất tổng hợp được từ cholesterol .... 60 CHƯƠNG IV – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................61 4.1. Nghiên cứu thành phần hóa học loài sao biển Acanthaster planci ........................ 61 4.1.1. Hợp chất AP1: Planciside A (Hợp chất mới) ............................................... 61 4.1.2. Hợp chất AP2: Planciside B (Hợp chất mới) ............................................... 67 4.1.3. Hợp chất AP3: Planciside C (Hợp chất mới) ............................................... 72 4.1.4. Hợp chất AP4: Planciside D ......................................................................... 76 4.1.5. Hợp chất AP11: Acanthaglycoside G (Hợp chất mới) ................................. 81 4.1.6. Hợp chất AP12: Pentareguloside G.............................................................. 88 4.1.7. Hợp chất AP13: Acanthaglycoside A .......................................................... 93 4.1.8. Hợp chất AP14: Maculatoside ..................................................................... 97 4.1.9. Hợp chất AP5: 3-O-sulfothornasterol A .................................................... 100 4.1.10. Hợp chất AP6: 5-ergost-7-ene-3-ol ..................................................... 102 4.1.11. Hợp chất AP7: Cholesterol ....................................................................... 104 4.1.12. Hợp chất AP8: Astaxanthin ...................................................................... 106 4.1.13. Hợp chất AP9: Thymine ........................................................................... 109 4.1.14. Hợp chất AP10: Uracil ............................................................................. 109 4.2. Chuyển hóa hóa học của cholesterol .................................................................... 112 4.2.1. Chuyển hóa các dẫn xuất polyhydroxysteroid ........................................... 113 iv 4.2.1.1 Hợp chất cholestane-3β,6α-diol (15c) và cholestane-3β,6β-diol (16c) . 113 4.2.1.2. Hợp chất cholestan-5-ene-3β,4β-diol (17c), cholestan-5-ene-3β,7β-diol (18c) và cholestan-5-ene-3β,4β,7β-triol (19c) ................................................... 115 4.2.1.3. Hợp chất cholestane-3β,5α,6α-triol (20c) ............................................. 117 4.2.1.4. Hợp chất cholestane-3β,5α,6β-triol (21c) ............................................. 119 4.2.2. Chuyển hóa các dẫn xuất hydroxyminosteroid .......................................... 120 4.1.2.1. Hợp chất cholest-4-ene-3,6-dione (22c) và cholestane-3,6-dione (24c)…………………………………………………………………………...121 4.1.2.2. Hợp chất cholest-4-ene-3β,6α-diol (26c) .............................................. 123 4.1.2.3. Hợp chất 6α-hydroxy-4α,5α-epoxycholestane-3-one (27c) và 4α,5αepoxycholestane-3,6-dione (28c) ....................................................................... 124 4.1.2.4. Các hợp chất hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 31c) và hợp chất 30c……………………………………………………………………………..125 4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học ................................................................. 129 4.3.1. Hoạt tính của các hợp chất steroid glycoside phân lập từ sao biển Acanthaster planci. ............................................................................................... 129 4.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất cholesterol .............................. 134 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 137 5.1. Kết luận ................................................................................................................ 137 5.2. Kiến nghị .............................................................................................................. 139 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN………………………......................145 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN .................. 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 143 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc đại diện của glycosphingolipid ..................................................... 211 Hình 3.1: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ sao biển Acanthaster planci...................... 422 Hình 4.1: Phổ (+) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP1 ............................................... 611 Hình 4.2: Phổ (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP1 ................................................ 611 Hình 4.3: Phổ 1H-NMR của hợp chất AP1 ................................................................. 622 Hình 4.4: Phổ 13C-NMR của hợp chất AP1 ................................................................ 633 Hình 4.5: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP1 .............................................................. 65 Hình 4.6: Tương tác COSY, HMBC và NOESY của hợp chất AP1 ............................ 65 Hình 4.7: Phổ (+) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP2 ................................................. 68 Hình 4.8: Phổ (–) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP2 ................................................. 68 Hình 4.9: Phổ 1H-NMR của hợp chất AP2 ................................................................... 68 Hình 4.10: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 ............................................................ 70 Hình 4.11: Tương tác COSY, HMBC và NOESY của hợp chất AP2 .......................... 70 Hình 4.12: Phổ (+) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP3 ............................................. 733 Hình 4.13: Phổ (–) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP3 ............................................. 733 Hình 4.14: Cấu trúc hóa học của chất AP3 ................................................................... 74 Hình 4.15: Tương tác COSY, HMBC và NOESY của hợp chất AP3 .......................... 74 Hình 4.16: Phổ 1H NMR của hợp chất AP4 ................................................................. 77 Hình 4.17: Phổ 13C NMR của hợp chất AP4 ................................................................ 77 Hình 4.18: Cấu trúc của hợp chất AP4 ......................................................................... 79 Hình 4.19: Tương tác COSY, HMBC của hợp chất AP4 ............................................. 79 Hình 4.20: Tương tác ROESY của hợp chất AP4 ........................................................ 79 Hình 4.21: Phổ (+) HR-ESI-MS/MS của hợp chất AP11 ........................................... 822 Hình 4.22: Phổ (-) HR-ESI-MS/MS của hợp chất AP11 ............................................ 822 Hình 4.23: Phổ 1H-NMR của hợp chất AP11 ............................................................. 822 Hình 4.24: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP11 ......................................................... 844 Hình 4.25: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP11 .......................................................... 85 Hình 4.26: Các tương tác chính trong phổ HMBC và ROESY của hợp chất AP11 .... 85 Hình 4.27: Phổ khối lượng (+) HR ESI-MS của hợp chất AP12 ................................. 88 Hình 4.28: Phổ khối lượng (-) HR ESI-MS/MS của hợp chất AP12 ........................... 88 Hình 4.29: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP12 .......................................................... 90 Hình 4.30: Phổ (-) HR ESI-MS/MS của chất AP13 ................................................... 933 Hình 4.31: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP13 .......................................................... 94 vi Hình 4.32: Phổ (-)-HR ESI-MS/MS của chất AP14 ..................................................... 97 Hình 4.33: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP14 .......................................................... 98 Hình 4.34: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP5 ........................................................ 1011 Hình 4.35: Cấu trúc hóa học của chất AP6 .................................................................. 103 Hình 4.36: Tương tác HMBC của chất AP6 ................................................................ 103 Hình 4.37: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP7 ........................................................... 105 Hình 4.38: Phổ 1H NMR của hợp chất AP8 ............................................................. 1066 Hình 4.39: Cấu trúc hóa học của hợp chất AP8 ........................................................... 108 Hình 4.40: Cấu trúc hóa học của chất AP9 .................................................................. 109 Hình 4.41: Cấu trúc hóa học của chất AP10 ................................................................ 109 Hình 4.42: Phổ 13C NMR của hợp chất 15c .............................................................. 1144 Hình 4.43: Phổ 13C NMR của hợp chất 16c .............................................................. 1144 Hình 4.44: Tương tác HMBC của hợp chất 18c ....................................................... 1166 Hình 4.45: Phổ tương tác HMBC của chất 19c ...................................................... 11717 Hình 4.46: Phổ 1H NMR giãn rộng của hợp chất 20c ............................................... 1188 Hình 4.47: Phổ 13C NMR giãn rộng của hợp chất 20c.............................................. 1188 Hình 4.48: Phổ 1H NMR giãn rộng của hợp chất 21c ............................................. 11919 Hình 4.49: Phổ 13C NMR giãn rộng của hợp chất 21c............................................ 11919 Hình 4.50: Phổ (+) ESI-MS của hợp chất 24c .......................................................... 1222 Hình 4.51: Phổ 13C NMR của hợp chất 26c .............................................................. 1233 Hình 4.52: Phổ 13C NMR của hợp chất 27c .............................................................. 1244 Hình 4.53: Phổ 13C NMR của hợp chất 28c .............................................................. 1255 Hình 4.54: Ảnh hưởng của hợp chất AP1 đến sự tăng sinh của các dòng tế bào HCT116, T-47D và RPMI-7951 .......................................................................................... 130 Hình 4.55: Ảnh hưởng của các asterosaponin AP11-AP14 đến sự di chuyển của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 ở người ...................................................... 133 vii DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1. Tổng hợp chất 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol (201) từ stigmasterol ....... 29 Sơ đồ 1.2. Tổng hợp chất 24-methylenecholest-4-en-3β,6α-diol (202) từstigmasterol .........29 Sơ đồ 1.3. Tổng hợp chất 24-methylene-cholesta-3β,5α,6β,19-tetraol (203) từ stigmasterol ................................................................................................................... 29 Sơ đồ 1.4. Tổng hợp (25R)-26-hydroxycholesterol (204) từ diosgenin ..................... 300 Sơ đồ 1.5. Các giai đoạn tổng hợp certonardosterol D2 (14) từ diosgenin ................. 300 Sơ đồ 1.6. Tổng hợp cholestan-3β,5α,6β-triol (205) từ cholesterol ........................... 311 Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất polyhydroxysteroid từ cholesterol ............... 113 Sơ đồ 4.2. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất hydroximinosteroid từ cholesterol ............... 121 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số đơn vị đường thường gặp trong các loài sao biển .............................. 8 Bảng 1.2: Kết quả thử nghiệm in vitro các chất phân lập từ sao biển C.semiregularis........ .15 Bảng 1.3: Hoạt tính gây độc tế bào T-47D và RPMI-7951 của các hợp chất 95-100 155 Bảng 1.4: Hoạt tính gây độc tế bào làm ức chế sự tinh của trứng cầu gai của các hợp chất asterosaponin từ sao biển Acanthaster planci ....................................................... 26 Bảng 1.5: Kết quả đánh giá hoạt tính chống ung thư của 4 cặn chiết sao biển A. planci.............................................................................................................................26 6 Bảng 1.6: Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất 206, 207, 209-220 ................... 333 Bảng 1.7: Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất 207, 208 và 221-234 .. 344 Bảng 1.8: Hoạt tính sinh học của 17 hợp chất hydroximinosteroid (206-208, 235248)................................................................................................................................35 5 Bảng 4.1: Dữ liệu phổ NMR phần aglycon của hợp chất AP1 ................................... 666 Bảng 4.2: Dữ liệu phổ NMR chuỗi đường của hợp chất AP1 ...................................... 67 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP2 ......................................................... 711 Bảng 4.4: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP3 ......................................................... 745 Bảng 4.5: Bảng so sánh dữ liệu chuỗi đường của AP3 với TLTK ............................. 766 Bảng 4.6: Dữ liệu NMR phần aglycon của hợp chất AP4 và TLTK .......................... 800 Bảng 4.7: Dữ liệu NMR chuỗi đường của hợp chất AP4 và TLTK ........................... 811 Bảng 4.8: Dữ liệu phổ phần aglycon của hợp chất AP11 ............................................. 86 Bảng 4.9: Dữ liệu phổ NMR của chuỗi đường của hợp chất AP11 ............................. 87 Bảng 4.10: Dữ liệu phổ phần aglycon của AP12 và pentareguloside G..................... 911 Bảng 4.11: Kết quả phổ NMR chuỗi đường của AP12 và pentareguloside G ........... 922 Bảng 4.12: Dữ liệu phổ NMR phần aglycon của AP13 và chất tham khảo ............... 955 Bảng 4.13: Dữ liệu phổ NMR chuỗi đường của AP13 và chất tham khảo................... 96 Bảng 4.14: Dữ liệu phổ NMR phần aglycon của AP14 và chất tham khảo ................. 99 Bảng 4.15: Dữ liệu phổ NMR chuỗi đường của AP14 và chất tham khảo................... 99 Bảng 4.16: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP5 và chất tham khảo ....................... 1022 Bảng 4.17: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP6 ..................................................... 1044 Bảng 4.18: Dữ liệu phổ của AP7 và chất tham khảo ................................................ 1055 Bảng 4.19: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP8 và chất tham khảo ..................... 10808 ix Bảng 4.20: Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP9 và AP10................. 1100 Bảng 4.21: Bảng tổng hợp các chất phân lập được từ sao biển Acanthaster planci . 1100 Bảng 4.22: Bảng tổng hợp các dẫn xuất tổng hợp được từ cholesterol.......................128 Bảng 4.23: Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của hợp chất AP1 .............................. 1300 Bảng 4.24: Hoạt tính gây độc tế bào và ảnh hưởng tới sự hình thành khối u trên thạch mềm của các hợp chất asterosaponin AP11-AP14 ................................................... 1311 Bảng 4.25: Hoạt tính gây độc tế bào Hep G2 và T98G của các hợp chất 15c-21c... 1344 Bảng 4.26: Hoạt tính gây độc tế bào Hep G2, HeLa, T98G của các chất 22c-31c... 1355 x DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu CC HPLC TLC SiO2 1 H-NMR 13 C-NMR COSY DEPT Tiếng Anh Các phương pháp sắc ký Column Chromatography High Performance Liquid Chromatography Thin Layer Chromatography Silica gel Các phương pháp phổ Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Correlated Spectroscopy Tiếng Việt Sắc ký cột thường Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký bản mỏng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carnon 13 Phổ tương tác proton GC-MS Distortionless Enhancement by Polarisation Phổ DEPT Transfer Electron Spray Ionization Mass Spectrometry Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Gas Chromatography-Mass Spectrometry Sắc ký khí ghép nối khối phổ HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation H2BC Heteronuclear Two Bond Correlation ESI-MS HR-ESI-MS HSQC IR NOESY TOCSY ROESY Phổ tương tác dị hạt nhân qua hai liên kết High Resolution – Electron Spray Ionization Phổ khối phân giải cao ion – Mass Spectrometry hóa phun mù điện tử Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Phổ NOESY Total Correlation Spectroscopy Phổ TOCSY Rotating frame Overhauser effect Phổ ROESY Spectroscopy J (Hz) δ (ppm) Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (ppm = part per million) Hằng số tương tác tính bằng Hz Độ dịch chuyển hóa học tính bằng phần triệu xi HeLa Các dòng tế bào Human cervical adenocarcinoma cell line Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma cell line HT-29 Human colorectal carcinoma cell line HCT-116 Human colon cancer cell line MDA-MB231 RPMI-7951 Human breast adenocarcinoma cell line Human malignant melanoma cell line T-47D Human breast cancer cell line T98G Glioblastoma cell line Dòng tế bào ung thư cổ tử cung ở người Dòng tế bào ung thư gan ở người Dòng tế bào ung thư đại trực tràng ở người Dòng tế bào ung thư ruột kết ở người Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú người Dòng tế bào u sắc tố ác tính ở người Dòng tế bào ung thư vú ở người Dòng tế bào ung thư não Các hóa chất BH3 Trihydridoborane CeCl3.7H2O Cerium (III) chloride heptahydrate CHCl3 Chloroform Cloroform CH2Cl2 (DCM) Dichloromethane Diclometan DMAP DMEM 4-Dimethylaminopyridine Dulbecco’s Modified Eagle Medium 4-dimethylaminopyridin Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM DMSO EtOH EtOAc HCOOH Dimethyl sulfoxide Ethanol Ethyl acetate Formic acid H2 O2 m-CPBA MeOH Hydrogen peroxide meta-Chloroperoxybenzoic acid Methanol NaBH4 Sodium borohydride NH2OH.HCl hydroxylamine hydrochloride NMO 4-Methylmorpholine N-oxide OsO4 Osmium tetroxide Cồn Etyl acetat Acid formic xii PCC Pyridinium chlorochromate THF TMS SeO2 Tetrahydrofuran Tetramethylsilane Selenium dioxide MIC Các ký hiệu viết tắt khác Effective dose 50% Inhibitory concentration 50% cell viability of cancer cells Inhibitory concentration 50% reduction in colonies formation of cancer cells Minimum inhibitory concentration Liều hiệu dụng 50% Nồng độ ức chế 50% khả năng sống của tế bào ung thư Nồng độ gây giảm 50% sự hình thành khối u Nồng độ ức chế tối thiểu M.p. Melting point Điểm chảy MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoli bromide MTS 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophen-yl)2H-tetrazolium ED50 IC50 IF50 [ ]D CTPT cs Độ quay cực riêng Công thức phân tử Cộng sự 1 MỞ ĐẦU Bề mặt trái đất có đến 70% diện tích là biển và các Đại dương, nơi chứa đựng nguồn tài nguyên sinh vật biển vô cùng đa dạng và phong phú với hàng trăm ngàn loài thực vật, động vật và vi sinh vật khác nhau. Với sự đa dạng này, nguồn lợi mang lại từ biển là vô cùng dồi dào và quý báu, cung cấp nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp chủ lực, như chế biến hải sản, hóa mỹ phẩm, dược phẩm và rất nhiều nhóm ngành khác...Tuy nhiên, trước đây, giá trị mang lại từ nguồn lợi biển chủ yếu cho các ngành chế biến thực phẩm, trong khi đó, các giá trị cung cấp về nguồn dược liệu ứng dụng cho y học và dược học vẫn còn rất hạn chế. Ngày nay, các giá trị về dược, y học của tài nguyên biển đang ngày càng được quan tâm nghiên cứu, và ưu tiên phát triển. Đã có nhiều hợp chất từ sinh vật biển được phân lập, xác định cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính sinh học. Trong đó, đã có các hợp chất thể hiện hoạt tính sinh học phong phú, có thể cung cấp hình mẫu cho các thế hệ thuốc mới. Đồng thời, khi tìm ra các hoạt chất từ sinh vật biển còn có đóng góp vô cùng quan trọng trong lĩnh vực tổng hợp và bán tổng hợp hữu cơ. Trên mô hình hoạt chất phân lập được có thể nghiên cứu tổng hợp ra lượng lớn các hoạt chất đi từ nguyên liệu đầu phổ biến hoặc chuyển hóa các dẫn xuất của chúng để có thể đánh giá chi tiết, và tối ưu hơn đối với một thế hệ thuốc có các cấu trúc tương tự nhau (analogous) [1-4]. Việt Nam có dải bờ biển trên 3.260 km, diện tích trên 1 triệu km2, với khí hậu nhiệt đới gió mùa là điều kiện lý tưởng cho hệ sinh thái biển đa dạng về chủng loại và giàu về trữ lượng. Cho đến nay, đã xác định được danh mục gần 12.000 loài sinh vật biển ở Việt Nam bao gồm cả động vật và thực vật [5]. Từ những năm 1970, đã có một vài công trình nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển. Những năm gần đây, với mục tiêu nghiên cứu và thăm dò nguồn dược liệu quý từ sinh vật biển, các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sinh vật biển đã được tiến hành nghiên cứu. Tuy nhiên, so với nguồn tiềm năng sinh vật biển ở nước ta thì đến nay những công trình nghiên cứu này vẫn chưa đánh giá một cách đầy đủ, và toàn diện về nguồn tài nguyên này, đặc biệt là các sinh vật thuộc ngành Da gai. 2 Ngành Da gai (Echinodermata), là một ngành động vật biển bao gồm năm lớp: Sao Biển (Asteroidea), Đuôi Rắn (Ophiuroidea), Cầu Gai (Echinoidea), Hải Sâm (Holothuria) và Huệ Biển (Crinoidea), là một trong những nguồn cung cấp dồi dào các steroid phân cực. Lớp chất này có cấu trúc rất đa dạng và có phổ sinh học rộng, chúng thể hiện nhiều hoạt tính như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống ung thư, chống virus... Steroid phân cực từ sao biển đã và đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về lớp chất này, tuy nhiên các nghiên cứu còn hạn chế ở việc phân lập và đánh giá hoạt tính các hợp chất. Chưa có công trình nghiên cứu tổng thể nào đi vào nghiên cứu phân lập, chuyển hóa hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của steroid phân lập từ sao biển. Với mục đích tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển thuộc ngành Da gai, và chuyển hóa thành các dẫn xuất polyhydroxysteroid và hydroxyminosteroid từ steroid phổ biến trong sinh vật biển nhằm đóng góp cơ sở nghiên cứu cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực phát triển dược phẩm, luận án này tập trung nghiên cứu phân lập, chuyển hóa hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của steroid từ một loài sao biển phổ biến ở vùng biển Việt Nam. Đối tượng được tập trung nghiên cứu là loài sao biển Acanthaster planci, một loài sao biển đe dọa đến sự tồn tại của các rạn san hô do chúng ăn các mầm san hô sống. Chính vì vậy luận án: “Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ loài sao biển Acanthaster planci” được thực hiện với những nội dung chính như sau:  Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài sao biển Acanthaster planci, đặc biệt là các steroid  Chuyển hóa các dẫn xuất theo định hướng hydroxyl hóa và oxime hóa từ 1 steroid có hàm lượng lớn trong sao biển Acanthaster planci.  Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và tổng hợp được. 3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về sao biển (Asteroidea) Sao biển là loài động vật không xương sống, thuộc ngành Da gai (Echinodermata), lớp Asteroidea. Sao biển phân bố rộng trên khắp các Đại dương, nhưng tập trung nhiều nhất ở khu vực Bắc Thái Bình Dương. Chúng sống ở đáy biển, thích nghi với những khu vực đáy có cát, bùn cát, đá nhỏ và các khu vực có rạn san hô. Cơ thể sao biển dẹp theo chiều lưng bụng và có đối xứng tỏa tròn bậc năm, gồm một đĩa trung tâm ở giữa và có 5 hay nhiều cánh (có thể lên tới 45 cánh) xếp xung quanh. Cánh sao biển ở mỗi loài có độ dài ngắn tương đối khác nhau. Lỗ miệng có màu sặc sỡ, khi bò trên bề mặt giá thì miệng hướng về phía dưới, hậu môn ở về phía đối diện. Bên trong quanh miệng là vòng ống nước, từ đó phát ra các ống nước nhánh hình nan quạt tỏa ra đến tận đỉnh của mỗi cánh. Bao bên ngoài mỗi ống nước nhánh có hai dãy chân ống. Sao biển không có đầu và việc di chuyển được thực hiện nhờ hoạt động nhịp nhàng của hai hàng chân ống nằm phía dưới mỗi cánh. Tốc độ di chuyển của sao biển rất chậm từ 5 đến 10 cm trong 1 phút, chúng nhạy cảm với ánh sáng và độ mặn nước biển [6]. Theo Blacke (1987), lớp Asteroidea được chia thành 7 bộ (order) bao gồm: Brisingida, Forcipulatida, Notomyotida, Paxillosida, Spinulosida, Valvatida và Velatida. Đến nay người ta đã thống kê có khoảng 1900 loài sao biển, được nhóm vào 370 chi phân bố ở tất cả các Đại dương trên thế giới [7]. Những nơi có nhiều sao biển phải kể đến các vùng biển Australia, Đông Thái Bình Dương và Bắc Mỹ, đặc biệt vùng biển nhiệt đới Ấn Độ - Thái Bình Dương là nơi tập trung đại đa số các loài sao biển [6, 8]. Ở Việt Nam có khoảng 78 loài sao biển khác nhau, phân bố dọc bờ biển từ Bắc đến Nam. Loài sao biển Acanthaster planci thuộc chi Acanthaster, họ Acanthasteridae trong bộ Valvatida. Theo Mah và Hansson (2013), bộ này có 17 họ (Acanthasteridae, Archasteridae, Asterinidae, Asterodiscididae, Asteropseidae, Chaetasteridae, Ganeriidae, Goniasteridae, Leilasteridae, Mithrodiidae, Odontasteridae, Ophidiasteridae, Oreasteridae, Podosphaerasteridae, Poraniidae, Solasteridae, Sphaerasteridae), 165 chi với khoảng 695 loài. Theo Đăng ký thế giới về các loài sinh vật biển (World Register of Marine Species), chi Acanthaster chỉ có 2 loài là Acanthaster planci (Linnaeus, 1758) và Acanthaster brevispinus (Fisher, 1917). Cho đến nay, theo thống kê của tác giả Guang Dong và cs [9] trong giai đoạn từ năm 1977-2007 đã có khoảng 98 loài sao biển được nghiên cứu về thành phần hóa học. Các hợp chất phân lập được từ các loài sao biển chủ yếu là các hợp chất thuộc lớp chất 4 steroid và các hợp chất ceramide. Ngoài ra, sao biển còn chứa một số lớp chất khác như: carotenoid, nucleoside, alkaloid, acid béo, peptide... Trong đó, các hợp chất steroid là các hợp chất chuyển hóa thứ cấp chính của sao biển. Hiện nay, đã có hơn 800 hợp chất steroid phân cực được phân lập từ các loài sao biển khác nhau, và sự đa dạng về cấu trúc của các hợp chất này dường như là vô tận [10]. Trong số các loài sao biển được nghiên cứu, có một số loài được quan tâm nghiên cứu khá chi tiết như các loài Asterina pectinifera, Culcita novaeguineae, Certonardoa semiregularis và Linckia laevigata. 1.2. Các nghiên cứu về lớp chất steroid phân cực từ các loài sao biển Lớp chất steroid từ sao biển, đặc biệt là các steroid phân cực, thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới bởi các hoạt tính thú vị của chúng như: hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư, chống virus, kháng viêm, giảm đau, tán huyết… Dựa vào cấu trúc hóa học của các steroid đã phân lập được từ tự nhiên có thể chia chúng thành các nhóm chất chính như sau: polyhydroxysteroid, steroid sulfate, steroid glycoside [11]. 1.2.1. Polyhydroxysteroid Các polydydroxysteroid từ sao biển là các hợp chất có chứa từ 4 đến 9 nhóm hydroxyl (-OH) trong phần nhân tetracyclic steroid của chúng và cả trong phần mạch nhánh liên kết với nhân steroid ở vị trí C-17. Điều đặc biệt, các nhóm –OH này thường chỉ được tìm thấy ở một số vị trí xác định. Chúng thường có mặt ở các vị trí như 3β, 6(α hoặc β), 8β, 15(α hoặc β) và 16β trong nhân steroid. Đôi khi các nhóm –OH cũng được tìm thấy ở các vị trí 4β, 5α, 7(α hoặc β), và hiếm khi được tìm thấy ở vị trí 14α. Phần mạch nhánh của các hợp chất này khá đa dạng, tuy nhiên trong phần lớn các hợp chất polyhydroxysteroid có phần mạch nhánh như của cholestane với các nhóm –OH thường được tìm thấy ở các vị trí C-24 và C-26 (C-28 hoặc C-29 trong loại mạch nhánh giống của ergostane hoặc stigmastane) [11]. Các penta- và hexaol thường chiếm ưu thế hơn trong các polyhydroxysteroid. Điển hình cho nhóm chất này, từ loài sao biển Certonardoa semiregularis thu thập được gần đảo Komun, Hàn Quốc, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phân lập được 36 hợp chất polyhydroxysteroid (1-36) với sự đa dạng về cấu trúc mạch nhánh và vị trí các nhóm hydroxyl [12-17].