Tài liệu Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng lên men của hai chủng nấm men saccharomyces sp1 và saccharomyces sp2 dùng trong sản xuất rượu truyền thống ở tỉnh bình định

1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Từ trước đến nay, rượu đã gắn liền với nền văn hóa ẩm thực không chỉ của người dân Việt Nam. Nếu như xứ Scotland tự hào về dòng Wishky, người Pháp có Cognac, Nga có Vodka, Hàn Quốc có rượu Sochou thì Việt Nam chúng ta tự hào có rượu đế với nhiều làng nghề nổi tiếng khắp cả nước như Rượu Mẫu Sơn (Lạng Sơn), Rượu làng Vân (Bắc Giang), Rượu Gò Đen (Long An),... Đặc biệt không thể không kể đến “đệ nhị tửu” - Bàu Đá và Rượu Vĩnh Cửu (Bình Định), những thương hiệu nổi tiếng khắp cả nước. Tuy nhiên, trong thời gian gần đây, các vụ ngộ độc thực phẩm do rượu xảy ra ngày một nhiều, gây tâm lý hoang mang, đe dọa đến tính mạng và sức khỏe của người dùng rượu. Bên cạnh tình trạng rượu giả thì rượu kém chất lượng cũng là một nguyên nhân chính. Vì ở nước ta, sản xuất ra rượu theo nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp lên men rượu truyền thống bằng bánh men hiện vẫn được sử dụng nhiều nhất. Tuy nhiên thực tế hiện nay, quy trình sản xuất rượu đế lên men ở các hộ gia đình hoàn toàn mang tính thủ công với quy mô nhỏ lẻ. Người dân mua men rượu ở chợ về nấu rượu và quá trình chưng cất với thiết bị thô sơ, chủ yếu phụ thuộc vào kinh nghiệm dân gian nên năng suất không cao, chất lượng rượu không ổn định. Rượu làm ra chưa được kiểm định về các tạp chất có hại cho sức khoẻ, phần lớn sản phẩm vẫn chưa đạt tiêu chuẩn nhà nước (TCVN 7043 - 2013), đặc biệt là các chỉ tiêu chất lượng về hóa lý, vi sinh và an toàn thực phẩm. Do đó, để tạo ra sản phẩm rượu có chất lượng tốt, cần kiểm soát chặt chẽ các yếu tố: nguồn men, nguồn nguyên liệu và phương pháp chưng cất. Một trong những yếu tố quyết định chất lượng rượu đó chính là men rượu. Vì vậy, muốn tạo ra được sản phẩm rượu có chất lượng cần có nguồn men chất lượng, thành phần rõ ràng, bao gồm những chủng vi sinh vật thuần, có hoạt tính lên 2 men cao, cho chất lượng sản phẩm rượu tốt, an toàn với người sử dụng. Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn trên, tôi chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng lên men của hai chủng nấm men Saccharomyces sp1 và Saccharomyces sp2 dùng trong sản xuất rượu truyền thống ở tỉnh Bình Định”. 2. Mục đích nghiên cứu Xác định đặc điểm sinh học và khả năng lên men của hai chủng nấm men Saccharomyces sp1 và Saccharomyces sp2. Sản xuất thử nghiệm men rượu thuần và ứng dụng vào lên men rượu tại làng nghề nấu rượu truyền thống của Bình Định. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu Hai chủng nấm men Saccharomyces sp1 và Saccharomyces sp2 do Trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ tỉnh Bình Định cung cấp. 3.2. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của hai chủng nấm men Saccharomyces sp1 và Saccharomyces sp. - Khảo sát khả năng lên men của hai chủng nấm men Saccharomyces sp1 và Saccharomyces sp2 nhằm chọn ra chủng nấm men tối ưu có khả năng lên men rượu tốt nhất trong sản xuất rượu truyền thống ở Bình Định. 4. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp vi sinh, phương pháp hóa sinh, phương pháp cảm quan, phương pháp hóa lí và phương pháp toán học. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5.1. Ý nghĩa khoa học Xác định được cơ sở khoa học để tạo ra một loại men rượu tốt trong điều kiện lên men rượu truyền thống ở Bình Định. 3 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Nâng cao hiệu quả lên men và chất lượng rượu thu được tại làng nghề nấu rượu truyền thống ở Bình Định. 6. Cấu trúc luận văn Luận văn gồm các phần sau: Mở đầu Chương 1. Tổng quan tài liệu Chương 2. Nội dung - Phương tiện - Phương pháp nghiên cứu Chương 3. Kết quả nghiên cứu và bàn luận Kết luận Kiến nghị Tài liệu tham khảo Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về rượu 1.1.1. Những nghiên cứu trong và ngoài nước về rượu Rượu đã trở thành một trong những nét đẹp của nền văn hóa Việt nói riêng và thế giới nói chung, vì vậy mà từ xa xưa dân gian ta đã có câu “Vô tửu bất thành lễ”. Từ thời cổ đại đến nay, rượu đóng một vai trò quan trọng trong tôn giáo và thờ cúng. Nguyên thủy, rượu là một thức uống bổ dưỡng của con người và đã được sử dụng rộng rãi trong một số lĩnh vực khác như: chữa bệnh, sát trùng và giảm đau. Loại thức uống giải khát này giữ vai trò tất yếu, góp phần làm tăng sự hưng phấn và chất lượng cuộc sống con người. Rượu có thể giúp mang lại sự thư giãn, sự dễ chịu mang tính dược liệu và làm tăng sự ngon miệng. Do vậy, tuy rượu thường bị sử dụng một cách không đúng bởi một nhóm ít người uống, nhưng nó vẫn được minh chứng là thức uống có lợi đối với đại đa số con người nếu sử dụng hợp lí [19]. Thời cổ đại, tuy không ai biết rõ khi nào rượu bắt đầu được sử dụng, nhưng chắc chắn một điều rằng rượu đã xuất hiện cách đây rất lâu ít nhất là mười nghìn năm trước đây. Sự phát hiện ra bình uống bia thời kỳ Đồ Đá đã nói lên rằng thức uống lên men đã có từ lâu đời, ít nhất từ thời kỳ Đồ Đá Mới (tức là 10000 năm trước Công Nguyên) (Patrick, 1952); rượu rõ ràng xuất hiện như một sản phẩm hoàn thiện trong các văn kiện cổ Ai Cập khoảng 4000 năm trước Công Nguyên (Lucia, 1936) [19]. Khi các nền văn minh càng trở nên thịnh vượng thì việc sản xuất và tiêu thụ rượu càng phát triển. Đồng thời, cũng có những đoạn trong văn tự cổ của người Ai Cập đã đề cập đến những ảnh hưởng xã hội của nạn say rượu, trong một văn tự có niên đại 1600 năm trước công nguyên còn ghi lại gần 100 bài thuốc liên quan đến sử dụng rượu [24]. Rượu mạnh được chưng cất có nguồn gốc từ Trung Quốc và Ấn Độ khoảng 800 năm trước công nguyên. Phải đến thế kỉ thứ VII, công nghệ chưng cất rượu mới du nhập đến châu Âu. Rượu thời trung cổ tại châu Âu rất giàu protein, cacbon hydrate và được coi là một nguồn dinh dưỡng trong xã hội đương thời [24]. Đến thời phục hưng, với sự phát triển đa dạng, chưng cất rượu đã được coi như là một nghệ thuật. Không những thế, thời kì này, nhiệt kế đã được phát minh cùng với những dụng cụ khác dùng trong sản xuất rượu đã làm cho quá trình sản xuất rượu càng thêm khoa học và hiệu quả hơn. Cũng bắt đầu từ đó, sản xuất rượu trở thành một ngành công nghiệp thực thụ, đa dạng trong sản phẩm và tiến bộ về công nghệ. Rượu có rất nhiều loại mùi vị, tính chất khác nhau. Tuy nhiên tất cả các thứ rượu đều có một thành phần chung, đó là cồn (alcohol). Theo công nghệ sản xuất, rượu được phân loại như sau: - Rượu chưng cất: Loại rượu này dùng những nguyên liệu chứa đường và tinh bột nhưng sau khi lên men được cất lại. Rượu chưng cất là những loại rượu nặng như: Brandy, Whisky, Rhum và Vodka. - Rượu lên men thuần túy: Rượu được lên men từ các nguyên liệu có chứa đường, tinh bột và đều có nồng độ thấp. Những điển hình của loại rượu này là rượu vang, saké, rượu nếp,... - Rượu pha chế: Đây là thứ rượu lên men hoặc rượu chưng cất có pha thêm đường, hương liệu, dược liệu,.. mà thành. Trong nhóm này có các thứ rượu bổ, rượu sâm, liqueur, cocktail [24]. Đối với người Việt Nam, cũng chẳng ai biết được rượu xuất hiện từ lúc nào. Trước khi người Pháp đến Việt Nam trong cuộc xâm lăng và đô hộ, ngành sản xuất rượu thủ công ở Việt Nam đã có lịch sử rất lâu đời. Ở Việt Nam, rượu không chỉ đơn giản như là một thứ thực phẩm mà nó đã trở thành một giá trị văn hóa không thể thiếu được. Vì người Việt sử dụng rượu rất phổ biến trong các ngày lễ, tết,... Năm 1858, khi những người Pháp đầu tiên đặt chân đến Việt Nam, vẫn chưa có sản xuất rượu ở quy mô công nghiệp. Chính phủ bảo hộ khuyến khích người Việt Nam nấu rượu, uống rượu để thu thuế, cấp đăng ký sản xuất rượu. Tuy nhiên, kể từ khi sản xuất rượu công nghiệp ra đời, chính quyền bảo hộ ra sắc lệnh cấm dân tự nấu rượu, ngừng cấp giấy phép kinh doanh bằng nghề nấu rượu, chỉ duy trì một số làng nghề tập trung để dễ thu thuế. Việc cấm dân nấu rượu ngày càng được kiểm soát chặt chẽ đi đôi với đẩy mạnh sản xuất rượu công nghiệp. Rượu được sản xuất công nghiệp, được Chính phủ bảo hộ phân phối, thanh tra và thu thuế được gọi là rượu Ty. Loại rượu này được nấu bằng nguồn nguyên liệu là gạo và ngô, có vị rất nhạt và độ cồn thấp [7]. Người dân muốn dùng thứ rượu dân tộc có nồng độ cao, cay và thơm hơn, khắp nơi người ta vẫn lén lút nấu rượu bằng gạo nếp rồi đem giấu trong những lùm tranh, lùm đế ở xa nhà, hoặc khi thấy Tây đoan, Tàu cáo đến bắt. Tên gọi rượu đế trong Nam xuất xứ từ đó. Loại rượu này cũng còn được gọi là rượu lậu do quy trình nấu rượu và tiêu thụ rượu hầu hết đều là lậu. Cũng vì “rượu ta nấu nó cho rượu lậu, muối ta làm nó bảo muối gian” (Phan Bội Châu, trong bài thơ Á tế Á ca), nên tại miền Bắc Việt Nam người dân đã tự đặt tên cho loại rượu mình nấu là rượu ngang vì rượu nấu và tiêu thụ theo kiểu đi ngang về tắt; rượu cuốc lủi vì vừa bán vừa lủi như con chim cuốc hoặc để so sánh với rượu "quốc gia" khi các cụ nhà nho xưa nhại tiếng ngoại bang gọi rượu quê của người Việt là rượu quốc hồn quốc túy. Tiếng là quốc hồn quốc túy mà phải nấu chui nấu lủi, uống chui uống lủi thì gọi là rượu quốc lủi [19]. Khắp trên đất nước Việt Nam đều có rượu ngon. Nhiều loại rượu gắn với tên địa phương nếu cả vùng nấu rượu và có chất lượng tương đối đồng đều, có thể kể ra một loạt tên rượu địa phương như Làng Vọc, Kim Sơn, Làng Vân, Mẫu Sơn, Thổ Hà, Tạnh Xá, Nga Sơn, Kim Long, Làng Chuồn, Đá Bạc, Bồng Sơn, Bàu Đá, Gò Đen, Phú Lễ, Xuân Thạnh, Tân Lộc, Văn Điển, Bó Nặm, Trương Xá, Phú Lộc, Đại Lâm... và danh sách có thể kéo dài đến vô tận. Tuy nhiên, một số nơi khác thì tên gọi rượu ngon hẹp hơn, gắn với tên người nấu rượu, lò rượu hoặc là sản phẩm của một nghệ nhân nhất định. Ngay cả tại những địa phương rượu nổi danh vẫn có những nghệ nhân mà sản phẩm rượu của họ có chất lượng hơn hẳn người khác trong vùng [15]. Các loại rượu Làng Vân (Bắc Giang), Kim Long (Quảng Trị), Bàu Đá (Bình Định) và Gò Đen (Long An) đại diện xuất sắc của rượu ngon ba miền. Theo những người đi tận nơi để nếm rượu thì rượu Làng Vân đằm, sâu. Rượu Kim Long êm và mềm mại, rượu Bàu Đá mạnh, rộng. Rượu Gò Đen đậm đà, phóng khoáng. Tuy nhiên, việc hướng tới có một "quốc tửu" chung cho mọi vùng miền của đất nước vẫn là câu hỏi chưa có lời giải đáp [15]. Ở Bình Định, hiện nay ngoài làng nghề truyền thống rượu Bàu Đá (An Nhơn), Mỹ Thọ (Phù Mỹ) và Vĩnh Cửu (Vĩnh Thạnh) ra thì rượu vẫn được sản xuất từ các hộ nhỏ lẻ hoặc một số cơ sở sản xuất tư nhân khác. Ở mỗi cơ sở sản xuất, người ta đều lựa chọn một loại men phù hợp với quy trình sản xuất, nguyên liệu và cũng như theo điều kiện của cơ sở [26]. Hình 1.1. Chưng cất rượu truyền thống tại làng nghề nấu rượu Vĩnh Cửu, xã Vĩnh Hiệp, huyện Vĩnh Thạnh, tỉnh Bình Định 1.1.2. Sản xuất rượu thủ công truyền thống 1.1.2.1. Nguyên liệu Nguồn nguyên liệu để sản xuất rượu chủ yếu là gạo tẻ, gạo nếp, ngô, khoai, sắn, khoai tây, rỉ đường mía. Trong đó, gạo tẻ, gạo nếp, tấm, ngô đều là những nguồn nguyên liệu tinh bột rất tốt để sản xuất rượu. Riêng với ngô, trước khi nấu rượu cần tách phôi để chế dầu cám và vitamin E, nếu còn phôi sẽ làm rượu có mùi vị khó chịu của chất béo trong phôi. Thành phần hóa học của một số nguyên liệu tinh bột (%) như sau: [22] Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số nguyên liệu tinh bột ở Việt Nam dùng trong sản xuất rượu Thành phần Sắn khô Gạo tẻ Tấm Ngô Vàng Đỏ Nước 14,0 11,0 11,5 12,5 13,3 Gluxit lên men 67,6 69,2 41,1 68,4 72,6 Protit 1,75 7,3 5,3 8,3 7,2 Chất tro 179 0,9 17,7 1,6 1,1 Chất béo 0,87 1,2 2,0 5,1 4,1 Lên men rượu từ các loại nguyên liệu chứa tinh bột về nguyên lí không khác với nguồn nguyên liệu khác, nhưng nguyên liệu phải qua đường hóa để biến tinh bột thành đường. Các loại men rượu không có enzym đường hóa được tinh bột, vì vậy nhất thiết phải qua khâu đường hóa. Hiện nay có nhiều phương pháp đường hóa khác nhau và do đó sản xuất rượu từ các nguồn nguyên liệu tinh bột được mang tên các phương pháp đường hóa tương ứng (đường hóa bằng axit, phương pháp lên men thuốc bắc, phương pháp maltaza, phương pháp myco-malt). Nguyên liệu chứa tinh bột cần phải được nấu chín để các màng tế bào tinh bột bị phá vỡ, tinh bột chuyển thành dạng dễ tan. Có như vậy, hệ enzym amylase mới tác dụng phân giải tinh bột được dễ dàng. Nguyên liệu thường được nấu chín ở 1300C-1400C, sau đó mới đường hóa. Trong các nguyên liệu kể trên, gạo nếp (nếp cái hoa vàng, nàng hương, nếp cẩm,...) cho ra loại rượu ngon nhất. Tinh bột các loại gạo nếp có tỉ lệ amylose và amylopectin khác với gạo tẻ và ngô nên dễ đường hóa hơn. Đặc biệt là các loại gạo nếp, kể cả nếp hương, có mùi thơm dễ chịu. Mùi thơm này được nhận thấy ở rượu thành phẩm. ì.1.2.2. Men rượu - Cách làm bánh men Bánh men là một loại men rượu được sản xuất thủ công tại Việt Nam. Mỗi địa phương và mỗi dân tộc có một phương pháp sản xuất riêng. * Cách làm bánh men: - Gạo tẻ đem dùng là loại gạo xay hoặc xát chưa kỹ (gạo lức), ngâm nước khoảng 1-2 giờ. Lấy gạo ra, để ráo nước đem nghiền hoặc giã nhỏ rồi trộn với men giống theo tỷ lệ 5:2. Sau đó nặn thành bánh tròn đường kính 3 - 5 cm. Bột gạo khi nặn bánh men có độ ẩm sao cho khi định hình nấm men không bị chảy nước hoặc không bị tơi bột và khi thành bánh được xoắn phần trên đỉnh thành dạng củ hành được là vừa đủ. Khi làm bánh men nên dùng gạo xay có nhiều cám, chứa nhiều vitamin và khoáng chất. Những chất này rất cần cho sự sinh trưởng của nấm men và nấm sợi. Bột gạo nhào trộn với bột men giống cần có độ ẩm khoảng 50 - 55%. Nếu ẩm quá sự thoáng khí trong bánh men kém, nấm men và nấm sợi phát triển kém, vi khuẩn kị khí phát triển mạnh, trước hết là vi khuẩn lactic. Trường hợp không đủ độ ẩm các hạt bột rời rạt, không định hình được bánh men [26]. - Đặt bánh men lên một lớp trấu mới (đã rửa sạch, phơi khô kỹ) trải trên nong, hoặc có thể trên nền nhà sạch. Đậy các bánh men bằng nong hoặc phủ trên mặt các bánh men bằng rơm sạch. Để như vậy khoảng 2 - 3 ngày khi thấy bánh men phồng nở đều và xung quanh thấy các bào tử mốc có các chấm đen, vàng nhạt thì đem bánh men ra phơi chỗ thoáng, có thể dưới ánh mặt trời. Nhiệt độ khi ủ bánh men và phơi khô không nên để nóng quá (khoảng 30 - 350C là tốt). Gói các bánh men đã tương đối khô vào gác bếp để hàng ngày được xông khói làm khô thêm. Sau khoảng 1 tháng thì đem dùng dần cho sản xuất rượu [26]. Cách làm bánh men như trên ta nhận được bánh men bình thường, dễ bị nhiễm các khuẩn lạ không mong muốn làm ảnh hưởng xấu đến hiệu suất và chất lượng sản phẩm rượu sau này, đặc biệt là mùi vị kém. Vì vậy, trong dân gian thường làm bánh men có trộn thêm thuốc bắc hoặc các lá cây, thu được các loại men thuốc bắc và men lá. Các loại men này đã được dùng lâu đời và tạo ra các loại rượu truyền thống nổi tiếng [22]. 1.1.2.3. Khái quát quá trình lên men rượu Từ cổ xưa khái niệm lên men được xem là “sự sủi bọt”. Theo định nghĩa của Pasteur lên men thực chất là quá trình kỵ khí xảy ra đối với hoạt động của vi sinh vật để thu năng lượng, trong đó hydro được tách ra và chuyển đến cho chất nhận là hợp chất hữu cơ được tạo thành trong chuỗi biến đổi hóa sinh. Khái niệm lên men ở đây không đồng nghĩa với sự lên men (fermentation) được dùng rộng rãi hiện nay với nội dung là các quá trình sản xuất nhờ vi sinh vật hay là cơ sở của công nghiệp vi sinh vật. Như vậy, các sản phẩm lên men ở đây được hiểu là các sản phẩm lên men cổ điển hay là các sản phẩm của các quá trình kỵ khí. * Cơ chế của quá trình lên men rượu Phương trình tổng quát của quá trình lên men rượu: (C6Hio05)n + Ĩ1H2O ------> n CóHnOe------► C2H5OH + 2n CO2 + 113,4kJ Quá trình lên men rượu rất phức tạp, nó phải trải qua rất nhiều phản ứng khác nhau với sự tham gia của nhiều hệ enzyme xúc tác, kết quả cho ra rượu etylic ( hay ethanol), CO2 và một số sản phẩm khác. Sơ đồ sau cho ta thấy quá trình chuyển hóa các hợp chất qua 13 giai đoạn trong lên men rượu từ glucose: [1] Glucoza Glucose-6-phosphat + ADP - ~p Glucose phospha!izomeraza ---------—■------------------------ - T Fructozo-1,6-phosphat ^Phosphofructokinaza ị ATP Fructozo-1,6-phosphat + ADP - ~p Glyxerin A 3-phospho glyxerin aldehyt 1,3-Phospho glyxerin aldehyt ' I Triozo phospha! dehydrogenaza Axit 3-diphosphoglyxerirriic ị^Phosphoglyxeronmutaza Aldo I aza Axit 2-diphosphoglyxerimic _ Enolaza__________ Mgĩ+. Mn2\ Zr?+ Axit phosphoenol pyruvic ADP ATP Phosphotransferaza Sơ đồ 1.1. Quá trình lên men rượu * Các quá trình của vi sinh vật trong lên men rượu Thực chất của quá trình này là sự sinh trưởng và sinh sản của vi sinh vật, nó xảy ra rất nhanh ở giai đoạn đầu lên men. Sự phát triển mạnh của các vi khuẩn ở giai đoạn này kéo dài tạo thành một số acid hữu cơ làm pH môi trường giảm tạo điều kiện cho nấm mốc và nấm men phát triển. Việc phân chia các giai đoạn phát triển của vi khuẩn, nấm mốc, nấm men trong dịch lên men một cách rõ ràng là điều kiện rất khó khăn vì nó diễn ra đồng thời tuy rằng không cùng mức độ. Vi khuẩn, nấm mốc đòi hỏi trong môi trường phải có một lượng oxy nhất định, vì vậy mà chúng phát triển mạnh ở giai đoạn đầu. Nấm men cũng cần oxy để tăng sinh khối, tuy nhiên mức độ đó không cao như nấm mốc. Mặt khác, nấm men còn cần đường nên phải có đủ thời gian để nấm mốc tạo ra đường. Do đó, ở các giai đoạn sau nấm men phát triển mạnh hơn nấm mốc và vi khuẩn. * Các quá trình sinh lý, sinh hóa - Quá trình hồ hóa tinh bột: Tinh bột sống không hòa tan trong nước, do vậy qua giai đoạn dịch hóa và đường hóa enzyme amylase tác dụng rất chậm. Khi nấu tinh bột, lực liên kết giữa các phân tử yếu dần và đứt ra gọi là sự hồ hóa tinh bột. Ở trạng thái này chỉ có một phần nhỏ tinh bột bị phá vỡ vì cấu tạo của tinh bột dạng mạng lưới rất bền vững, các mạch thẳng liên kết với nhau bằng lực Vanderval và liên kết hydro. - Quá trình dịch hóa tinh bột: Trong giai đoạn đầu, vi khuẩn làm chua môi trường tạo điều kiện thích hợp để enzyme a-amylase hoạt động, nó phân cắt amylose và amylopectin của tinh bột thành các dextrin khác nhau, bắt đầu là amylodextrin, sau là erytrodextrin và cuối cùng là acrodextrin, maltodextrin. Do vậy, trong giai đoạn này tinh bột sẽ bị loãng tức thì. - Quá trình đường hóa: Sự phát triển của nấm mốc tạo ra nhiều enzyme amylase, glucoamylase chuyển hóa tinh bột thành đường. Các enzyme này hoạt động rất thuận lợi trong giai đoạn đầu và được kéo dài trong suốt các giai đoạn sau, nó chịu sự điều khiển bởi nồng độ glucose trong dịch lên men. Bình thường glucose sẽ ức chế phản ứng thủy phân tinh bột, nhưng các loài nấm mốc Mucor Rouxei, Rhizopus delemar vừa có khả năng tổng hợp enzyme amylase, glucoamylase vừa có khả năng chuyển hóa đường thành rượu. Kết quả là lượng đường được tạo thành ngay lập tức được rượu hóa, còn một phần sẽ được sử dụng cho quá trình sinh sản và phát triển của chúng. Vì vậy trong dịch lên men thường không xảy ra cơ chế kìm hãm ngược bởi glucose [26]. * Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đường hóa: - Nồng độ enzyme: Trong điều kiện chủng loại enzyme, nồng độ cơ chất, thời gian thủy phân, nhiệt độ, pH môi trường không thay đổi thì khi tăng nồng độ enzyme, tốc độ đường hóa sẽ tăng lên. - Nhiệt độ: Tốc độ phản ứng của các enzyme cũng như phần lớn các phản ứng hóa học đều tăng khi nhiệt độ tăng. Nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ đường hóa, hiệu suất đường hóa và sản phẩm đường hóa. Khi đường hóa ở nhiệt độ cao dextrin tạo ra nhiều hơn so với đường khử. Nhưng trong nấm men không có hoặc rất ít amylase và glucoamylase nên không thể tiếp tục thủy phân dextrin thành đường. Do vậy giảm hiệu suất thu hồi. Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu từ tinh bột chỉ đạt 20 - 30%. - Nồng độ pH: pH tối thích của enzyme amylase trong khoảng 4,5 - 5,5. - Nồng độ rượu: Quá trình đường hóa xảy ra trong thời gian ngắn, tinh bột không bị thủy phân hoàn toàn mà còn tiếp tục cho đến khi kết thúc quá trình lên men. Trong quá trình này nồng độ rượu tăng dần có tác dụng kìm hãm nhất định đến phức hệ enzyme amylase. - Thời gian đường hóa: Thời gian đường hóa có ý nghĩa thực tiễn trong sản xuất, quyết định chất lượng của dịch đường hóa và hiệu suất thu hồi, nó cũng ảnh hưởng đến sự hòa tan tinh bột không đường hóa. Khi đường hóa cơm ở 55 - 580C trong 15 - 150 phút hầu như đường lên men không tăng, nhưng nồng độ chất tan tăng do sự hòa tan tinh bột không đường hóa. * Quá trình lên men rượu Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men. Nấm men chuyển hóa đường thành rượu ethylic và CO 2. Người ta còn gọi đây là quá trình rượu hóa hoặc cồn hóa. Quá trình lên men rượu được chia thành 2 giai đoạn chính: - Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự hiện diện của O 2, tế bào nấm men sẽ phát triển sinh khối để gia tăng kích thước và khối lượng. - Thời kì lên men chuyển hóa đường thành rượu và CO 2: Nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng enzyme sẵn có để xúc tác các phản ứng sinh hóa trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2 [1]. Diễn ra đồng thời là các quá trình chuyển hóa đường, các acid hữu cơ thành các sản phẩm phụ khác. Tuy nhiên, các quá trình chuyển hóa này xảy ra xen kẽ nhau, hỗ trợ nhau nên sản phẩm tạo ra không chỉ có nước và cồn mà là một hỗn hợp hài hòa về hương vị, gồm nhiều thành phần khác nhau. Để lên men người ta thường cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định, thông thường lượng tế bào nấm men phải lớn hơn 1 triệu tế bào trong 1ml dịch lên men. Do diện tích bề mặt tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh. Đường và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men được hấp thụ ở bề mặt và sau đó khuếch tán qua màng tế bào vào bên trong tế bào nấm men. Ethanol tạo thành khuếch tán rất nhanh ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men. CO2 cũng hòa tan vào môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái bão hòa, khi đó CO2 sẽ bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền với nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến khi có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Tại đây, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị phá vỡ, khí CO2 được phóng thích ra bên ngoài. Lúc này do khối lượng riêng lớn hơn nên nấm men lại bị chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục, tế bào nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái động sẽ làm tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men với môi trường, giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh hơn, làm tăng nhanh quá trình lên men [1]. Khí CO2 thường ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men. Kích thước, chất liệu của thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện tích, các vật lơ lửng khác trong dịch lên men đều ảnh hưởng đến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng quá trình lên men. * Động học của quá trình lên men Quá trình lên men chia làm 3 thời kỳ chính: - Thời kỳ đầu: khoảng 60 giờ kể từ khi cho nấm men tiếp xúc với dịch lên men. Sự lên men xảy ra rất chậm, đường lên men không đáng kể. - Thời kỳ 2: đây là thời kỳ lên men chính. Chiếm khoảng 60 - 120 giờ sau thời kỳ đầu. Sự phát triển của nấm men sau mỗi giờ tăng nhanh đáng kể và đạt đến trị số cực đại. Thời kỳ lên men chính là thời kì biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men, ảnh hưởng đến kết quả quá trình lên men. - Thời kỳ 3: là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời ổn định tạo mùi cho sản phẩm. Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm mà thời gian lên men phụ kéo dài khác nhau. * Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men [19] - Nồng độ đường: Nấm men chỉ lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ thích hợp từ 10 - 18%, nồng độ đường 30 - 35% sẽ ức chế nấm men và khả năng lên men, nồng độ đường thấp cũng làm giảm khả năng lên men. - Nhiệt độ: Nấm men phát triển tốt nhất ở khoảng 28 - 30 0C, nếu quá 500C nấm men sẽ chết. - Nồng độ pH: Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH từ 2 - 8 nhưng thích hợp nhất là từ 4 - 4,5. - Nồng độ rượu: Cùng một môi trường nuôi cấy, số lượng nấm men, điều kiện nuôi cấy thì nồng độ rượu ban đầu 1% chưa ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4 - 6% sẽ ảnh hưởng xấu. - Ảnh hưởng của oxy: Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. Trong điều kiện không có oxy nấm men sẽ lên men đường tạo thành rượu và CO2, còn trong điều kiện đầy đủ oxy nấm men tăng sinh khối. 1.1.3. Hệ vi sinh vật có trong quá trình lên men rượu 1.1.3.1. Nhóm Nấm sợi Nhóm nấm sợi gồm có Aspergillus oryzae, A. awamorii, A. usami, A. niger (giống Aspergillus chiếm phần lớn); Mucor (M circiniloides); Rhizopus; Penicillium và Amylomyces rouxii;... Hệ nấm sợi sinh enzyme amylase phân giải tinh bột. Các giống nấm sợi Aspergillus, Mucor, Rhizopus có vai trò sinh ra enzyme amylase phân giải tinh bột. Amylase là một nhóm enzyme gồm 3 enzyme: aamylase, 0-amylase và Y- amylase. Amylase có khả năng phân cắt các liên kết 1,4-glucoside nằm bên trong của phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen) một cách ngẫu nhiên. a - amylase của nấm sợi có khả năng dextrin hóa cao (dịch hóa) lại vừa tạo ra một lượng lớn glucose và maltose. Hầu hết vai trò của nấm sợi có trong men rượu là để phân giải tinh bột ban đầu tạo thành glucose là nguồn nguyên liệu chính cho quá trình lên men của nấm men trong quá trình lên men rượu. Tuy nhiên, không phải tất cả chủng nấm sợi nào cũng có thể có trong thành phần của men rượu được. Ví dụ như chủng Penicillium giống này có khả năng sinh ra hệ enzyme đường hoá mạnh nhưng nó thường có mùi vị mốc rất khó chịu nên thường không được hoan nghênh trong nghề chế biến thực phẩm. Một số chủng nấm sợi thường được sử dụng trong các loại men là Mucor và Rhizopus [5]. 1.1.3.2. Nhóm Nấm men Thuật ngữ Nấm men (yeast, levure) là tên chung để chỉ nhóm vi nấm thường có cấu đơn bào và thường sinh sản theo lối nảy chồi. Nấm men không thuộc một đơn vị phân loại nào nhất định, chúng có thể thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm (Basidiomycota). Vai trò của nấm men trong men rượu rất quan trọng nó quyết định 1 phần rất lớn để tạo ra được một thứ rượu ngon hảo hạn. Nấm men có trong bánh men chủ yếu là men rượu (Saccharomyces cerevisiae). Ngoài men rượu ra, các giống khác có trong bánh men đều coi là men dại, men tạp có lẫn trong bánh men mà ta không mong muốn. Các giống khác như Hyphopichia burtonii, Pichia anomada, P. fabianii, P. fermentans, P. ohmeri, P. terricola, Saccharomyces aceti, S. diastaticus, S. fermentati, S. exiguas, S. globus, S. heterogenicus, S. rouxii, Candida javanica, C. mensenterica, C. pelliculosa, Torulopsis candida, T. etchellsii, T. mogii, T. stella, T. utilis, T. versatillis, Trichosporon cutaneum, Tr. Fermentans, Tr. variabile,... [5] 1.1.3.3. Giả Nấm men (men giả) Trong bánh men còn có loài men giả Endomycopsis fibuliger. Giống Endomylopsis được gọi là giả nấm men vì khi trưởng thành có hệ sợi giả cùng với bào tử đính nhiều chồi. Giống này có khả năng sinh nhiều glucoamylase và đặc biệt trong hệ enzyme do giống này sinh ra ưu việt hơn nấm sợi vì có ít enzyme transglucosidase. Sự có mặt của enzyme này làm chuyển một phần glucose thành axit gluconic. Hơn nữa, enzyme lấy từ chế phẩm nuôi Endomycopsis không có mùi mốc làm cho hương vị của rượu thành phẩm thơm ngon hơn [5]. 1.1.3.4. Vi khuẩn Trong bánh men có thể có mặt vi khuẩn lactic, vi khuẩn axetic,... Nhìn chung, các vi khuẩn ở đây đều do tạp nhiễm, ta không mong muốn. Các nguồn tạp nhiễm chính là: - Từ men giống ban đầu trong quá trình nhân giống (trong phòng thí nghiệm hoặc trong sản xuất) bị nhiễm. Tạp nhiễm kiểu này khá nguy hiểm vì giống sản xuất bị nhiễm làm cho toàn bộ quá trình lên men bị nhiễm, nếu nhiễm nặng có thể làm hỏng cả quy trình. - Nhiễm từ nước sản xuất không đạt yêu cầu: rửa nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị sẽ bị nhiễm ở diện rộng. - Nhiễm từ không khí. - Nhiễm do quá trình chuẩn bị không đảm bảo vệ sinh, vô trùng, nhiễm vào khi làm nguội các loại môi trường nuôi cấy. - Cũng có thể nhiễm từ quần áo, dày dép, đồ dùng của người trực tiếp sản xuất không tuân thủ các quy định về vệ sinh. Các vi khuẩn tạp nhiễm có thể vô hại, nhưng thông thường là gây hại. Chúng làm thay đổi mùi vị của dịch lên men, làm giảm độ bền, xấu màu, hương vị của sản phẩm. Nhiễm nhẹ các vi khuẩn này cũng làm cho hiệu suất lên men giảm vì chúng cạnh tranh dinh dưỡng cacbon (đường) với men giống. Bảng 1.2. Một số tiêu chuẩn chất lượng an toàn của rượu trắng [15] rri /V 1 *7 J • /V Tên chỉ tiêu Mức 1. Hàm lượng ethanol (cồn) ở 200, tính theo % (v/v) Theo công bố của nhà sản xuất 2. Hàm lượng aldehyde, tính bằng miligam aldehyde axetic trong 1 lít 50 0 rượu 100 , không lớn hơn 3. Hàm lượng methanol trong 1 lít ethanol 1000, tính bằng % (v/v), 0,1 không lớn hơn Hàm lượng rượu bậc cao tính theo tỉ lệ hỗn hợp izopentanol và izobutanol, Theo tiêu chuẩn đã được công bố của hỗn hợp 3:1, tính bằng miligam trong nhà sản xuất 1 l ethanol 1000 Hàm lượng furfurol, mg/l, không lớn Vết hơn Methanol không phải là một sản phẩm bình thường trong quá trình lên men rượu. Việc kiểm soát hàm lượng methanol trong các loại đồ uống có cồn là đặc biệt quan trọng vì nó được xem là mối nguy lớn nhất trong rượu, là nguy cơ gây ngộ độc cấp cao, nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong ngộ độc rượu. Nhưng sự hiện diện của hợp chất này có thể không ảnh hưởng đến cảm quan của đồ uống có cồn vì ngưỡng cảm nhận nó rất cao. Tuy nhiên vẫn có một số tác động tiêu cực do độc tính của methanol. Uống rượu với hàm lượng methanol cao có thể gây mù mắt hoặc thậm chí tử vong [27]. 90% aldehyde trong rượu chính là acetaldehyde. Acetaldehyde là một sản phẩm phụ thuộc trực tiếp trong quá trình lên men rượu. Theo Nguyễn