Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm hóa mô miễn dịch mảng sinh thiết tủy ở bệnh nhân đa u tủy xương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *****_***** TRẦN BẢO TRÂM NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA MÔ MIỄN DỊCH MẢNH SINH THIẾT TỦY Ở BỆNH NHÂN ĐA U TỦY XƯƠNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA Khoá 2011 – 2015 HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *****_***** TRẦN BẢO TRÂM NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA MÔ MIỄN DỊCH MẢNH SINH THIẾT TỦY Ở BỆNH NHÂN ĐA U TỦY XƯƠNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA Khoá 2011 – 2015 Người hướng dẫn khoa học: ThS. Phạm Hải Yến. HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ nhiệt tình từ các thầy cô, gia đình và bạn bè. Trước hết, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Hải Yến, Phó trưởng khoa Tế bào - Tổ chức học Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương, người đã trực tiếp dìu dắt, hướng dẫn tôi thực hiện đề tài nghiên cứu cũng như đưa ra những ý kiến quý báu, sửa chữa tỉ mỉ, giúp tôi hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Phạm Quang Vinh - Chủ nhiệm bộ môn Huyết học - Truyền máu trường Đại học Y Hà Nội, cùng các thầy cô giáo trong bộ môn Huyết học - Truyền máu trường Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Tôi xin cảm ơn Ban Giám đốc, Phòng Kế hoạch - Tổng hợp Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu tại bệnh viện. Tôi xin cảm ơn ThS. Nguyễn Ngọc Dũng - Trưởng khoa Tế bào - Tổ chức học và các anh chị cán bộ nhân viên trong khoa đã nhiệt tình giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới bố mẹ và những người thân yêu trong gia đình cũng như bạn bè đã luôn ở bên, động viên và ủng hộ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Hà Nội, tháng 6 năm 2015 Sinh viên Trần Bảo Trâm LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Hải Yến và sự giúp đỡ của các anh chị trong khoa Tế bào - Tổ chức học Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương, tất cả số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ nghiên cứu nào khác. Hà Nội, tháng 6 năm 2015 Người viết khóa luận Trần Bảo Trâm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Chương 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 3 1.1. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch. ............................................................... 3 1.1.1. Lịch sử hình thành và phát triển. .............................................. 3 1.1.2. Nguyên lý. ................................................................................. 4 1.1.3. Nhuộm hóa mô miễn dịch......................................................... 7 1.2. Bệnh đa u tủy xương. ....................................................................... 10 1.2.1. Sơ lược về bệnh đa u tủy xương. ............................................ 10 1.2.2. Nguồn gốc phát triển và sự ác tính hóa của tương bào........... 11 1.2.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định............................................... 11 1.2.4. Các giai đoạn của ĐUTX. ....................................................... 13 1.3. Đặc điểm tiêu bản nhuộm HMMD mảnh sinh thiết tủy ở bệnh nhân đa u tủy xương............................................................................................. 14 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 18 2.1. Đối tượng nghiên cứu. ..................................................................... 18 2.2. Phương pháp nghiên cứu. ................................................................ 18 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ................................................................ 18 2.2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................... 18 2.2.3. Các tiêu chuẩn đánh giá. ......................................................... 19 2.2.4. Vật liệu nghiên cứu ................................................................. 20 2.2.5. Các kỹ thuật xét nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu. ..... 23 2.2.6. Xử lý số liệu. ........................................................................... 25 2.2.7. Sơ đồ nghiên cứu. ................................................................... 26 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 27 3.1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu. ........................................... 27 3.2. Đặc điểm hóa mô miễn dịch mảnh sinh thiết tủy xương. ................ 29 Chương 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 36 4.1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu. ........................................... 36 4.1.1. Đặc điểm về tuổi, giới ............................................................. 36 4.1.2. Đặc điểm về tỷ lệ tế bào dòng plasmo trong tủy xương ......... 37 4.1.3. Đặc điểm về phân loại giai đoạn bệnh theo hệ thống phân loại giai đoạn quốc tế ISS. ....................................................................... 38 4.2. Đặc điểm hóa mô miễn dịch mảnh sinh thiết tủy xương. ................ 39 4.2.1. Các dấu ấn đặc trưng của tương bào ....................................... 39 4.2.2. Đặc điểm các dấu ấn KN khác. ............................................... 40 KẾT LUẬN .................................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BN: Bệnh nhân CD: Cluster of Differentiation (Nhóm biệt hóa) DAB: 3,3- diaminobeziden tetrahydrochlorid ĐUTX: Đa u tủy xương HMMD: Hóa mô miễn dịch H&E: Hematoxylin and Eosin HRP: Horseradish Peroxidase Ig: Immunoglobulin (Globulin miễn dịch) ISS: International Staging System (Hệ thống phân loại giai đoạn quốc tế) KN: Kháng nguyên KT: Kháng thể MUM1: Multiple myeloma oncogen 1 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Hệ thống phân độ giai đoạn Durie - Salmon. ................................. 13 Bảng 1.2. Hệ thống phân loại giai đoạn quốc tế ISS và thời gian sống thêm trung bình tương ứng ....................................................................................... 14 Bảng 3.1. Phân bố theo tuổi của nhóm nghiên cứu. ....................................... 27 Bảng 3.2. Tỷ lệ tế bào dòng plasmo trong tủy xương. .................................... 28 Bảng 3.3. Phân bố nhóm nghiên cứu theo giai đoạn bệnh theo ISS. .............. 29 Bảng 3.4. Đặc điểm về các dấu ấn đặc trưng của dòng plasmo. .................... 29 Bảng 3.5. Đặc điểm của dấu ấn miễn dịch CD20. ........................................ 31 Bảng 3.6. Đặc điểm CD20 và tỷ lệ TB dòng plasmo trong tủy xương ........... 32 Bảng 3.7. Đặc điểm Cyclin D1 và giai đoạn bệnh. ......................................... 33 Bảng 3.8. Đặc điểm Cyclin D1 và tỷ lệ TB dòng plasmo trong tủy xương.... 34 Bảng 4.1. Tỷ lệ nam/nữ trong bệnh ĐUTX của một số tác giả tại Việt Nam. 36 Bảng 4.2 Tỷ lệ tế bào dòng plasmo (tương bào) trong tủy xương. ................. 38 Bảng 4.3. Tỷ lệ % bệnh nhân theo giai đoạn bệnh ISS................................... 39 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Phân bố theo giới của nhóm nghiên cứu. ................................... 27 Biểu đồ 3.2. Sự biểu hiện của CD20 và giai đoạn bệnh. ................................ 31 Biểu đồ 3.3. Đặc điểm dấu ấn miễn dịch kappa, lambda. ............................... 32 Biểu đồ 3.4. Cyclin D1 và CD20. .................................................................. 34 Biểu đồ 3.5. Đặc điểm Cyclin D1 và đột biến di truyền kiểu đa bội .............. 35 DANH MỤC ẢNH Ảnh 3.1. Nhuộm H&E đánh giá tỷ lệ tế bào dòng plasmo trong tủy xương. 28 Ảnh 3.2. CD38 dương tính trên tiêu bản STTX. ............................................. 30 Ảnh 3.3. CD138 dương tính trên tiêu bản STTX............................................ 30 Ảnh 3.4. Kappa dương tính trên tiêu bản STTX. ............................................ 33 Ảnh 3.5. Cyclin D1 dương tính trên tiêu bản STTX....................................... 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, xét nghiệm giải phẫu bệnh ngày càng đóng vai trò không thể thiếu, là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán ung thư và các bệnh nhiễm khuẩn. Nhiều kỹ thuật giải phẫu bệnh ra đời phục vụ cho công tác chẩn đoán vi thể như H&E (Hematoxylin and Eosin), P.A.S,... đặc biệt là kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry). Hóa mô miễn dịch là sự kết hợp giữa hai ngành mô bệnh học (Histopathology) và miễn dịch học (Immunology), cho phép phát hiện những đặc tính kháng nguyên có mặt trong tế bào (màng tế bào, bào tương, nhân) bằng cách dùng các kháng thể đánh dấu đặc hiệu. Như vậy, các nhà giải phẫu bệnh có thể quan sát và đánh giá được cả hai phương diện hình thái học và miễn dịch học của tế bào. Kỹ thuật này rất có ích trong việc chẩn đoán, phân loại, điều trị và tiên lượng bệnh [1]. Đa u tủy xương (ĐUTX, bệnh Kahler) là một bệnh tăng sinh ác tính của tương bào trong tủy xương, dẫn đến tăng sản xuất các paraprotein trong máu và/hoặc trong nước tiểu gây tổn thương thận và các cơ quan khác [2]. Bệnh chiếm 1% các bệnh ác tính nói chung và 10% bệnh máu ác tính, ở nam cao hơn ở nữ (6,5:4,2/100000 dân). Độ tuổi trung bình ở thời điểm được chẩn đoán là 65 tuổi [3], [4], [5]. Hiện nay, ĐUTX chủ yếu được chẩn đoán nhờ các xét nghiệm huyết học (huyết tủy đồ), sinh hóa - miễn dịch (điện di protein huyết thanh/ nước tiểu, định lượng chuỗi nhẹ kappa/ lambda tự do huyết thanh), X-quang xương và giải phẫu bệnh (nhuộm H&E và nhuộm hóa mô miễn dịch mảnh sinh thiết tủy xương). Việc sử dụng các kỹ thuật giải phẫu bệnh, đặc biệt là nhuộm hóa mô miễn dịch để chẩn đoán và tiên lượng ĐUTX đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới, đem lại giá trị to lớn cho người bệnh. 2 Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về nhuộm hóa mô miễn dịch trên mảnh sinh thiết tủy ở bệnh nhân Đa u tủy xương, do đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hóa mô miễn dịch mảnh sinh thiết tủy ở bệnh nhân Đa u tủy xương” với mục tiêu sau: Mô tả đặc điểm một số dấu ấn miễn dịch trên tiêu bản mảnh sinh thiết tủy ở bệnh nhân Đa u tủy xương. 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch. Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry, viết tắt là HMMD) là kỹ thuật nhuộm sử dụng các kháng thể đặc hiệu, nhờ các phản ứng kháng nguyên - kháng thể và hóa chất để làm hiện rõ các kháng nguyên có mặt trong tổ chức hoặc mô [6]. 1.1.1. Lịch sử hình thành và phát triển. Năm 1941, Coons và cộng sự là những người đầu tiên đánh dấu kháng thể (KT) bằng chất nhuộm huỳnh quang và dùng chúng để xác định kháng nguyên (KN) trên mặt cắt mô. Năm 1966, Nakane và Pierce đã báo cáo về việc sử dụng KT được gắn enzym peroxidase chiết xuất từ cây cải ngựa cùng với chất nền như DAB (3,3- diaminobeziden tetrahydrochlorid), cho phép quan sát cả hình thái học cùng với sự thể hiện KN. Từ năm 1966, nhiều kỹ thuật gắn enzyme đã được phát triển. Năm 1970, Sterberger và cộng sự đã mô tả kỹ thuật PAP (Peroxidase-anti-peroxidase). Năm 1971, Engwall và Ash đã đề nghị sử dụng phức hợp Avidin - biotin cho miễn dịch huỳnh quang. Năm 1984, Cordell và cộng sự đã mô tả kỹ thuật APAAP (Alkaline phosphatase anti alkaline phosphatase). Năm 1982, Straus đã đề nghị thêm Imidazol, Hsu và Soban thêm kim loại nặng vào chất nền. Năm 1988, theo Bobrow, độ nhạy có thể tăng lên bằng việc sử dụng Tyramin được biotin hóa và khử peroxidase tại vị trí xảy ra phản ứng miễn dịch. Năm 1997, King và cộng sự cho rằng sử dụng chất nền DAB có độ nhạy tăng lên nhiều so với kỹ thuật Avidin-biotin [7]. 4 Cùng với hệ thống nhận biết, việc sản xuất KT cũng có nhiều phát triển. Năm 1975, Kohler và Milstein đã mô tả một phương pháp cải tiến lớn trong sản xuất KT đơn dòng. Những năm gần đây, sự phát triển mạnh mẽ trong lĩnh vực sinh học phân tử cho phép tăng khả năng sản xuất peptid tổng hợp cả KT đơn dòng và KT đa dòng. Trong giai đoạn phát triển sớm của HMMD, người ta đã nghĩ rằng quá trình cố định, chuyển đúc thông thường đã phá hủy hoặc che lấp một số epitop. Năm 1970, Huang và cộng sự đã mô tả việc sử dụng enzym trypsin trên mảnh cắt paraffin để bộc lộ một số KN đã bị che lấp trong quá trình cố định và chuyển đúc. Năm 1991, Shi lần đầu tiên mô tả về quá trình tiền xử lý nhiệt (Heat pretreatment) bằng lò vi sóng để xử lý mảnh cắt đã khử paraffin trong một dung dịch kim loại nặng. Năm 1993, Cattoretti đã đề nghị thay thế dung dịch kim loại nặng thành dung dịch Citrate buffer pH 6. Năm 1994, Norton cho rằng việc sử dụng nồi áp suất hiệu quả hơn lò vi sóng trong việc bộc lộ một số KN. Sau đó, một vài tác giả đã đưa ra một vài phương pháp bộc lộ khác như: để tủ ấm qua đêm ở 70-80oC trong Citrat, trong Tris EDTA hay trong acid boric,.... [7]. 1.1.2. Nguyên lý. Chìa khóa của HMMD là sự kết hợp đặc hiệu giữa KN và KT, dựa trên nguyên lý cơ bản là: khi phủ KT đặc hiệu lên mô, nếu trong mô có KN cần tìm sẽ xảy ra phản ứng kết hợp KN - KT. Phức hợp KN - KT này được gắn với hệ thống nhận biết một cách trực tiếp hoặc gián tiếp và có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học (hoặc huỳnh quang) [8]. 1.1.2.1. Kháng nguyên: Kháng nguyên thường có bản chất là protein, cũng có thể là lipid, carbonhydrat,... nằm trên màng tế bào, trong bào tương hoặc trong nhân tế 5 bào,... cũng có thể là thành phần của mô như các sợi trung gian (Keratin, Vimentin, Neurofilament,…), các thụ thể hormon (Estrogen - Re, Progestron Re,…), các protein là sản phẩm của đột biến gen (p53, p63),... hoặc từ ngoài vào như vi khuẩn, virus,... [1]. Mỗi KN đều mang một hoặc nhiều vị trí gắn với KT gọi là epitop - vị trí quyết định KN. Đây là những vùng có tính đặc hiệu cao với từng loại KT nhưng có thể bị che lấp trong quá trình cố định bằng formol và chuyển đúc paraffin. Do vậy, cần bộc lộ epitop của KN trước khi cho tiếp xúc với KT. 1.1.2.2. Kháng thể: Kháng thể có bản chất là protein huyết thanh, là các globulin miễn dịch (Ig). Có 5 loại KT được tìm thấy trong máu là IgA, IgG, IgD, IgM, IgE, trong đó, IgG là phổ biến nhất và được sử dụng nhiều nhất trong HMMD, kế đến là IgM. Trên kháng thể có các paratop. Cấu hình của paratop cần phù hợp cao độ với epitop thì các lực này mới xuất hiện và đủ giá trị kết hợp [7], [9]. Kháng thể đa dòng (polyclonal antibody) là một hỗn hợp không đồng nhất các KT có nhiều vị trí kết hợp KN. Chúng được sản xuất bằng cách gây miễn dịch trên động vật thường là thỏ, chuột lang, dê, bò, lợn với KN đặc hiệu cần quan tâm [10], [11], [12]. Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) là một quần thể đồng nhất của globulin miễn dịch chống lại một epitop của KN. KT đơn dòng thường được sản xuất ở chuột hoặc thỏ bằng kỹ thuật u lai. Đây là một kỹ thuật được phát triển bởi Kohler và Milstein (1975), đã tạo nên một cuộc cách mạng cho HMMD [13]. Nó làm tăng nhanh cả về chất lượng và số lượng KT. Bằng sự sàng lọc cẩn thận, KN gốc không cần phải tinh khiết vì những sản phẩm lai từ những KN hay epitop không mong muốn sẽ được loại bỏ. Kết quả là một KT tinh khiết với độ đặc hiệu cao được tạo ra [11]. 6 So với KT đơn dòng, KT đa dòng dễ sản xuất hơn và nhạy hơn nhưng lại không đặc hiệu bằng. Do KT đa dòng chứa các KT không đặc hiệu được sinh ra khi động vật chống lại sự nhiễm trùng trong một dịp nào đó, ngay cả khi được làm tinh khiết nên gây khả năng nhuộm nền cao hơn [14]. Về giá thành, KT đơn dòng đắt hơn nhưng ngày càng được sử dụng rộng rãi vì tính đặc hiệu cao. Trong kỹ thuật gián tiếp ta thường sử dụng 2 loại KT: KT1 (hay KT chính) và KT2 (hay KT liên hợp, KT bắc cầu). KT1 là kháng thể gắn đặc hiệu với KN cần tìm trong mô, thường là KT của thỏ hoặc chuột kháng người, nó có thể là KT đơn dòng hoặc đa dòng. KT2 liên hợp với enzym (Peroxidase, Alkalin phosphatase), chất huỳnh quang (FITC, Qdot,...), hoặc phức hợp Biotin - avidin,... và hoạt động như là cầu nối giữa KT1 với hệ thống đánh dấu. KT2 thực chất là kháng thể chống globulin miễn dịch (IgG) của động vật sản xuất ra KT1 nên phải có sự tương đồng với KT1. Ví dụ, nếu KT1 thuộc loại IgG của chuột, thì KT2 là KT của thỏ hoặc của dê chống IgG của chuột [11], [13]. 1.1.2.3. Hệ thống nhận biết: Phức hợp KN - KT hình thành không thể quan sát được bằng kính hiển vi quang học nên cần có một hệ thống tín hiệu để nhận biết vị trí xảy ra phản ứng KN - KT. Hệ thống này có thể gắn trực tiếp vào KT1 (kỹ thuật trực tiếp) hay thông qua một hoặc nhiều hệ thống KT phụ (kỹ thuật gián tiếp). Có nhiều hệ thống nhận biết ứng dụng trong HMMD như: nhận biết bằng enzym, đánh dấu huỳnh quang, đánh dấu bằng kim loại gắn keo hoặc bằng đồng vị phóng xạ. Nhận biết phản ứng KN - KT bằng enzym được sử dụng rộng rãi nhất trong HMMD. Bằng phản ứng enzym - cơ chất sẽ tạo ra một sản phẩm màu ổn 7 định và có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học. Có nhiều loại enzym và chất màu thích hợp cho phép người dùng lựa chọn màu cho sản phẩm phản ứng cuối cùng sao cho tạo ra sự tương phản nhất. Trong đó, Peroxidase chiết xuất từ cây cải ngựa (HRP: Horseradish Peroxidase) là loại enzym được sử dụng rộng rãi nhất và kết hợp với chất màu thích hợp nhất là DAB. Nó tạo ra sản phẩm phản ứng cuối cùng màu nâu sẫm rõ nét, ổn định trong nhiều năm và không tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác (Graham và Karnovsky, 1966) [15]. DAB là một chất độc gây ung thư tiềm năng (Weisburger và cộng sự, 1978). 1.1.3. Nhuộm hóa mô miễn dịch. 1.1.3.1. Các kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch: a. Kỹ thuật trực tiếp: - Kỹ thuật trực tiếp truyền thống: Các KT chính liên kết trực tiếp với chất đánh dấu (chất màu huỳnh quang, enzyme,...). - Kỹ thuật trực tiếp mới (Phương pháp nhuộm một bước được tăng cường polymer - EPOS: Enhanced Polymer One-step Staining): Một lượng lớn các KT chính gắn enzym peroxidase được gắn vào một “xương sống” polymer dextran [16]. b. Kỹ thuật gián tiếp: - Kỹ thuật gián tiếp truyền thống: KT1 gắn với hệ thống nhận biết thông qua một kháng kháng thể (KKT) hay KT2. Chất đánh dấu thường sử dụng là huỳnh quang hoặc enzyme. - Kỹ thuật gián tiếp mới: Dựa trên công nghệ Dextran trong hệ thống nhận biết EPOS, thay thế KT chính bằng một KT thứ cấp. Đây là kỹ thuật 8 được áp dụng trong đề tài, trong đó chất đánh dấu là enzyme peroxidase chiết xuất từ cây cải ngựa và chất màu là DAB. - Kỹ thuật không đánh dấu KT (Kỹ thuật PAP và APAAP). - Kỹ thuật Avidin (Streptavidin) - Biotin (Kỹ thuật ABC): KN - KT1 - KT2 biotin hóa - avidin (streptavidin) liên hợp với enzym - chất nền. 1.1.3.2. Quy trình nhuộm HMMD trên mảnh sinh thiết tủy xương: a. Xử lý bệnh phẩm mảnh sinh thiết tủy xương: Quá trình xử lý bệnh phẩm mảnh sinh thiết tủy xương gồm các bước sau: - Lấy bệnh phẩm: đúng vùng tổn thương và đủ thành phần, thể tích. - Cố định mảnh sinh thiết trong dung dịch Helly. - Rửa nước chảy nhẹ, khử canxi qua đêm. - Chuyển mẫu trong máy xử lý mô tự động. - Đúc nến bệnh phẩm, làm lạnh và ghi thông tin mẫu lên cassette. - Cắt bệnh phẩm sau khi đúc nến, gắn vào lam kính bằng chất dính. - Sấy khô trong tủ ấm 40ºC. Xử lý bệnh phẩm mảnh sinh thiết tủy xương khác các mô khác ở chỗ thời gian khử canxi đối với mảnh sinh thiết tủy dài hơn do lượng canxi ở đây nhiều hơn các mô khác. b. Nhuộm hóa mô miễn dịch: Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch tại khoa Tế bào - Tổ chức học Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương áp dụng theo kỹ thuật gián tiếp mới, trong đó phức hợp KN - KT gắn với enzyme peroxidase đã được gắn trên xương sống “Dextran” thông qua KT thứ chính (KT2). Kỹ thuật này được 9 công bố đầu tiên bởi hãng Dako dưới tên thương mại là Dako EnVisionTM, sau đó được nhiều hãng phát triển và cải tiến. Kỹ thuật hiện nay được sử dụng tại khoa là của hãng Cell Marque với quy trình gồm những bước sau: Bộc lộ kháng nguyên: - Tẩy nến bằng dung dịch Toluen. - Phục hồi tế bào bằng cồn. - Nhúng tiêu bản trong dung dịch Citrate buffer pH=7,0; đun trong lò vi sóng chế độ MedHigh. Để nguội ở nhiệt độ phòng đến 30-40ºC, sau đó rửa bằng dung dịch TBS pH = 7,6 ba lần (lần 1: tráng qua, lần 2 và lần 3 mỗi lần 5 phút). - Khử men peroxidase nội sinh bằng dung dịch H2O2 3%; tráng qua nước cất 2 lần sau đó rửa 3 lần bằng dung dịch TBS (pH = 7,6). - Phủ KT1, ủ 60 phút trong phòng ẩm khép kín; rửa 3 lần bằng dung dịch TBS pH 7,6. - Phủ KT2 (Hidef Detection Amplifier), ủ 10 phút; rửa 3 lần bằng dung dịch TBS pH 7,6. - Phủ HRP (Hidef Detection HRP- Polymer), ủ 10 phút, rửa 3 lần bằng dung dịch TBS pH 7,6. - Phủ dung dịch DAB (Diamino benzidin, 20-30 ml): 5 giây - 3 phút; rửa bằng nước cất. - Nhuộm bằng Hematoxylin trong 5 phút; rửa nước chảy nhẹ 5 phút. - Đẩy nước trong tiêu bản bằng cồn tuyệt đối. - Đẩy cồn bằng Toluen: 5 phút. - Gắn lamen, sấy khô, đọc kết quả. 10 1.2. Bệnh đa u tủy xương. Đa u tủy xương (ĐUTX) là một bệnh tăng sinh ác tính dòng tương bào (Plasma cells) chủ yếu trong tủy xương. Những tế bào (TB) này được biệt hóa từ các tế bào lympho B và có khả năng sản xuất ra các globulin miễn dịch (Ig) gây ra những rối loạn đặc trưng của bệnh [17]. 1.2.1. Sơ lược về bệnh đa u tủy xương. Giữa thế kỷ XIX, các tác giả John Dalrymple, Henry Bence - Jones và William Mac Intyre lần đầu tiên mô tả bệnh ĐUTX ở một bệnh nhân (BN) 46 tuổi bị đau xương và một loại protein niệu bất thường được tìm thấy ở BN này [18]. Năm 1889, Kahler đã mô tả triệu chứng lâm sàng và hình ảnh tổn thương trên X-quang của bệnh. Năm 1900, Wright thông báo mối liên hệ mật thiết giữa các tế bào u tủy với tương bào. Vào những năm 1930, kỹ thuật chọc hút tủy xương ra đời thì bệnh ĐUTX mới được làm sáng tỏ [19]. Năm 1972, trong danh pháp của Tổ chức Y tế Thế giới, Mathé và Rappaport định nghĩa bệnh ĐUTX là một bệnh “ung thư hóa hệ thống tương bào”, gây ra u có tính chất khu trú hoặc thâm nhiễm lan tỏa, chủ yếu vào tủy xương. Bệnh thường kết hợp với hiện tượng tăng Ig đơn dòng (IgG, IgA, IgD) hoặc protein chuỗi nhẹ trong huyết thanh và nước tiểu. Tiếp đó, có nhiều bằng chứng khẳng định các Ig tham gia vào quá trình sinh bệnh học của bệnh, gây ra rối loạn bệnh lý ở nhiều cơ quan như thận, hệ thần kinh, hệ miễn dịch [17]. Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy có một số yếu tố nguy cơ của bệnh như: tỷ lệ bệnh tăng theo tuổi (chủ yếu từ 40-70 tuổi, hiếm gặp ở người dưới 40 tuổi), gặp ở nam nhiều hơn nữ (từ 1,1 đến 2 lần), và người da đen nhiều hơn người da trắng [20]. Nhiều tác giả cho rằng tia xạ, sự tiếp xúc với hóa chất như benzen, amian hay chất độc công nghiệp và nông nghiệp có thể là yếu tố gây bệnh. 11 1.2.2. Nguồn gốc phát triển và sự ác tính hóa của tương bào. Tương bào là tế bào trưởng thành nhất của lympho dòng B. Tế bào gốc lympho bắt nguồn từ tế bào gốc vạn năng trải qua các giai đoạn biệt hóa như giai đoạn tế bào B sớm, B chín, B trưởng thành cuối cùng biệt hóa thành tương bào có khả năng tổng hợp các globulin miễn dịch [21], [22]. Trong cơ thể có 2 loại tương bào: Tương bào có đời sống ngắn (3 ngày) là giai đoạn biệt hóa cuối cùng của nguyên tương bào; Tương bào có đời sống dài (30 ngày) được biệt hóa từ lympho B theo quá trình: lympho B đi vào trung tâm mầm, được kích thích trở thành tế bào hoạt động nhưng vẫn đi vào chu kỳ chết theo chương trình trừ khi có sự tác động trở lại của KN, khi tế bào này xâm lấn vào tủy xương và có sự tương tác với tế bào đệm thì biệt hóa thành tế bào có đời sống dài [22]. Sự tăng sinh ác tính của các tương bào sẽ làm tăng tổng hợp Ig và do đó lượng protein toàn phần trong máu cũng tăng lên rất nhiều, thường là cao hơn 80g/l và có thể vượt quá 100g/l [23]. Tuy nhiên lượng protein bình thường cũng không loại trừ ĐUTX, đặc biệt là trường hợp chuỗi nhẹ. ĐUTX typ IgG chiếm khoảng 50% trường hợp, IgA chiếm 25% và loại chuỗi nhẹ đơn thuần chiếm 20%. ĐUTX typ IgD chỉ chiếm 1%, IgE rất hiếm gặp. Hậu quả của tăng Ig bệnh lý bao gồm: Rối loạn đông máu, ứ đọng của protein M, suy thận, thoái hóa dạng tinh bột, dễ nhiễm trùng [17]. 1.2.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định. a. Tiêu chuẩn của Bart Barlogie 1995: Tiêu chuẩn chính: - Có u tương bào trên sinh thiết tủy hoặc ở một tổ chức. - Các tế bào thuộc dòng tương bào > 30% trong tủy.