Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen npm1 và flt3 ở bệnh nhân lơxêmi cấp dòng tủy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ NGUYỄN VĂN HUY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1 VÀ FLT3 Ở BỆNH NHÂN LƠ XÊ MI CẤP DÒNG TỦY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2011 – 2015 HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN VĂN HUY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1 VÀ FLT3 Ở BỆNH NHÂN LƠ XÊ MI CẤP DÒNG TỦY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2011 – 2015 Người hướng dẫn khoa học: Th.S. NGUYỄN VŨ BẢO ANH HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, em xin gửi lời cảm ơn tới Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Quản lý đào tạo Đại học Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện để em học tập và hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Phạm Quang Vinh, chủ nhiệm Bộ môn Huyết học Trường Đại học Y Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô trong Bộ môn đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Em xin gửi tới ThS. Nguyễn Vũ Bảo Anh lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, người thầy đã cho em những bài học đầu tiên về nghiên cứu khoa học, luôn tận tình dành thời gian quý báu và công sức chỉ bảo cho em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban lãnh đạo Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đã tạo điều kiện tốt nhất cho e hoàn thành khóa luận. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bác sỹ, các anh chị kỹ thuật viên đang làm việc tại khoa Tế bào tổ chức học, khoa Di truyền sinh học phân tử, phòng Kế hoạch tổng hợp Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bệnh nhân đã cung cấp cho em những số liệu quý giá để thực hiện khóa luận này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, cổ vũ và động viên cả em học tập và hoàn thành khóa luận này. Hà nội, ngày 25 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Văn Huy LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, do nỗ lực của bản thân dưới sự hướng dẫn tận tình của ThS. Nguyễn Vũ Bảo Anh. Các số liệu, kết quả được trình bày trong nghiên cứu này là trung thực do tôi thu thập tỷ mỉ và chính xác tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương. Kết quả nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ tài liệu nào khác. Nghiên cứu chỉ nhằm mục đích khoa học, không nhằm mục đích riêng nào khác. Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Văn Huy MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 2 1.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ GỌI TÊN LƠ XÊ MI CẤP ...................... 2 1.2. CƠ CHẾ BỆNH SINH LƠ XÊ MI CẤP ............................................... 2 1.2.1. Sinh tế bào máu bình thường và LXMc ......................................... 2 1.2.2. Sự liên quan giữa hệ thống gen trong tế bào với ung thư............... 3 1.2.3. Cơ chế tổn thương phân tử dẫn đến LXMc ................................... 3 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ XẾP LOẠI LXMc ........... 5 1.3.1. Phương pháp hình thái học ............................................................. 5 1.3.2. Phương pháp hóa học tế bào ........................................................... 6 1.3.3. Phương pháp miễn dịch học ........................................................... 7 1.3.4. Phương pháp di truyền tế bào ......................................................... 7 1.3.5. Xếp loại LXMc ............................................................................... 7 1.4. CÁC ĐỘT BIẾN GEN TRONG LXMc DÒNG TỦY ........................ 10 1.4.1. Đột biến gen NPM1 ...................................................................... 10 1.4.2. Đột biến gen FLT3 ........................................................................ 12 1.4.3. Một số đột biến gen khác .............................................................. 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 15 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................. 15 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 15 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ...................................................................... 15 2.2.2. Nội dung và biến số nghiên cứu ................................................... 15 2.2.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán LXMc dòng tủy ........................................ 16 2.2.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 16 2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ................................................... 21 2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU .................................. 22 2.5. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU ....................................................................... 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 23 3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU ......................... 23 3.1.1. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo tuổi ...................................... 23 3.1.2. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo giới ...................................... 24 3.1.3. Phân bố bệnh nhân theo thể bệnh FAB ........................................ 24 3.2. ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1-mutA, FLT3-ITD, FLT3-TKD CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU ................................................................. 25 3.2.1. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD . 25 3.2.2. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo giới .................................................................... 25 3.2.3. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo nhóm tuổi .......................................................... 26 3.2.4. Tỷ lệ đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo xếp loại FAB................................................................................. 27 3.3. ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ HUYẾT HỌC Ở BỆNH NHÂN CÓ CÁC ĐỘT BIẾN GEN NPM1-MUTA, FLT3-ITD VÀ FLT3-TKD ..... 28 3.3.1. Đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA ................................................................................. 28 3.3.2. Đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD... 30 3.3.3. Đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-TKD.................................................................................... 32 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 34 4.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU ......................... 34 4.1.1. Đặc điểm về tuổi ........................................................................... 34 4.1.2. Đặc điểm về giới ........................................................................... 34 4.1.3. Đặc điểm phân bố thể bệnh của bệnh nhân theo xếp loại FAB .... 35 4.2. ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1-MUTA, FLT3-ITD VÀ FLT3TKD CỦA NHÓM BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU ............................... 35 4.2.1. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD trong nhóm nghiên cứu ............................................. 35 4.2.2. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD, FLT3TKD theo giới ............................................................................... 36 4.2.3. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo nhóm tuổi .......................................................... 37 4.2.4. Tỷ lệ bệnh nhân có đột pbiến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD, FLT3TKD theo xếp loại FAB ............................................................... 37 4.3. ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ HUYẾT HỌC CỦA BỆNH NHÂN CÓ ĐỘT BIẾN GEN NPM1-MUTA, FLT3-ITD, FLT3-TKD .................... 38 4.3.1. Đặc điểm lâm sàng và huyết học của bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA ................................................................................. 38 4.3.2. Đặc điểm lâm sàng và huyết học của bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD ..................................................................................... 39 4.3.3. Đặc điểm lâm sàng và huyết học của bệnh nhân có đột biến gen FLT3-TKD.................................................................................... 41 KẾT LUẬN .................................................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid ribonucleic CD : Cluster of differantiation (Kháng nguyên biệt hóa) FAB : French – American – Bristish (Pháp - Mỹ - Anh) FLT3 : FMS – like tyrosine kinase 3 Hb : Hemoglobin (Huyết sắc tố) ITD : Internal Tandem Duplication (Đột biến lặp đoạn liên tục) LXMc : Lơ xê mi cấp MPO : Myeloperoxydase NPM1 : Nucleophosmin 1 NST : Nhiễm sắc thể PAS : Periodic – Acid - Schiff SLBC : Số lượng bạch cầu SLHC : Số lượng hồng cầu SLTBTX : Số lượng tế bào tủy xương SLTC : Số lượng tiểu cầu TKD : Tyrosin Kinase Domain (Đột biến vùng Tyrosin kinase) WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Xếp loại LXMc dòng tủy theo FAB có bổ sung ............................. 8 Bảng 1.2: Xếp loại LXMc dòng tủy theo WHO 2008 .................................... 9 Bảng 3.1: Phân bố tuổi của nhóm nghiên cứu ............................................... 23 Bảng 3.2: Tỷ lệ đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD ....... 25 Bảng 3.3: Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo nhóm tuổi........................................................... 26 Bảng 3.4: Tỷ lệ đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo xếp loại FAB ................................................................................. 27 Bảng 3.5: Đặc điểm tế bào học ở bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA ...... 29 Bảng 3.6: Đặc điểm tế bào học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD ..... 31 Bảng 3.7: Đặc điểm tế bào học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-TKD ... 33 Bảng 4.1: Tỷ lệ LXMc dòng tủy theo xếp loại FAB của một số tác giả ....... 35 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Phân bố giới tính của nhóm nghiên cứu .................................... 24 Biểu đồ 3.2: Phân bố bệnh nhân theo xếp loại FAB ...................................... 24 Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ bệnh nhân nam và nữ có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3ITD và FLT3-TKD .................................................................... 25 Biểu đồ 3.4: Đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA .... 28 Biểu đồ 3.5: Đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD .... 30 Biểu đồ 3.6: Đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-TKD .. 32 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vị trí của gen NPM1 trên NST ..................................................... 11 Hình 1.2: Vị trí của gen FLT3 trên NST....................................................... 12 Hình 2.1: Kết quả điện di trên gel của gen NPM1 ........................................ 21 Hình 2.2: Kết quả điện di trên gel của gen FLT3-ITD ................................. 21 Hình 2.3: Kết quả điện di trên gel của gen FLT3-TKD................................ 21 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Các bước tiến hành nghiên cứu .................................................... 22 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Lơ xê mi cấp (LXMc) là một bệnh lý ác tính không thuần nhất, bệnh được đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích lũy các tế bào non ác tính trong tủy xương và ở máu ngoại vi. Những tế bào này lấn át và ức chế quá trình trưởng thành và phát triển của các tế bào bình thường trong tủy xương [1]. Từ năm 2001, Tổ chức Y tế thế giới đã đề xuất phân loại LXMc dòng tủy dựa trên những biến đổi di truyền. Một số gen đã được nghiên cứu và ghi nhận có vai trò quan trọng trong tiên lượng và đáp ứng điều trị bệnh. Trong đó, 2 đột biến gen đặc trưng cho LXMc dòng tủy là NPM1 và FLT3 [2]. Đột biến gen NPM1 lần đầu tiên được báo cáo bởi Falini và cộng sự năm 2005. Đột biến gen NPM1 gặp khoảng 50% bệnh nhân LXMc dòng tuỷ có kiểu hình nhiễm sắc thể bình thường và thường xuất hiện ở bệnh nhi (2-8%). Bệnh nhân có đột biến gen này thường có tiên lượng tốt [3]. Đột biến gen FLT3 gặp khoảng 30% bệnh nhân LXMc dòng tủy có kiểu hình nhiễm sắc thể bình thường. Bệnh nhân có đột biến gen FLT3 có tiên lượng xấu ở cả người lớn lẫn trẻ em, hiệu quả điều trị thấp, tỷ lệ tái phát cao và thời gian sống chung ngắn [4]. Để đánh giá vai trò của 2 đột biến gen NPM1 và FLT3 trong tiên lượng và điều trị bệnh nhân LXMc dòng tủy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen NPM1 và FLT3 ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy” với mục tiêu: 1. Nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen NPM1 và FLT3 ở bệnh nhân LXMc dòng tủy tại viện Huyết học – Truyền máu Trung ương. 2. Mô tả đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến gen NPM1 và FLT3. 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ GỌI TÊN LƠ XÊ MI CẤP Năm 1827, Velpeau thông báo ca bệnh đầu tiên. Năm 1845, Bennett đã đặt tên cho bệnh là “leucocythemia” (tăng bạch cầu). Năm 1856, nhà sinh lý bệnh người Đức Virchow đã dùng kính hiển vi quang học để soi tiêu bản máu bệnh nhân và ông đã thấy bạch cầu ở những bệnh nhân này tăng rất cao làm máu trắng như sữa. Virchow gọi bệnh này là “leukemia” (theo tiếng Hy lạp là bệnh máu trắng) hay tiếng Việt gọi là Lơ xê mi, tên gọi này được sử dụng cho đến hiện nay. Năm 1877, nhờ vào phát minh nhuộm tiêu bản máu, Ehrlich đã phân biệt được những dạng khác nhau của bạch cầu. Năm 1889, Ebstein đã dùng thuật ngữ “acute leukemia” (lơ xê mi cấp) để chỉ tình trạng bệnh tiến triển cấp tính. Năm 1900, Naegeli đã chia lơ xê mi cấp thành dòng tủy và dòng lympho. Schilling đã phát hiện bệnh tổn thương đơn dòng mono năm 1913. Vào năm 1957, Gillestad đã mô tả bệnh lơ xê mi cấp tiền tủy bào lần đầu tiên. Đến nay, bằng các phương pháp hình thái học và hóa học tế bào, miễn dịch, di truyền chúng ta đã hiểu rõ và có cái nhìn cụ thể về bệnh lơ xê mi cấp. 1.2. CƠ CHẾ BỆNH SINH LƠ XÊ MI CẤP 1.2.1. Sinh tế bào máu bình thường và LXMc Bằng các nghiên cứu thực nghiệm in vivo và nuôi cấy tế bào in vitro, người ta phát hiện rằng tạo máu là một quá trình tăng sinh và biệt hóa, bắt nguồn từ tế bào gốc vạn năng tạo ra các tế bào máu đa năng rồi tới tế bào máu đầu dòng cho từng dòng [5]. Tế bào gốc được biệt hóa theo dòng nào là do 3 nhu cầu của cơ thể thông qua cơ chế điều khiển ngược mà đích tác động cuối cùng là gen có vai trò trong biệt hóa. Khi có rối loạn một khâu nào trong dây chuyền này sẽ dẫn đến sự tăng sinh không kiểm soát được của tế bào, hoặc làm tế bào ngừng trưởng thành nhưng vẫn phân chia và dẫn đến LXMc [6]. 1.2.2. Sự liên quan giữa hệ thống gen trong tế bào với ung thư Có hai hệ thống gen với các chức năng khác nhau, cùng phối hợp để kiểm soát sự tăng sinh ác tính, duy trì quá trình sống bình thường của tế bào và cơ thể:  Các tiền gen sinh ung thư (proto - oncogene): Là các gen có vai trò trong quá trình tăng sinh và biệt hoá tế bào. Sự ổn định tương đối về cấu trúc và chức năng của các gen này giúp tế bào phát triển bình thường. Ngược lại, khi có rối loạn cấu trúc đáng kể như bị tái tổ hợp với retrovirus thì nó sẽ chuyển thành gen ung thư (oncogene) và sinh ra một protein ung thư, tác động lên chính bộ máy phân bào và tạo ra các đặc tính ác tính [6].  Các gen ức chế khối u (anti - oncogene): Có vai trò ức chế sự phát triển của khối u. Sự đột biến, sắp xếp lại hoặc chuyển đoạn làm bất hoạt các gen này, mất khả năng ức chế sự tăng sinh ác tính [7]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các gen này thường đóng vai trò trong sự tiến triển của bệnh từ âm ỉ trở thành toàn phát. Sự hoạt hoá proto - oncogene và bất hoạt anti - oncogene làm cho tế bào tăng sinh dễ dàng và không bị kiểm soát, ngăn cản sự biệt hóa và ngăn cản quá trình tế bào chết theo chương trình dẫn đến các bệnh ác tính. Trong cơ thể, gen sinh ung thư và gen bình thường có thể tồn tại song hành, trong đó gen sinh ung thư là gen trội [8]. 1.2.3. Cơ chế tổn thương phân tử dẫn đến LXMc  Tổn thương gen truyền tín hiệu kích thích phát triển tế bào 4 Những gen này truyền tín hiệu kích thích phát triển tế bào thông qua receptor tyrosin kinase kích hoạt phosphoryn hóa làm cho tế bào tăng sinh. Do đột biến, gen này trở thành gen ung thư làm thay đổi hình thể protein dẫn đến thay đổi chức năng của chúng. Một số gen hoạt động theo con đường này là BCR-ABL, c-Kit, FLT3. Gen này có vai trò trong sự tiến triển thành LXMc chứ không có vai trò trong biến đổi ác tính tiên phát [6].  Tổn thương các gen hoạt hóa sự sao chép Các gen Ig lymphocyte B và gen receptor lymphocyte T: khi các tế bào T và B chưa trưởng thành, thường có hiện tượng xoắn hai chuỗi đơn của ADN lại để tạo ra các protein đa dạng, có khả năng gắn với các protein lạ (các Ig và các receptor tế bào T). Quá trình này dễ bị sai lạc và nếu sai lạc xảy ra ở các proto - oncogene thì có thể dẫn đến tăng sinh ác tính [8].  Tổn thương gen liên quan đến quá trình tế bào chết theo chương trình Nhiều loại tế bào được lập trình trước bởi các gen đặc biệt để biệt hóa rồi chết sau đó qua một thời gian sống nhất định. Khi các gen này bị tổn thương, tế bào tiếp tục được sinh ra nhưng không già và chết đi như bình thường đã lập trình trước, nên sẽ ứ đọng lại và gây mất cân bằng. Hai gen tổng hợp protein tyrosin kinase và protein P53 tác động theo cơ chế này [6], [8].  Hoạt hóa oncogene ở bệnh máu ác tính Có nhiều mối liên quan rõ ràng giữa sự hoạt hóa các oncogene hoặc sự bất hoạt các anti-oncogene với sự tăng sinh và biệt hóa tế bào. Nếu chỉ có sự hoạt hóa của một oncogene thì chưa đủ điều kiện dẫn tới chuyển dạng ác tính. Cần có sự phối hợp của nhiều oncogen hoặc sự biến đổi anti-oncogene mới làm các tế bào bình thường chuyển thành ác tính. Cơ chế chuyển dạng ác tính gồm 4 dạng chính sau [9]:  Chuyển đoạn và cấu trúc lại NST: 5 Chuyển một đoạn của NST này tới NST khác tạo nên sự sắp xếp mới, tạo ra gen lai mới, phiên mã một protein mới có hoạt tính tăng sinh tế bào.  Đột biến điểm: Là những bất thường do thay đổi thành phần hoặc số lượng các nucleotid trên ADN gồm các dạng thêm bớt, thay thế hay đảo vị trí của một vài cặp nucleotid trên gen [10], [11].  Nhân gen: Có nhiều nghiên cứu cho thấy thừa NST số 8 sẽ thừa gen MYC và gây LXMc.  Virus ARN, ADN gây ung thư Khác với virus gây bệnh nhiễm trùng khi vào tế bào sẽ nhân lên nhiều lần và phá vỡ tế bào tiếp tục chu kỳ mới, các virus gây ung thư tìm cách gắn bộ gen vào vị trí các oncogene làm cho các gen này hoạt động dẫn đến kích thích tế bào tăng sinh và gây bệnh ác tính [11].  Bất hoạt gen ức chế khối u Trong tế bào bình thường có những gen kiểm soát hiện tượng tăng sinh tế bào, đó là gen ức chế khối u. Khi những gen này bị mất hay bất hoạt, dẫn tới không kiểm soát, không kiềm chế được sự phân bào, gây ra khối u. Gen ức chế khối u hoạt động theo cơ chế điều khiển ngược. Khi tế bào phân chia quá mức sẽ tạo cơ chế feedback, chính các yếu tố phiên mã sẽ kích thích gen ức chế khối u để tạo ra một yếu tố ức chế lại yếu tố phiên mã. Trong trường hợp gen ức chế khối u bị mất vai trò, yếu tố phiên mã sẽ tự tác động làm tế bào phân chia quá mức và gây bệnh ác tính [12]. 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ XẾP LOẠI LXMc 1.3.1. Phương pháp hình thái học 6 Bằng phương pháp nhuộm giêmsa tiêu bản máu ngoại vi và tiêu bản tủy xương, dựa vào hình thái tế bào để xác định tỷ lệ tế bào blast, ngoài ra ta có thể nhận biết một số khác biệt giữa các dòng tế bào ác tính. 1.3.2. Phương pháp hóa học tế bào Từ những năm 1940 - 1970, các phát hiện về rối loạn chuyển hóa đặc trưng cho từng dòng tế bào đã được vận dụng để hình thành các phương pháp nhuộm hóa học tế bào, các phương pháp phổ biến hiện nay đang sử dụng cho xếp loại LXMc như: nhuộm Myeloperoxydase (MPO), Sudan đen, Periodic Acid - Schiff (PAS), Esterase không đặc hiệu có và không có ức chế bằng NaF, Esterase đặc hiệu [13], [14]. Kỹ thuật nhuộm MPO dựa trên nguyên lý là các tế bào hạt dòng tủy và mono có chứa men MPO có tác dụng oxy hóa các cơ chất như gốc phenol, một số acid thơm và acid amin. Các tế bào hạt dòng tủy cho phản ứng dương tính, dòng mono có thể dương tính ở mức độ thấp riêng dòng lympho thì hoàn toàn âm tính. Phương pháp nhuộm Sudan đen sử dụng Sudan đen là chất tan trong lipid nhằm phát hiện các hạt lipid trong tế bào. Kết quả nhuộm Sudan đen dòng bạch cầu hạt dương tính mạnh nhất, dòng mono dương tính ở các mức độ khác nhau còn dòng lympho thường âm tính. Trên cùng một tế bào thì mức độ dương tính của Sudan đen thường mạnh hơn MPO nhưng thường có sự song hành kết quả giữa hai phương pháp này [13]. Phương pháp nhuộm PAS là sử dụng Periodic Acid - Schiff để nhuộm glycogen, các tế bào máu có sự phân bố glycogen khác nhau trong bào tương. Nhuộm PAS cho kết quả thường âm tính với các tế bào dòng bạch cầu hạt và mono nhưng lại dương tính mạnh với dòng lympho [14]. Nhuộm Esterase không đặc hiệu được sử dụng trong chẩn đoán LXMc dòng mono vì các tế bào thuộc dòng mono cho phản ứng dương tính mạnh và bị 7 ức chế bởi NaF [14]. Phương pháp nhuộm Esterase đặc hiệu để phân biệt tế bào dòng mono và dòng bạch cầu hạt, dòng bạch cầu hạt sẽ cho phản ứng dương tính. Nhuộm Esterase đặc hiệu và không đặc hiệu đều âm tính với dòng lympho. 1.3.3. Phương pháp miễn dịch học Đây là phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện những dấu ấn trên bề mặt tế bào hoặc trong bào tương. Dấu ấn miễn dịch tế bào thay đổi tùy theo lứa tuổi và dòng tế bào. Hiện nay, có hai phương pháp đang sử dụng rộng rãi là phân loại miễn dịch trên kính hiển vi huỳnh quang và phân loại miễn dịch bằng máy đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry). Các tế bào LXMc thuộc dòng tủy sẽ phản ứng dương tính với các CD13, CD14, CD33, CD34, CD117. Các tế bào thuộc dòng lympho dương tính với CD3, CD7, CD10, CD19, CD20 [15], [16]. 1.3.4. Phương pháp di truyền tế bào Nghiên cứu bệnh sinh LXMc nhận thấy có liên quan đến tổn thương di truyền trong các tế bào gốc tạo máu làm tăng sinh và tích tụ các tế bào non gây lấn át các dòng tế bào tạo máu bình thường gây bệnh LXMc, biểu hiện tổn thương di truyền trong LXMc rất đa dạng bao gồm cả những bất thường về số lượng đến những bất thường về cấu trúc phân tử. Những bất thường NST và gen đặc trưng rất có ý nghĩa trong chẩn đoán thể bệnh, lựa chọn điều trị và tiên lượng. Một số bất thường NST và gen hay gặp trong bệnh LXMc dòng tủy là t(15;17), t(8;21), t(9;22), inv(16), del(7), đột biến gen NPM1, FLT3, CEBPA. Trong LXMc dòng lympho hay những bất thường NST và gen là NST Philadelphia, đột biến gen ABL/BCR, MLL/AF4 [17], [18]. 1.3.5. Xếp loại LXMc  Xếp loại LXMc theo FAB 1986 có bổ sung Xếp loại LXMc theo FAB năm 1986 được dựa vào hình thái học tế bào, hóa học tế bào và dấu ấn miễn dịch. 8 LXMc được chia làm 2 nhóm bệnh là LXMc dòng tủy và LXMc dòng lympho. LXMc dòng lympho có 3 thể: L1, L2, L3; dòng tủy có 8 thể từ M0 đến M7. Bảng 1.1: Xếp loại LXMc dòng tủy theo FAB có bổ sung Thể Đặc điểm hình thái, hóa học tế bào Dấu ấn miễn dịch Tế bào non chưa biệt hóa ≥ 90% các tế bào M0 có nhân không thuộc dòng hồng cầu, CD34+ không có thể Auer, < 3% MPO+ Tế bào non chưa biệt hóa ≥ 90% các tế bào M1 có nhân không thuộc dòng hồng cầu, hiếm HLA-DR, CD13, CD33, CD15, CD11± thể Auer, > 3% MPO+ Tế bào non chưa biệt hóa < 90% các tế bào M2 có nhân không thuộc dòng hồng cầu, nhiều thể Auer M3 LXMc tiền tủy bào, tế bào blast > 30% Dưới nhóm : M3v LXMc dòng tủy – mono M4 Dưới nhóm: M4eo tăng tế nào non bất thường dòng bạch cầu ưa acid LXMc dòng mono, các tế bào thuộc dòng M5 mono chiếm > 80% các tế bào trong tủy HLA-DR, CD13, CD33, CD15, CD11± CD33, CD13, CD15, CD11 HLA-DR, CD34±, CD33, CD15±, CD14, CD64, CD11 HLA-DR, CD34±, CD33, CD15±, CD14, CD64, CD11 ≥ 50% là các tiền thân hồng cầu, blast dòng M6 tủy ≥ 30% các tế bào có nhân không thuộc Glycophorin A dòng hồng cầu M7 ≥ 30% tế bào tiền thân dòng mẫu tiểu cầu * Xếp loại LXMc theo WHO 2008 HLA-DR, CD61, CD42, CD34±, CD33±