Tài liệu Nghiên cứu biến thể gen adh1b ở bệnh nhân bị bệnh xơ gan do sử dụng rượu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ---------------------- NGUYỄN THẾ KIÊN NGHIÊN CỨU BIẾN THỂ GEN ADH1B Ở BỆNH NHÂN BỊ BỆNH XƠ GAN DO SỬ DỤNG RƢỢU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN, 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ---------------------- NGUYỄN THẾ KIÊN NGHIÊN CỨU BIẾN THỂ GEN ADH1B Ở BỆNH NHÂN BỊ BỆNH XƠ GAN DO SỬ DỤNG RƢỢU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Hoàng Thị Thu Yến Trƣờng Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên THÁI NGUYÊN, 2022 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Thị Thu Yến, Khoa Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Thái Nguyên đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Khoa học Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo, cán bộ trong Khoa Công nghệ sinh học, đặc biệt là sự quan tâm, giúp đỡ của các anh chị thuật viên ph ng th nghiệm Khoa đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn thạc sĩ. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tôi hoàn thành luận văn này. Trong quá trình làm luận văn hông tránh hỏi những sai sót, tôi mong nhận đƣợc sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi hoàn thành bản luận văn. Thái Nguyên, ngày ..... tháng 8 năm 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây à công tr nh nghiên cứu của tôi thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Hoàng Thị Thu Yến. Mọi tr ch dẫn trong uận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số iệu, ết quả nghiên cứu trong uận văn à trung thực và chƣa từng ai công bố trong một công tr nh nào hác. Thái Nguyên, ngày ..... tháng 8 năm 2022 Tác giả Nguyễn Thế Kiên ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề.......................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. Tình hình sử dụng đồ uống có ethanol ........................................................... 3 1.1.1. Tình hình sử dụng đồ uống có ethanol trên thế giới ............................ 3 1.1.2. Tình hình sử dụng đồ uống có ethanol t i Việt Nam ........................... 3 1.2. Chuyển hóa ethano và ảnh hƣởng đến sức hỏe con ngƣời ......................... 5 1.2.1. Chuyển hoá ethanol ở người ................................................................. 5 1.2.2. Ảnh hưởng của ethanol đến sức khoẻ con người .................................. 8 1.3. Mối liên quan của đa h nh rs1229984 gen ADH1B với bênh xơ gan .......... 10 1.3.1. Đa hình rs1229984 gen ADH1B ......................................................... 10 1.3.2. Tình hình nghiên cứu đa hình rs1229984 gen ADH1B ...................... 12 1.3.3. Mối liên quan của đa hình rs1229984 gen ADH1B với bệnh xơ gan . 13 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15 2.1. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu ................................................................. 15 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 15 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 15 2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ........................................................................ 16 2.2.1. Hóa chất .............................................................................................. 16 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ.................................................................................. 16 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu................................................................ 17 2.4. Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................... 17 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 18 2.5.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu .................................................. 18 2.5.2. Điện di DNA tổng số trên gel agarose ................................................ 20 2.5.3. Xác định nồng độ DNA và độ tinh s ch .............................................. 20 iii 2.5.4. PCR khuếch đ i vùng gen đích ........................................................... 21 2.5.5. Tinh s ch sản phẩm PCR .................................................................... 22 2.5.6. Giải trình tự Sanger ............................................................................ 23 2.5.7. Phân tích kết quả và xử lý số liệu ....................................................... 23 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 24 3.1. Nghiên cứu đặc điểm đa hình rs1229984 gen ADH1B của ngƣời việt nam sinh sống tại thái nguyên ..................................................................................... 24 3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số .......................................................... 24 3.1.2. Kết quả khuếch đ i và xác định trình tự đo n gen ADH1B ............... 25 3.1.3. Tần số iểu gen tần số alen đa hình rs1229984 gen ADH1B ............ 26 3.1.4. Đa hình rs1229984 gen ADH1B ở người Việt Nam và mối liên quan đến nguy cơ nghiện rượu và các bệnh do rượu ............................................ 27 3.2. Nghiên cứu mối liên quan của đa h nh RS1229984 gen ADH1B ở ngƣời lạm dụng rƣợu ............................................................................................................ 28 3.2.1. Mô tả mẫu nghiên cứu......................................................................... 28 3.2.2. Xác định tần số kiểu gen, tần số alen đa hình rs1229984 gen ADH1B ở người l m dụng rượu ................................................................................. 29 3.2.3. So sánh tần số alen ADH1B*2 ở người l m dụng rượu với các nghiên cứu đã công bố trên thế giới ......................................................................... 30 3.3. Nghiên cứu mối liên quan của đa h nh rs1229984 gen ADH1B ở ngƣời lạm dụng rƣợu xơ gan ................................................................................................ 33 3.3.1. Xác định tần số kiểu gen, tần số alen đa hình rs1229984 gen ADH1B ở người l m dụng rượu xơ gan và hông xơ gan .......................................... 33 3.3.2. So sánh tần số alen ADH1B*2 ở người l m dụng rượu với các nghiên cứu đã công bố trên thế giới ......................................................................... 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 38 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 44 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Nghĩa tiếng Việt Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh ADH Enzyme chuyển hóa ethanol ADH alcohol dehydrogenase ADH1B Enzyme chuyển hóa ethanol ADH1B alcohol dehydrogenase 1B ALDH Enzyme chuyển hóa acetaldehyde ALDH aldehyde dehyrogenase ALDH2 Enzyme chuyển hóa acetaldehyde ALDH2 aldehyde dehyrogenase 2 Bp Cặp base Base pair DNA Axit Deoxynucleic Deoxyribonucleic acid Đtg đồng tác giả et al Kb Kilobase Kilobase = 1000 bp PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction Taq Vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus TAE TAE Tris Acetate EDTA WHO Tổ chức y tế thế giới World Health Organization v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Mô tả đa h nh rs1229984 gen ADH1B................................................ 12 Bảng 2.1. Thiết bị dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 17 Bảng 2.2: Danh sách trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu ....................... 22 Bảng 3.1. Tần số iểu gen và a en gen ADH1B từ nhóm mẫu nghiên cứu......... 26 Bảng 3.2. So sánh tần số alen ADH1B*2 ở ngƣời Việt Nam.............................. 27 Bảng 3.3. Đặc điểm về tuổi của nhóm mẫu lạm dụng rƣợu và đối chứng sử dụng trong nghiên cứu ................................................................................... 28 Bảng 3.4. Tần số kiểu gen, tần số a en đa h nh rs1229984 gen ADH1B ở nhóm ngƣời lạm dụng rƣợu và đối chứng....................................................... 29 Bảng 3.5. Mô tả và so sánh các nghiên cứu về đa h nh rs1229984 gen ADH1B ở ngƣời lạm dụng rƣợu và không lạm dụng rƣợu .................................... 32 Bảng 3.6. Đặc điểm về tuổi của nhóm mẫu lạm dụng rƣợu bị xơ gan và hông bị xơ gan .................................................................................................... 33 Bảng 3.7. Tần số kiểu gen, tần số a en đa h nh rs1229984 gen ADH1B ở nhóm ngƣời lạm dụng rƣợu bị xơ gan và hông bị xơ gan............................. 34 Bảng 3.8. Mô tả và so sánh các nghiên cứu về đa h nh rs1229984 gen ADH1B ở ngƣời lạm dụng rƣợu bị xơ gan và hông bị xơ gan............................. 36 vi DANH MỤC CÁC HÌNH H nh 1.1. Con đƣờng oxy hoá chuyển hoá ethanol ............................................... 6 Hình 1.2. Biểu đồ mức độ biểu hiện của gen ADH1B ở các mô khác nhau ....... 11 H nh 2.1. Sơ đồ thiết kế primer khuếch đại đoạn gen ADH1B ........................... 21 Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% ở nhóm ngƣời sinh sống tại Thái Nguyên ...................................................................... 24 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của đoạn gen ADH1B ở nhóm ngƣời sinh sống tại Thái Nguyên ...................................................................... 25 Hình 3.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen ADH1B ............................................... 26 vii MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Sử dụng rƣợu, bia thƣờng xuyên và iên tục đang à một vấn đề rất phổ biến trên toàn thế giới, lạm dụng rƣợu bia là yếu tố nguy cơ thứ 7 gây tử vong và bệnh tật ở ngƣời [36]. Sau khi đƣợc đƣa vào cơ thể, ethano có trong rƣợu, bia đƣợc đào thải chủ yếu qua chuyển hoá, phần nhỏ chỉ đƣợc bài tiết qua hơi thở (0,7%), nƣớc tiểu (0,3%) và mồ hôi (0,1%). Chuyển hoá ethanol có 2 con đƣờng ch nh: oxy hoá và hông oxy hoá. Ethano đƣợc chuyển hoá chủ yếu thông qua quá trình oxy hoá, quá tr nh này có sự tham gia của các enzyme nhƣ alcohol dehydrogenase (ADH), aldehyde dehydrogenase (ALDH), cytochrom 450 và catalase. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, ethano đƣợc oxy hoá chủ yếu ở gan [5], [21], [32], [44]. Cơ thể ngƣời có 7 gen mã hoá ADH nằm trên nhiễm sắc thể số 4, trong số đó, ADH1B mã hoá enzyme có vai trò chính trong chuyển hoá rƣợu tại gan. Trƣớc tiên, các ADH chuyển hoá rƣợu thành acetaldehyde, một chất có độc t nh cao và đƣợc gọi là chất gây ung thƣ. Sau đó, aceta dehyde bị ALDH phân hủy thành một hợp chất t độc hơn. Aceta dehyde đƣợc cho rằng có liên quan đến cơ chế hình thành bệnh gan do rƣợu. Sự tích tụ acetaldehyde trong gan sau khi uống rƣợu mãn t nh đƣợc xác định bởi tốc độ hình thành và loại bỏ nó, đƣợc xúc tác bởi ADH, ALDH và một số enzyme khác. Nghiên cứu ở những ngƣời song sinh cho thấy, cơ sở di truyền cho sự khác biệt giữa các cá nhân về tính nhạy cảm với bệnh xơ gan do rƣợu [26], t nh đa h nh di truyền của các enzym iên quan đến quá tr nh oxy hoá ethano thành acetate đã đƣợc biết đến [19], [43]. Các biến thể của ADH và các enzyme chuyển hoá ethanol thành aceta dehyde nhanh hơn và có thể dẫn đến việc tăng t ch tụ acetaldehyde trong gan sau khi uống rƣợu. Do đó, những ngƣời có các isozyme này có thể dễ bị xơ gan do rƣợu hơn hoặc đƣợc bảo vệ chống lại sự phát triển của chứng nghiện rƣợu [7], [18]. 1 Theo Lƣu B ch Ngọc và đtg (2018) cho thấy ngƣời Việt Nam sử dụng rƣợu, bia ở mức nghiện hoặc nghiện nặng à tƣơng đối cao, chiếm 8% hi điều tra phỏng vấn 5.200 ngƣời ở 12 tỉnh/thành phố đại diện cho các vùng của cá thể ngƣời Kinh sinh sống tại thành phố Hồ Ch Minh đƣợc giải mã từ dự án 1000 genome ngƣời cho rằng alen ADH1B*2 gen ADH1B đa h nh rs1229984 có hoạt tính chuyển hoá ethanol mạnh chiếm tỷ lệ cao 66,6% [14]. V ý do đó, có thể thấy rằng ngƣời Việt Nam có thể có nguy cơ t ch u acetaldehyde cao là nguyên nhân dẫn đến bệnh gan do rƣợu. Đến nay, các nghiên cứu về đa h nh gen iên quan đến chuyển hoá ethano có trong rƣợu ở ngƣời Việt Nam khoẻ mạnh cũng nhƣ mắc bệnh liên quan còn hạn chế. Xuất phát từ các cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu biến thể gen ADH1B ở bệnh nhân xơ gan nhằm nghiên cứu mối liên quan của đa h nh này. 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm tần số kiểu gen, tần số a en đa h nh rs1229984 gen ADH1B ở ngƣời lạm dụng rƣợu, ngƣời lạm dụng rƣợu mắc bệnh xơ gan và hông xơ gan góp phần làm sáng tỏ mối liên quan của đa h nh đối với thói quen uống rƣợu dẫn đến lạm dụng rƣợu và bệnh xơ gan đƣợc chẩn đoán do rƣợu. 3. Nội dung nghiên cứu  Nghiên cứu hảo sát đặc điểm tần số iểu gen, tần số a en đa h nh rs1229984 gen ADH1B ở ngƣời Việt Nam sinh sống ở Thái Nguyên;  Nghiên cứu mối iên quan của tần số iểu gen, tần số a en đa h nh rs1229984 gen ADH1B với thói quen uống rƣợu ở nhóm ngƣời Việt Nam ạm dụng rƣợu đƣợc thu thập tại Bệnh viện đa hoa Trung Ƣơng Thái Nguyên;  Nghiên cứu mối iên quan của tần số iểu gen, tần số a en đa h nh rs1229984 gen ADH1B ở nhóm ngƣời Việt Nam ạm dụng rƣợu mắc bệnh xơ đƣợc thu thập tại Bệnh viện đa hoa Trung Ƣơng Thái Nguyên; 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình sử dụng đồ uống có ethanol 1.1.1. Tình hình sử dụng đồ uống có ethanol trên thế giới Việc chƣng cất các loại đồ uống chứa ethanol có truyền thống âu đời ở Châu Á, châu Âu, hởi nguồn từ Viễn Đông và chuyển đến châu Âu qua Ả Rập khoảng một thiên niên kỷ trƣớc [41]. Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,3 tỷ ngƣời đang sử dụng rƣợu, bia. Ngày 21/9/2018, tổ chức y tế thế giới (World Health Organization – WHO) đã công bố số iệu về vấn đề sử dụng rƣợu bia trên toàn thế giới, có đến 27% trẻ vị thành niên (15 - 19 tuổi) đang sử dụng rƣợu, bia, đứng đầu là Châu Âu (44%), thứ 2 là Châu M và Tây Thái B nh Dƣơng (38%). Qua khảo sát ở nhóm ngƣời uống rƣợu trƣớc 15 tuổi cho thấy, không có sự chênh ệch đáng ể giữa nam và nữ trong độ tuổi này. Trong hi đó, năm 2016 có hơn 3 triệu ngƣời đã chết do tác hại bia, rƣợu, có nghĩa à cứ 20 ngƣời chết thì 1 ngƣời trong số đó tử vong vì tác hại của rƣợu, bia, hơn 3/4 số ca tử vong là nam giới. Lạm dụng rƣợu, bia ở mức có hại gây ra hơn 5% gánh nặng bệnh tật trên toàn cầu. Các nƣớc có thu nhập cao đồng nghĩa với đồ uống có ethano đƣợc phổ biến hơn. 1.1.2. Tình hình sử dụng đồ uống có ethanol t i Việt Nam Ở nƣớc ta, rƣợu đã trở thành một nét văn hoá ẩm thực hông thể thiếu trong đời sống, đƣợc dùng trong các cuộc gặp mặt, đàm đạo tri kỉ… chúc tụng thể hiện t nh cảm, tôn trọng nhau, chén rƣợu nhƣ lời chào, lời mời đối với khách, chủ nhân của bữa tiệc chỉ uống hoảng 03 chén rƣợu là dừng. Sử dụng rƣợu, bia ở 1 mức độ hợp lý có thể đem ại cho con ngƣời cảm giác hƣng phấn, hoan hoái, ƣu thông huyết mạch... Tuy nhiên, nét đẹp khi uống rƣợu của ngƣời xƣa tới bây giờ hầu nhƣ đã hông c n đƣợc ƣu giữ, thay vào đó à một văn hoá uống rƣợu, bia thái quá, xô bồ, gây ra nhiều tác hại, tổn thất cho bản thân ngƣời uống, gia đ nh, tổ chức và toàn xã hội. Ở Việt Nam, xu hƣớng sử dụng rƣợu, bia trong sinh hoạt hàng ngày, trong những dịp lễ hội, trong quan hệ 3 công việc... đang càng ngày gia tăng. Thậm chí Việt Nam c n vƣơn ên đứng thứ 2 về tốc độ sử dụng rƣợu, bia của Đông Nam Á, chỉ sau Thái Lan. Theo số iệu thống ê của năm 2010, 70% nam và 6% nữ giới trên 15 tuổi có uống rƣợu, bia. 5 năm sau (năm 2015) con số này tăng ên tƣơng ứng là 80,3% ở nam giới và 11,6% ở nữ giới, trong đó có 44,2% nam giới uống rƣợu, bia ở mức nguy hại (tức là uống từ 6 cốc bia/ i rƣợu trở lên trong 1 lần uống). Nếu quy đổi rƣợu, bia ra lít ethanol nguyên chất thì mức tiêu thụ b nh quân đầu ngƣời Việt Nam (trên 15 tuổi) à 8,3 t/năm theo số liệu ƣớc t nh năm 2016 của Tổ chức Y tế thế giới, đứng vị tr 64/194 nƣớc, trong khi mức tiêu thụ trên toàn cầu tăng hông đáng ể. Chỉ trong 5 năm (2011-2015), tỷ lệ sử dụng rƣợu, bia ở nam giới (độ tuổi từ 25 - 64 tuổi) đã tăng từ 69,6% lên 80,3% và ở nữ giới là từ 5,6% lên 11,2%. Trong số nam giới sử dụng rƣợu, bia năm 2015, có 44,2% sử dụng rƣợu, bia ở mức nguy hại và 47,9% điều khiển phƣơng tiện cơ giới sau khi sử dụng rƣợu, bia. Ở tuổi vị thành niên (từ 13 - 17 tuổi), có 1/3 nam giới (33,2%) và gần 1/5 nữ giới (17,6%) có sử dụng rƣợu, bia. Trong số đó, một nửa số em nam và một phần ba số em nữ uống lần đầu trƣớc 14 tuổi. Tỷ lệ ngƣời trƣởng thành (từ 25 - 64 tuổi) có uống rƣợu, bia tính theo tháng (2010-2015). Tỷ lệ tiêu thụ số lít ethanol nguyên chất/ngƣời/năm Việt Nam ở mức rất cao, xếp thứ hai trong các nƣớc Đông Nam Á/Tây Thái B nh Dƣơng; xếp thứ 10 châu Á (sau Hàn Quốc, Ấn Độ, Nepa , Thái Lan…) và thứ 29 thế giới. Số ƣợng bia, rƣợu đƣợc bán ra năm 2017 ên tới 4 tỷ t, tăng 10,4% so với năm 2016. Bình quân mỗi ngƣời dân sử dụng 42 t bia/năm. Chi ph cho sử dụng bia của Việt Nam khoảng 3,4 tỷ USD/năm, gần 3% số thu ngân sách của cả nƣớc, trung b nh hơn 300USD ngƣời/năm. Từ năm 2003 - 2005, mức độ sử dụng số ethano trung b nh 3,8 t/năm nhƣng đến năm 2005 - 2008 đã tăng gấp đôi à 6,6 t. Trong hi đó, thế giới tăng rất chậm, chỉ từ 6,1 ên 6,2% giai đoạn 15 năm. Có thể vào năm 2025, mức độ sử dụng ethanol của Việt Nam tăng ên khoảng 7 t/năm, nhƣng thực tế, WHO cho biết, Việt Nam sẽ phải chạm mốc 4 8,6 t ethano /năm. Đây à con số đáng báo động về thực trạng sử dụng rƣợu, bia tại Việt Nam. Bên cạnh đó, từ cuộc điều tra khảo sát của Lƣu B ch Ngọc và đồng tác giả (2018) đã cho thấy ết quả của thực trạng sử dụng rƣợu, bia ở Việt Nam. Kết quả điều tra, phỏng vấn 5.200 ngƣời ở 12 tỉnh/thành phố đại diện cho các vùng của cả nƣớc cho thấy, rƣợu tự nấu thủ công nhƣ: rƣợu gạo, rƣợu ngô hay rƣợu nấu từ các loại nguyên liệu khác... là loại đồ uống có ethano đƣợc “yêu th ch” của ngƣời Việt Nam, tỷ ệ ên tới 78,4% ngƣời thƣờng xuyên sử dụng loại đồ uống này. Tỷ lệ nam giới sử dụng rƣợu nấu thủ công lên tới 85,6% trong khi tỷ lệ này ở nữ giới chiếm 51,5%. Xếp thứ 2 đồ uống đƣợc ƣa th ch sử dụng là bia. Trong tổng số những ngƣời đang sử dụng rƣợu, bia có 68,7% hiện đang uống bia (67,1% à nam giới và 74,7% à phụ nữ). Nhóm nghiên cứu cho rằng, phƣơng thức sử dụng đồ uống có ethanol của ngƣời dân Việt Nam có nhiều điểm đáng o ngại. Ngoài ra, kết quả phân tích số liệu điều tra cho thấy trong số 60% dân số hiện có sử dụng đồ uống có ethanol, trung bình một ngày một ngƣời đã tiêu thụ 14,7g ethanol nguyên chất, mặc dù con số trung vị chỉ là 3,7g. Đánh giá về sức khoẻ tinh thần cảm nhận, quan niệm uống rƣợu, bia giúp giải toả căng thẳng thần kinh vẫn là phổ biến [1]. Sử dụng đồ uống có ethano đƣợc các cơ quan y tế coi là yếu tố ảnh hƣớng đối với sức khoẻ của ngƣời sử dụng, khi sử dụng tới mức độ lạm dụng trong một thời gian dài. 1.2. Chuyển h a ethano v ảnh hƣởng đến sức h e con ngƣời 1.2.1. Chuyển hoá ethanol ở người Sau khi vào cơ thể, ethanol sẽ đƣợc khuếch tán thụ động từ dạ dày xuống ruột non, đi vào tĩnh mạch rồi tới gan, v là một chất độc hại nên sẽ đƣợc cơ thể đào thải ngay. Tốc độ đào thải đƣợc phụ thuộc vào một vài yếu tố, cả di truyền và môi trƣờng nhƣ: giới tính, tuổi tác, chủng tộc, thực phẩm, thuốc, mức độ uống... Đào thải ethanol xảy ra chủ yếu thông qua quá trình chuyển hoá, một phần nhỏ sẽ đƣợc bài tiết qua hơi thở (0,7%), nƣớc tiểu (0,3%) và mồ hôi 5 (0,1%). Nói chung, ethano đƣợc chuyển hoá theo hai con đƣờng: oxy hoá và hông oxy hoá. Con đƣờng oxy hoá với sự tham gia của các enzyme: alcohol dehydrogenase (ADH), aldehyd dehydrogenase (ALDH), cytochrom P450 và catalase (hình 1.1) và các con đƣờng không oxy hoá với sự tham gia của phospholipase và fatty acid ethyl ester (FAEE) synthase [5], [44]. Hình 1.1. Con đƣờng oxy hoá chuyển hoá ethanol [32] Chuyển hoá ethanol xảy ra chủ yếu qua quá trình oxy hoá, bị chi phối trực tiếp bởi đặc tính xúc tác của các enzyme: ADH, cytochrom P450 và catalase. Trong đó, ADH có chức năng oxy hoá ethano nội sinh đƣợc tạo ra bởi các vi sinh vật đƣờng ruột, oxy hoá ethanol ngoại sinh và các ethano hác đƣợc tiêu thụ trong chế độ ăn uống [5]. Ngoài ADH, c n có cytochrom P450 và catalase tham gia chuyển hóa 1 phần nhỏ ethano . Cytochrom P450 là một họ enzyme chứa sắt iên quan đến quá trình oxy hoá ethanol, steroid, axit béo... Cytochrom P450 có nồng độ ớn ở gan, nơi có mặt chủ yếu à ở mạng ƣới nội chất (microsome), một số cytochrom P450 đƣợc tìm thấy trong ty thể. Có nhiều isoform của cytochrom P450, hơn 100 họ gen đã đƣợc xác định. CYP2E1 là một cytochrom P450 có hoạt tính cao nhất trong chuyển hoá ethano , đƣợc cảm ứng khi uống đồ uống có ethanol ở giai đoạn mãn tính và có thể đóng vai tr quan trọng trong chuyển hoá ethanol. Ở nồng độ ethanol thấp, CYP2E1 có thể chuyển hoá khoảng 10% ethanol ở gan. Cata ase cũng chứa sắt đƣợc tìm thấy trong thể peroxisome của tế bào gan và não bộ, enzyme này chuyển hoá ethnaol và kèm 6 theo chức năng chống oxy hoá quan trọng v nó thƣờng xúc tác loại bỏ H2O2. Con đƣờng chuyển hoá ethanol với sự tham gia của catalase bị giới hạn bởi tỷ lệ tạo H2O2 khá thấp trong điều kiện tế bào sinh ý b nh thƣờng và dƣờng nhƣ có vai tr hông đáng ể trong quá trình oxy hoá ethanol ở gan [36]. Con đƣờng oxy hoá và hông oxy hoá ethano có iên quan đến nhau. Ức chế quá trình oxy hoá ethanol bằng các hợp chất ức chế ADH, CYP2E1 và catalase dẫn đến sự gia tăng chuyển hoá hông oxy hoá ethano và àm tăng sản xuất FAEE ở gan và tuyến tụy. Ethano đƣợc chuyển hoá không có sự oxy hoá là rất nhỏ, nhƣng các sản phẩm của nó có thể có iên quan đến bệnh lý. Có hai con đƣờng chuyển hoá ethanol không có sự oxy hoá, con đƣờng thứ nhất dẫn đến sự hình thành các phân tử FAEE từ phản ứng của ethanol với các axit béo axit hữu cơ. FAEE tồn tại âu sau hi ethano đƣợc loại bỏ và có thể gây tổn thƣơng mô. Con đƣờng không có sự oxy hoá thứ hai yêu cầu enzyme phospholipase D (PLD), phá vỡ phospho ipids để tạo ra axit phosphatidic. Con đƣờng này là một quá trình quan trọng trong giao tiếp tế bào, PLD có hoạt tính chuyển hoá ethanol cao và phản ứng chuyển hoá xảy ra chủ yếu ở nồng độ ethanol cao. Sản phẩm của phản ứng này, phosphatidy ethano đƣợc chuyển hoá kém và có thể tích lu nhiều sau khi hấp thụ một ƣợng lớn ethano , nhƣng tác dụng của nó đối với tế bào vẫn cần đƣợc nghiên cứu thêm [44]. Nhiều nghiên cứu cho rằng, ethano đƣợc oxy hoá chủ yếu ở gan. Sản phẩm trung gian của quá tr nh oxy hoá ethano trong cơ thể là acetaldehyde (CH3CHO), một chất cực độc và đƣợc biết đến nhƣ chất gây ung thƣ. Tuy nhiên, aceta dehyde thƣờng có thời gian tồn tại ngắn, nó nhanh chóng đƣợc chuyển hoá thành một hợp chất t độc hơn à acetate (CH3COO) bởi aldehyd dehydrogenase (ALDH). Acetate sau đó đƣợc phân hủy thành carbon dioxide và nƣớc để loại bỏ dễ dàng [32]. 7 1.2.2. Ảnh hưởng của ethanol đến sức khoẻ con người Các con đƣờng chuyển hoá ethanol khác nhau đƣợc mô tả ở trên có nhiều hậu quả bất lợi góp phần gây tổn thƣơng mô và gây nên các bệnh thƣờng gặp ở ngƣời lạm dụng đồ uống có ethano . Ethano đƣợc chuyển hoá đầu tiên ở dạ dày, tuy nhiên, con đƣờng chính của quá trình chuyển hoá ethanol liên quan đến ADH và ALDH dẫn đến việc tạo ra NADH chủ yếu xảy ra ở gan. NADH sau đó bị oxy hoá bởi một loạt các phản ứng hoá học trong ty thể qua hệ thống vận chuyển điện tử của ty thể hoặc chuỗi hô hấp, cuối cùng dẫn đến việc chuyển electron sang oxy phân tử (O2), sau đó iên ết với các proton (H+) tạo ra nƣớc (H2O). Ngoài ra, ethanol còn gián tiếp àm tăng sử dụng oxy tế bào bằng cách kích hoạt các tế bào Kupffer trong gan và gây nên tình trạng thiếu oxy ảnh hƣởng đến các quá trình khác ở gan và tổn thƣơng gan. Quá trình oxy hoá ethanol tạo ra một môi trƣờng tế bào chất đƣợc khử mạnh trong các tế bào gan. Nói cách khác, những phản ứng chuyển hoá ethanol khiến các tế bào gan ở trạng thái đặc biệt dễ bị tổn thƣơng từ các sản phẩm phụ của quá trình chuyển hoá, chẳng hạn nhƣ các gốc tự do và acetaldehyde [44]. B nh thƣờng, các ALDH có hoạt t nh oxi hoá aceta dehyde vƣợt quá khả năng aceta dehyde đƣợc tạo ra từ các con đƣờng oxi hoá ethanol khác nhau. Do đó, ƣợng aceta dehyde ƣu thông à rất thấp. Sử dụng đồ uống có ethanol mãn tính làm giảm quá trình oxy hoá acetaldehyde, do hoạt động của ALDH giảm hoặc do chức năng ty thể bị suy yếu, dẫn đến ƣợng aceta dehyde tăng. Ngoài ra, hàm ƣợng aceta a dehyde c n tăng do sự phát sinh các biến thể của ALDH có hoạt tính thấp hoặc không có chức năng. Aceta dehyde có hả năng iên ết với các protein nhƣ enzyme, protein microsome và vi ống, nó cũng iên ết với chất dẫn truyền thần kinh góp phần vào phát triển hội chứng phụ thuộc và đồ uống có ethanol và liên kết với DNA hình thành nên các chất gây ung thƣ. Sự hình thành các liên kết với protein trong tế bào gan làm suy yếu sự bài tiết protein và đƣợc cho là nguyên nhân của sự mở rộng gan dẫn đến gan to. Ngoài ra, acetaldehyde 8 liên kết với protein (liên kết với ysine) đã đƣợc phát hiện trong màng sinh chất của tế bào gan và có thể gián tiếp góp phần gây tổn thƣơng gan v cơ thể nhận ra chúng à „ ạ‟ và do đó tạo ra kháng thể chống lại chúng. Sự tƣơng tác này phá hủy các tế bào gan, c n đƣợc gọi là nhiễm độc gan. Ngoài các tác dụng độc hại của nó, một số nhà nghiên cứu tin rằng acetaldehyde có thể là nguyên nhân của một số hành vi và sinh lý của ngƣời uống đồ uống có ethanol. Ví dụ, khi aceta dehyde đƣợc dùng cho động vật thí nghiệm, nó sẽ dẫn đến tình trạng rối loạn, suy giảm trí nhớ và buồn ngủ…[32], [44]. Acetate đƣợc tạo ra từ quá trình oxy hoá aceta dehyde đƣợc chuyển hoá thành acetyl CoA. NADH và acetate đƣợc cho à có iên quan đến sinh tổng hợp lipid và cholesterol trong ty thể của các mô ngoại biên và não dẫn đến sự phát triển của bệnh gan nhiễm mỡ nếu uống nhiều đồ uống có ethano , hơn 90% ngƣời nghiện đồ uống có ethanol mắc bệnh gan nhiễm mỡ, đây à giai đoạn đầu của tổn thƣơng gan sau hi uống mãn t nh, sau đó sẽ là viêm, apoptosis, xơ hoá và cuối cùng à xơ gan [44]. Acetaldehyde không phải là sản phẩm phụ gây ung thƣ duy nhất của quá trình chuyển hoá ethano . Khi ethano đƣợc chuyển hoá bởi CYP2E1, các phân tử có khả năng phản ứng cao chứa oxy hoặc các loại oxy phản ứng (reactive oxygen species - ROS) đƣợc tạo ra. ROS có thể làm hỏng protein và DNA hoặc tƣơng tác với các chất hác để tạo ra các hợp chất gây ung thƣ, điều này có thể gây nên các tổn thƣơng gan ở ngƣời nghiện đồ uống có ethanol (nghiện ethanol) và đóng vai tr quan trọng trong phát triển ung thƣ gan. Ngoài ra, CYP2E1 ch hoạt nhiều tiền chất gây ung thƣ có trong thuốc á. Do đó, sử dụng đồ uống có ethanol và hút thuốc á đồng thời àm tăng đáng ể ung thƣ thực quản và thanh quản. Một ƣợng nhỏ ethano đƣợc loại bỏ bằng tƣơng tác với các axit béo tạo thành các hợp chất FAEE, các hợp chất này đƣợc chứng minh là góp phần gây tổn thƣơng cho gan và tuyến tụy. Do vậy, uống nhiều đồ uống có ethanol có thể góp phần vào nguy cơ phát triển các bệnh nhƣ gan nhiễm mỡ, gan to, xơ gan… và các bệnh ung thƣ hác nhau nhƣ: ung thƣ gan, thanh quản, vòm họng, dạ dày, thực quản…[5], [9], [17], [28], [38]. 9 1.3. Mối liên quan của đa hình rs1229984 gen ADH1B với bênh xơ gan 1.3.1. Đa hình rs1229984 gen ADH1B ADH à enzyme có t nh đặc hiệu cơ chất rộng, đƣợc định vị trong tế bào chất của tế bào. Nhóm enzyme này đƣợc tìm thấy với số ƣợng cao nhất trong gan, tiếp theo à đƣờng tiêu hóa, thận, niêm mạc mũi, tinh hoàn và tử cung. Nhiều dạng ADH tồn tại trong gan ngƣời với các hoạt tính khác nhau. Cấu tạo ADH ở ngƣời bao gồm kẽm và hai tiểu đơn vị 40 kDa có thể giống hoặc khác nhau, hình thành từ sự liên kết của các tiểu đơn vị đƣợc mã hóa bởi bảy gen. Do đó, có hơn 20 isozyme ADH với hoạt tính chuyển hóa rƣợu khác nhau. Bảy gen mã hóa các ADH đều đƣợc định vị trên nhiễm sắc thể số 4 cánh dài, có kích thƣớc khoảng 370 kb. Các gen ADH1A, ADH1B và ADH1C mã hóa các enzyme có vai trò chính trong chuyển hóa rƣợu ở gan. Gen ADH4 biểu hiện ở gan, thận, phổi và giác mạc. Trong khi, gen ADH5 đƣợc biểu hiện ở hầu hết các mô. Đến nay, gen ADH6 đã đƣợc xác định biểu hiện ở gan và đƣờng tiêu hóa, nhƣng vẫn chƣa có dữ liệu nào công bố về chức năng của enzyme mã hóa từ gen này. Gen ADH7 chủ yếu đƣợc tìm thấy trong các tế bào nội mô, chẳng hạn nhƣ các tế bào lót thực quản và mô dạ dày, cũng nhƣ trong quá tr nh phát triển phôi. Ở ngƣời trƣởng thành, ADH7 có iên quan đến sự chuyển hóa rƣợu đầu tiên diễn ra trong các mô dạ dày, trƣớc hi rƣợu đƣợc đƣa đến gan qua tĩnh mạch [5], [32], [44]. ADH1B đƣợc cấu tạo từ tiểu đơn vị beta, là một thành viên của họ ADH I (ADH1A, ADH1B và ADH1C). Tại gan, ADH1B là gen ảnh hƣởng cao nhất trong con đƣờng chuyển hóa ethanol. Theo cơ sở dữ liệu NCBI, gen ADH1B biểu hiện ở 27 mô khác nhau ở ngƣời, biểu hiện mạnh nhất ở gan, tiếp theo là chất béo, phổi và biểu hiện ít ở các mô khác (hình 1.2). Vùng phiên mã của gen ADH1B có độ dài 16341bp, gồm 9 exon và 8 intron, mã hóa 375 amino acid (NG_011435.1). 10 Hình 1.2. Biểu đồ mức độ biểu hiện của gen ADH1B ở các mô khác nhau (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/125#gene-expression) Trong nhiều biến thể có trong gen ADH1B, ảnh hƣởng đến chức năng của ADH1B đã có 3 biến thể đƣợc nghiên cứu, đó à ADH1B*1, ADH1B*2 và ADH1B*3. ADH1B*1 mã hóa tiểu đơn vị β1 có arginine (Arg) tại vị trí 48 trong chuỗi polypeptide, alen này có hoạt tính chuyển hóa rƣợu thấp nhất trong 3 alen. ADH1B*2 mã hóa tiểu đơn vị β2, có histidine (His) ở vị trí 48, là enzyme có hoạt tính chuyển hóa ethanol mạnh hơn so với alen ADH1B*1. Đa h nh nuc eotide dẫn đến sự thay đổi amino acid ở vị tr 48 đƣợc mã hóa trong cơ sở dữ liệu NCBI là rs1229984 (bảng 1.1) [5], [14]. Cá thể có kiểu gen đồng hợp ADH1B*2/*2 có hoạt tính chuyển hóa ethano cao hơn 40 ần so với ADH1B*1/*1, kiểu gen dị hợp sẽ có hoạt tính hỗn hợp b nh đẳng của cả 2 alen từ cơ thể đồng hợp, ADH1B*3 mã hóa chuối β3 có cysteine (Cys) ở vị trí 370 [4]. Cơ thể có kiểu gen ADH1B*3/*3 có hoạt tính chuyển hóa ethanol gấp 3 lần so với ADH1B*1/*1. Các alen ADH1B*2 và ADH1B*3 mã hóa enzyme oxy hóa ethanol mạnh hơn so với alen ADH1B*1 dẫn đến sự tích tụ acetaldehyde sau khi uống rƣợu và các tác dụng phụ độc hại (đỏ mặt, nôn mửa) gây ức chế khi uống rƣợu, bia. Alen ADH1B*2 và ADH1B*3 c n đƣợc 11