Tài liệu Nghiên cứu bệnh gumboro trên gà tại một số tỉnh đồng bằng sông cửu long tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI Mã ngành: 62640102 TÊN NCS: NGÔ PHÚ CƯỜNG NGHIÊN CỨU BỆNH GUMBORO TRÊN GÀ TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Cần Thơ, 2019 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. TRẦN NGỌC BÍCH Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: ……………………………, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc …. giờ …. ngày …. tháng …. năm …. Phản biện 1: Phản biện 2: Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam. 1 DANH MỤC LIỆT KÊ CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 1. Ngô Phú Cường và Trần Ngọc Bích, 2018. Đặc điểm dịch tễ học bệnh Gumboro trên gà tại Đồng Bằng Sông Cửu Long. ISSN 1859-2333. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Tập 54(4B), trang 40 – 44 2. Ngô Phú Cường, Trần Ngọc Bích và Trần Trung Tín, 2018. Một số đặc điểm dịch tễ của bệnh Gumboro trên gà thả vườn tại 5 tỉnh thành thuộc vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. ISSN 1859 – 4581. Tạp chí Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, số 21(1), trang 64 – 69 3. Ngô Phú Cường, Lê Thị Kim Xuyến, Lê Thanh Hòa và Trần Ngọc Bích, 2018. Phân tích đặc điểm phân tử và phả hệ các chủng virus cường độc Gumboro (IBDI) phân lập năm 20172018 tại Bến Tre và Vĩnh Long. Hội Nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2018, trang 485 – 490. 4. Hội nghị khoa học Công Nghệ Sinh Học toàn quốc 2018 tại Hà Nội. 5. Hội thảo khoa học Công Nghệ - Thú Y năm 2018 tại Hải Dương. 2 Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án Trong nhiều năm qua, bệnh Gumboro là một trong những bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gà tại nhiều địa phương ở nước ta. Ngày nay, bệnh Gumboro có nhiều biến chủng khác nhau nhưng đều thuộc về serotype I và II, trong đó serotype I có mức độ độc lực và tính gây bệnh cao (OIE, 2008). Tại Việt Nam, bệnh Gumboro được chính thức phát hiện từ những năm 1980 dựa vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, dịch tễ học. Nhiều phân lập IBDV với kiểu gen khác nhau và kiểu hình đa dạng cùng tồn tại đã làm cho diễn biến của bệnh này trở nên phức tạp hơn và khó đạt được hiệu quả phòng chống bệnh bằng tiêm chủng vaccine (Nguyễn Bá Thành và ctv, 2007; Lê Thị Kim Xuyến và Lê Thanh Hòa, 2008; Hồ Thị Việt Thu, 2012a). Nghiên cứu của Hồ Thị Việt Thu (2012a), cho rằng bệnh Gumboro thường xảy ra ở các đàn không được tiêm vaccine (70,0%), kế đến là các gà chỉ được tiêm vaccine một lần (62,5%) và gà được tiêm vaccine 2 lần (28,6%). Tại Việt Nam nói chung và ĐBSCL nói riêng virus Gumboro rất đa dạng và phức tạp do chúng ta nhập khẩu con giống từ nhiều nước khác nhau trên thế giới. Ngoài ra, phân lập IBDV với kiểu gen khác nhau và kiểu hình đa dạng cùng tồn tại đã làm cho diễn biến của bệnh này trở nên phức tạp hơn và khó đạt được hiệu quả phòng chống bệnh bằng tiêm chủng vaccine. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu bệnh Gumboro trên gà tại một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định sự lưu hành của virus Gumboro trên gà nuôi ở quy mô trang trại, hộ gia đình tại ĐBSCL. Các yếu tố có liên quan như giống gà, lứa tuổi, số lần sử dụng vaccine, phương thức chăn nuôi, số gà chết,… và một số đặc điểm lâm sàng trên đàn gà nghi bệnh. - Xác định đặc tính di truyền của virus Gumboro được phân lập tại ĐBSCL. Tiến hành so sánh gen mã hóa vùng VP2 với ngân hàng gen, các chủng vaccine hiện có trên thị trường và xây dựng cây phả hệ của các mẫu virus thực địa. 3 - Khảo sát tỉ lệ đáp ứng miễn dịch và sự khác biệt đáp ứng miễn dịch của 3 loại vaccine Gumboro trên 2 giống (gà nòi Bến Tre và gà Lương Phượng). 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Bệnh Gumboro là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus gây ra trên gia cầm (chủ yếu ở gà và gà tây), được xem là một bệnh cổ điển của ngành chăn nuôi gà. Có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh, virus gây bệnh và vaccine phòng bệnh nhưng bệnh vẫn bùng phát. Sự suy giảm miễn dịch đã ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả phòng bệnh của nhiều chương trình phòng vaccine trên đàn gà và đồng thời làm tăng tính mẫn cảm của đàn gà đối với những căn nguyên gây bệnh cơ hội khác. Nhiều bằng chứng cho thấy đàn gà bị nhiễm IBDV có thể trở thành vật chủ lan truyền các virus gây bệnh khác (Phạm Hồng Sơn và ctv, 2012; Hồ Thị Việt Thu, 2012a). Các báo cáo gần đây cho thấy IBDV tiếp tục là một nguyên nhân hàng đầu gây ra những thiệt hại kinh tế đáng kể trong ngành công nghiệp gia cầm. Nhiều phân lập IBDV với kiểu gen khác nhau và kiểu hình đa dạng cùng tồn tại đã làm cho diễn biến của bệnh này trở nên phức tạp hơn và khó đạt được hiệu quả phòng chống bệnh bằng tiêm chủng vaccine (Nguyễn Bá Thành và ctv, 2007; Lê Thị Kim Xuyến và Lê Thanh Hòa, 2008; Hồ Thị Việt Thu, 2012a). Việc phòng chống IBDV hiệu quả sẽ góp phần nâng cao sức khỏe tổng thể đàn gà đồng thời làm giảm thiệt hại về kinh tế. Nghiên cứu tạo vaccine dựa trên trình tự nucleotide của hệ gen virus Gumboro phân lập tại thực địa đã được tiến hành trong và ngoài nước. Tuy nhiên, tại khu vực ĐBSCL cho đến thời điểm hiện tại thông tin về giải mã phân đoạn VP2 của virus Gumboro phân lập được còn nhiều hạn chế. Do vậy, việc giải trình tự nucleotide virus Gumboro phân lập được tại thực địa góp phần xác định mức độ độc lực, lựa chọn vaccine phù hợp giúp việc phòng bệnh Gumboro cho đàn gà góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm là cần thiết. 1.4 Điểm mới của đề tài Bằng việc thu thập các chủng virus gây bệnh Gumboro thực địa tại một số tỉnh/ thành vùng ĐBSCL, so sánh sự biến đổi về thành phần gen, tính 4 kháng nguyên và độc lực, nguồn gốc và mối quan hệ phả hệ của các chủng virus, sẽ giúp chúng ta có thể lựa chọn các chủng vaccine phù hợp để phòng bệnh một cách hiệu quả. Đồng thời, góp phần thiết lập một cơ sở khoa học chắc chắn cho việc phát triển chiến lược phòng bệnh IBD ở ĐBSCL nói riêng và bảo vệ sức khỏe đàn gà ở nước ta nói chung Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung, thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu tình hình bệnh Gumboro trên gà tại ĐBSCL. Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm di truyền virus Gumboro được phân lập tại ĐBSCL. Nội dung 3: Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của 3 loại vaccine Gumboro được lựa chọn từ kết quả ở nội dung 2 trên 2 giống gà nòi Bến Tre và gà Lương Phượng 2.1.2 Thời gian nghiên cứu: từ 10/2015 đến 10/2018 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành tại 6 tỉnh/ thành phố của ĐBSCL là Bến Tre, Hậu Giang, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Trà Vinh. Về chăn nuôi gia cầm, các địa phương này rất phát triển cả hai phương thức chăn nuôi là nuôi gà công nghiệp ở các trang trại lớn và gà thả vườn ở nông hộ. Các tỉnh này tương đối tiêu biểu cho chăn nuôi gia cầm ở các tỉnh ĐBSCL. Địa điểm lưu trữ và xét nghiệm mẫu bệnh phẩm, huyết thanh gà tại Bộ môn Thú y, Khoa Nông Nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ. Địa điểm thực hiện RT – PCR tại viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. Địa điểm phân tích trình tự gen VP2 của virus Gumboro thực địa tại công ty Macrogen Hàn Quốc. Địa điểm bố trí thí nghiệm khảo sát đáp ứng miễn dịch của 3 chủng vaccine Gumboro trên 2 giống gà (nòi Bến Tre và Lương Phượng) tại tỉnh Đồng Tháp. 2.2 Phương tiện nghiên cứu Dụng cụ: túi đựng mẫu, ống tiêm y tế 3 ml, bông gòn, găng tay, khẩu trang, ống nghiệm vô trùng, giá đựng ống nghiệm, thùng bảo quản lạnh, tybe nhựa đựng huyết thanh, micropipete, ống falcon, kéo, dao mổ, găng tay. Một số thiết bị quan trọng phục vụ công tác nghiên cứu gồm: tủ lạnh trữ mẫu, tủ -20oC, tủ -80oC, máy lắc mẫu, cân phân tích, máy quang phổ UV-VIS, máy ly tâm, máy PCR, bộ điện di một chiều, máy ghi nhận và phân tích kết quả điện di. 5 Bộ kit sử dụng cho ELISA trực tiếp là IBDV Ag Test của công ty Thời Đại Xanh xuất xứ từ Bỉ. Bộ kit sử dụng cho ELISA gián tiếp là IBDV Ab Test của công ty Thịnh Á. 2.2.3 Đối tượng nghiên cứu 2.2.3.1 Nội dung 1 - Tất cả đàn gà được nuôi tại các tỉnh/ thành phố Bến Tre, Hậu Giang, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Trà Vinh. - Số lượng mẫu điều tra: 131 đàn gà. 2.2.3.2 Nội dung 2 - Mẫu bệnh phẩm túi Fabricius đã được thu thập trên đàn gà nghi mắc bệnh Gumboro (nội dung 1). - Trình tự Nucleotide gen VP2 của virus Gumboro thu thập tại 6 tỉnh/thành phố Bến Tre, Hậu Giang, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Trà Vinh. 2.2.3.3 Nội dung 3 Gà thí nghiệm được nuôi tại hộ gia đình thuộc tỉnh Đồng Tháp. Giống gà nòi Bến Tre 1 ngày tuổi được mua tại lò ấp địa phương. Giống gà Lương Phượng 1 ngày tuổi được mua của Công ty TNHH Nông Nghiệp Trí Việt. Gà giống đã tiêm phòng bệnh Marek trước khi đóng thùng bán cho người chăn nuôi. Gà trong thí nghiệm được nuôi nhốt hoàn toàn, đảm bảo vệ sinh môi trường trong chăn nuôi, nguồn dinh dưỡng được đảm bảo, chăm sóc và tiêm phòng đúng theo quy định. 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nội dung 1 2.3.1.1 Phương pháp khảo sát hộ/trại chăn nuôi về tình hình dịch bệnh Gumboro trên gà Các giống gà khảo sát chủ yếu là Nòi lai, Tàu vàng, Bình Định, Lương Phượng theo 3 phương thức chăn nuôi chủ yếu là thả hoàn toàn, bán chăn thả và nhốt hoàn toàn (Bảng 2.1). Bảng 2.1: Số lượng đàn gà khảo sát tại các tỉnh ĐBSCL STT Tỉnh Số đàn 1 Bến Tre 26 2 Hậu Giang 15 3 Cần Thơ 14 4 Trà Vinh 19 5 Vĩnh Long 28 6 An Giang 29 Tổng 131 6 2.3.1.2 Phương pháp khảo sát một số đặc điểm triệu chứng và bệnh tích đặc trưng trên đàn gà nghi bệnh Thu thập thông tin: Khi được thông báo là có dịch bệnh xảy ra tiến hành ghi chép những thông tin liên quan đến đàn gà nghiên cứu thông qua phiếu khảo sát. Những gà được kết luận nghi mắc bệnh Gumboro là những gà có triệu chứng và bệnh tích như: gà ủ rũ, rút mỏ vào cánh, có khi gục sang một bên, thích nằm, mắt lim dim mỏi mệt và thường dồn về một góc chuồng, gà kém ăn hoặc bỏ ăn, uống nhiều nước, mất định hướng, đi phân trắng, loãng hoặc toàn nước có khi lẫn máu, túi Fabricius sưng hoặc xuất huyết, cơ ngực hoặc cơ đùi xuất huyết, … 2.3.1.3 Phương pháp xét nghiệm chuẩn đoán virus Gumboro Kiểm tra lâm sàng những đàn gà nghi bệnh Gumboro tiến hành lấy mẫu phân để xét nghiệm bằng kit IBDV Ag Test của công ty Thời Đại Xanh xuất xứ từ Bỉ. 2.3.2 Nội dung 2 2.3.2.1 Phương pháp xác định gen VP2 của virus Gumboro thu thập tại thực địa - Bước 1: Chọn và lấy mẫu - Bước 2: Chiết Tách ARN tổng số từ các mẫu được thu thập - Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng RT-PCR là: Mồi xuôi GVF: 5’ CAAACGATCGCAGCGATGACAAACCTGCAAGAT 3’ và mồi ngược GVR: 5’ GGCTTCAAAGACATAATTCGGGCC 3’. Khuếch đại đoạn gene của vùng "siêu biến đổi", cho độ dài khoảng 0.47 kb. - Bước 3: Chuyển c.DNA các mẫu ARN trên bằng bộ Kit của Themor - Bước 4: Thực hiện phản ứng PCR từ khuôn c. DNA - Bước 5: Điện di kiểm tra trên gel agarose 2%, ở 75V trong 50 phút để phân tích kết quả. Phương pháp điện di trên gel agarose để kiểm tra sự khuếch đại đoạn gene thành công. 2.3.2.2 Phương pháp giải trình tự Nucleotide gen VP2 và xác định độc lực của virus gây bệnh Gumboro Sau khi xác định gen VP2 của virus Gumboro thu thập tại thực địa, tiến hành chọn 10 mẫu virus Gumboro có chất lượng tốt, băng DNA sáng, đơn băng (đánh dấu ký hiệu đại diện cho từng tỉnh/ thành phố) để phân tích sự tương đồng di truyền gen VP2. Trình tự gen VP2 của virus Gumboro thực địa được giải trình tự tại công ty Macrogen Hàn Quốc. Các chuỗi nucleotide gen VP2 được sắp xếp so sánh bằng chương trình GENDOC2.7 (http://www.nrbsc.org/gfx/gendoc/). 7 2.3.2.3 Phương pháp so sánh và xây dựng cây phả hệ của các mẫu virus thực địa với ngân hàng gen (genbank) và các chủng vaccine sử dụng phổ biến tại ĐBSCL Truy cập vào Ngân hàng gen để thu nhận thông tin về các chủng virus Gumboro đã được công bố ở Việt Nam và thế giới, các chủng vaccine phổ biến tại ĐBSCL. Bảng 2.2: Danh sách các chủng virus Gumboro và vaccine trong ngân hàng gen sử dụng phân tích so sánh trong nghiên cứu Số đăng kí Năm Phân Ký hiệu *Nước phân TT Ngân hàng phân nhóm chủng lập gen lập độc lực FJ842498 Việt Nam vv 1 GTN 2003 Việt Nam vv 2 GHUT12 FJ842493 2003 3 GPT FJ842495 2002 Việt Nam vv 4 GT1ST DQ355815 2003 Việt Nam vv 5 GTG25 DQ355818 2003 Việt Nam vv 6 GTG FJ842499 2003 Việt Nam vv 7 HuN11 LM651367 Trung Quốc vv 8 YS07 FJ695138 2007 Trung Quốc vv 9 9109 AY462027 2001 Hoa Kỳ av 10 variantE AF133904 Hoa Kỳ av 11 GLS AY368653 Hoa Kỳ av 12 IM AY029166 Hoa Kỳ av 13 STC D00499 Hoa Kỳ av 14 Cu-1wt AF362747 Đức av 15 HN04 KC109816 Trung Quốc at 16 D78 AF499929 Luxembourg at 17 HZ2 AF321054 1997 Trung Quốc at 18 JD1 AF321055 1997 Trung Quốc at 2011 8 TT 19 Ký hiệu chủng 903-78 Số đăng kí Ngân hàng gen JQ411012 Năm phân lập 1978 Hungary Phân nhóm độc lực at *Nước phân lập AY332560 Hoa Kỳ av 21 IBD BLEN BUR-706 EU544156 Brazil at 22 Cevac EU544158 Hungary at 23 Georgia KF573194 Ấn Độ at 24 Nobilis AJ586966 Hà Lan av 20 vv: very virulent (siêu cường độc/độc lực rất cao); av: antigenic variant (biến đổi kháng nguyên/độc lực thay đổi) và at: attenuated (nhược độc) Trong quá trình điều tra khảo sát các loại vaccine dùng phổ biến tại hộ chăn nuôi là IBD Blen, Bur 706, Ceve Gumboro, Georgia, Nobilis, do đó vaccine được dùng trong nghiên cứu: - Vaccine 1: IBD BLEN của MERIAL – Mỹ - Vaccine 2: BUR 706 của MERIAL – Pháp - Vaccine 3: Cevac Gumboro L của Hungary - Vaccine 4: Georgia của Ấn Độ - Vaccine 5: Nobilis của MSD – Hà Lan 2.3.3 Nội dung 3 2.3.3.1 Phương pháp khảo sát đáp ứng miễn dịch của 3 loại vaccine Gumboro trên 2 giống gà nòi Bến Tre và Lương Phượng a. Chuồng trại thí nghiệm Chuồng nuôi gà là kiểu chuồng đất, diện tích 3,5 m2 được chuẩn bị trước khi thả giống. Nền chuồng được phủ một lớp cát dày khoảng 20 cm, lớp độn chuồng bằng trấu dày khoảng 15 – 20 cm, mái chuồng được làm bằng lá dừa nước, xung quanh chuồng được rào bằng lưới B40 kiên cố, có bạt che kín để tránh gió lùa, có hệ thống đèn máng ăn, máng uống cho gà. Chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi được sát trùng trước khi đưa gà vào thí nghiệm. b. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức và 3 lần lặp lại (Bảng 2.3). Mỗi đơn vị nghiệm thức nuôi 30 con gà/ nghiệm thức. Tại thời điểm 3 ngày tuổi tiến hành lấy máu tim để xét nghiệm kháng thể mẹ truyền, do đó số gà cần lấy máu là 60 con. Tiến hành 9 nuôi gà thí nghiệm và lấy máu tĩnh mạch cánh. Số gà cần thí nghiệm (4 NT x 2 giống x 3 lần lặp lại = 720 con gà). Bảng 2.3: Bố trí thí nghiệm Số gà dùng trong thí nghiệm (con) Số lần Giống gà lặp lại NT1 NT2 NT3 NT4 Gà nòi Bến Tre 3 lần 30 30 30 30 GàLương Phượng 3 lần 30 30 30 30 - NT1: nghiệm thức đối chứng (không tiêm vaccine) - NT2: IBD BLEN của MERIAL – Mỹ - NT3: Cevac Gumboro L của Hungary - NT4: Nobilis của MSD – Hà Lan 2.3.3.2 Phương pháp lấy máu để kiểm tra kháng thể Phương pháp lấy máu : khi gà được 3 ngày tuổi tiến hành lấy máu tim để kiểm tra kháng thể thụ động mẹ truyền. Sau đó, tiến hành tiêm vaccine cho gà vào lúc 7 và 28 ngày tuổi (Bảng 3.8). Tiến hành lấy mẫu máu ở tĩnh mạch cánh đối với gà sau khi tiêm vaccine lúc 21 và 42 ngày tuổi để kiểm tra hàm lượng kháng thể sau tiêm phòng. Mỗi nghiệm thức lấy máu 20 gà (10 gà Nòi Bến Tre, 10 gà Lương Phượng) với 3 lần lặp lại nên số gà cần lấy máu ở mỗi nghiệm thức là 60 con. Mỗi con lấy khoảng 0,5 ml máu cho vào ống nghiệm vô trùng ghi lại ký hiệu của gà thí nghiệm. Đặt ống nghiệm nằm nghiêng cho máu đông, đến khi có huyết thanh đem ly tâm 2000 vòng/phút trong 15 phút, chiết lấy huyết thanh cho vào ống tybe bảo quản ở - 20oC Bảng 2.4: Tóm tắt thời điểm tiêm phòng và lấy máu kiểm tra kháng thể Ngày Nghiệm thức (con) Số lần tuổi NT1 NT2 NT3 NT4 (ngày) Tiêm phòng Lần 1 7 180 180 180 Lần 2 28 180 180 180 Lấy máu Trước tiêm phòng 3 60 Lần 1 21 60 60 60 60 Lần 2 42 60 60 60 60 NT1: Đối chứng; NT2: Vaccine IBD BLEN; NT3: Vaccine Cevac Gumboro L; NT4: Vaccine Nobilis 10 Thực hiện kiểm tra kháng thể kháng virus Gumboro bằng phản ứng ELISA gián tiếp. Bộ kit Idexx ELISA (USA) do công ty Thịnh Á tại TP. HCM phân phối. 2.4 Chỉ tiêu theo dõi 2.4.1 Nội dung 1 - Đặc điểm của các đàn gà bệnh Gumboro: giống, phương thức chăn nuôi, tuổi, số lần tiêm vaccine … - Tần suất xuất hiện triệu chứng và bệnh tích của gà mắc bệnh Gumboro. - Tỉ lệ mẫu nhiễm. - Tỉ lệ gà chết do bệnh Gumboro. 2.4.2 Nội dung 2 - Trình tự chuỗi nucleotide và chuỗi amino acid của các chủng phân lập. - Mức độ tương đồng chuỗi nucleotide và amino acid giữa chủng thực địa và các chủng vaccine IBDV. - Mức độ tương đồng chuỗi nucleotide và amino acid giữa chủng thực địa và một số chủng khác ở Việt Nam và trên thế giới (đã công bố trên ngân hàng genbank). - Nguồn gốc phả hệ của các mẫu virus thực địa. 2.4.3 Nội dung 3 - Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa 2 giống gà, vaccine và số lần tiêm phòng - Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa 2 giống gà, vaccine và số lần tiêm phòng. 2.5 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thí nghiệm được xử lý sơ bộ trên phần mềm Excel. Các số liệu thống kê mô tả và phân tích phương sai theo chương trình Minitab 16. So sánh sự khác biệt giữa các trung bình nghiệm thức bằng kiểm định ChiSquare và Tukey của chương trình Minitab 16. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu tình hình bệnh Gumboro trên gà tại một số tỉnh/ thành vùng ĐBSCL 3.1.1. Đặc điểm của các đàn gà bệnh Gumboro 3.1.1.1 Tỉ lệ đàn gà có bệnh Gumboro giữa các giống gà Bảng 3.1: Tỉ lệ đàn gà bệnh Gumboro giữa các giống gà Đàn gà nghi mắc bệnh Gumboro có các triệu chứng: xù lông, ủ rũ, uống nhiều nước, gà kém ăn hoặc bỏ ăn, tiêu chảy phân trắng, thường dồn về một góc chuồng, lúc đầu nhiệt độ tăng sau đó giảm. Để xác định đàn gà 11 bệnh tiến hành lấy mẫu phân để xét nghiệm bằng kit IBDV Ag Test của công ty Thời Đại Xanh. Dựa vào kết quả Bảng 3.1 cho thấy số lượng đàn gà mắc bệnh ở giống gà Nòi lai là 15 đàn, gà Lương Phượng là 14 đàn, gà Tàu Vàng là 13 đàn, gà Bình Định là 17 đàn. Tỉ lệ đàn gà mắc bệnh là 45%. Giống gà Số đàn nghi bệnh Số đàn có bệnh Tỉ lệ (%) Nòi Lai 52 15 28,8 Tàu Vàng 19 13 68,4 Bình Định 31 17 54,8 Lương Phượng 29 14 48,3 Tổng 131 59 45,0 P = 0,012 Tỉ lệ nhiễm bệnh Gumboro giữa các giống gà khảo sát khác biệt có ý nghĩa về thống kê (P<0,05), gà Tàu Vàng cao nhất (68,4%), thấp nhất là gà Nòi lai (28,8%). Điều này cho thấy sức kháng bệnh Gumboro phụ thuộc vào đặc điểm di truyền của từng giống gà đến các đáp ứng miễn dịch sớm đối với IBDV. 3.1.1.2 Tỉ lệ gà bệnh Gumboro theo các phương thức chăn nuôi Bảng 3.2: Tỉ lệ gà bệnh Gumboro theo phương thức chăn nuôi Phương thức chăn nuôi Thả hoàn toàn Bán chăn thả Nhốt hoàn toàn Tổng Số đàn nghi bệnh 50 60 21 131 Số đàn Tỉ lệ bệnh (%) 14 28,0 33 55,0 12 57,1 59 45,0 P = 0,009 Kết quả Bảng 3.2 cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỉ lệ nhiễm bệnh Gumboro xảy ra chủ yếu trên gà nuôi theo phương thức nhốt hoàn toàn và bán chăn thả (tương đương 57,1% và 55,0%), thấp nhất ở phương thức nuôi thả hoàn toàn (28,0%) (P<0,05). Có thể do gà nuôi theo phương thức chăn thả giảm được các stress từ việc nuôi nhốt (mật độ, điều kiện vệ sinh không đảm bảo, thiếu thông thoáng, …) nên gà có sức đề kháng tốt hơn đối với bệnh từ đó làm giảm nguy cơ nhiễm bệnh so với gà nuôi nhốt. 3.1.1.3 Tỉ lệ gà nhiễm bệnh Gumboro giữa các lứa tuổi Kết quả Bảng 3.3 cho thấy lứa tuổi gà mắc bệnh Gumboro cao nhất ở gà từ 21 - 42 ngày tuổi chiếm 57,4%, kế đến ở gà từ 12 – 21 ngày tuổi (46,5%), thấp ở gà trên 42 ngày tuổi chiếm tỉ lệ 23,5%. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,05). Điều này cho thấy bệnh Gumboro chủ yếu tập trung ở giai đoạn gà từ 3 đến 6 tuần tuổi (21 - 42 ngày tuổi). 12 Bảng 3.3: Tỉ lệ gà nhiễm bệnh Gumboro giữa các lứa tuổi Lứa tuổi Số đàn nghi bệnh Số đàn bệnh Từ 12- 21 ngày tuổi 43 20 Từ 21-42 ngày tuổi Lớn hơn 42 ngày tuổi Tổng 54 34 131 31 8 59 Tỉ lệ (%) 46,5 57,4 23,5 45,0 P = 0,008 3.1.1.4 Tỉ lệ bệnh Gumboro ở các đàn có và không tiêm vaccine Gumboro Bảng 3.4: Tỉ lệ đàn gà bệnh theo số lần sử dụng vaccine Số lần sử dụng Số đàn sử dụng Số đàn bệnh Tỉ lệ (%) vaccine vaccine Không sử dụng 36 24 66,7 01 lần 42 22 52,4 02 lần 53 13 24,5 Tổng 131 59 45,0 P=0,001 Qua Bảng 3.4 cho thấy những đàn không được tiêm vaccine có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất (66,7%), kế đến là tiêm vaccine một lần (52,4%), tỉ lệ mắc bệnh thấp nhất ở những đàn được tiêm nhắc lại lần hai (24,5%). So sánh tỉ lệ mắc bệnh ở những đàn gà không chủng ngừa vaccine với những đàn sử dụng vaccine 1 lần cho thấy có sự khác có ý nghĩa về mặt thống kê (P = 0,001). 3.1.2. Tần suất xuất hiện triệu chứng và bệnh tích của gà mắc bệnh Gumboro Bảng 3.5: Tần suất xuất hiện đặc điểm lâm sàng trên đàn gà mắc bệnh (n=59) Tần suất Tỉ lệ Đặc điểm lâm sàng Số mẫu xuất hiện (%) Bỏ ăn, xù lông, uống nhiều nước Ủ rũ, gục đầu và sà cánh Tiêu chảy phân trắng, xanh nhiều nước 59 59 59 59 59 56 100 100 94,9 Hậu môn dính đầy phân 59 46 77,9 Da chân khô Tự mổ vào hậu môn 59 59 45 21 76,3 35,6 13 Hình 3.1: Một số triệu chứng lâm sàng gà mắc bệnh Gumboro (A: Hậu môn ướt, dính phân vấy bẩn; B: Gà xù lông, gụt đầu) Triệu chứng gà tiêu chảy phân trắng, xanh nhiều nước (94,9%), hậu môn dính đầy phân với tỉ lệ (77,9%), da chân khô với tỉ lệ (76,3%) thấp nhất là triệu chứng gà tự mổ vào hậu môn chiếm tỉ lệ (35,6%). Qua mổ khám 59 gà đại diện cho 59 đàn bệnh Gumboro chúng tôi ghi nhận tần suất xuất hiện bệnh tích đại thể được thể hiện ở Bảng 3.6: Bảng 3.6: Tần suất xuất hiện bệnh tích trên đàn gà mắc bệnh Gumboro (n=59) Cơ quan Bệnh tích Tần suất xuất hiện Số mẫu Tỉ lệ (%) Túi Fabricius Sưng, xuất huyết, teo 59 100,0 Cơ đùi Xuất huyết 45 76,2 Cơ ngực Xuất huyết 32 54,2 Lách Sưng và/hoặc hoại tử 19 32,2 Thận Sưng 8 13,5 Ruột Xuất huyết 19 32,2 Phần tiếp giáp dạ dày tuyến và dạ dày cơ Xuất huyết 26 44,1 14 Hình 3.2: Bệnh tích bệnh Gumboro ở đàn gà bệnh (A: xuất huyết cơ đùi, B: Thận sưng, nhạt màu C: Túi Fabricius sưng, tích tụ keo nhày bên ngoài D: Chỗ tiếp giáp dạ dày cơ và dạ dày tuyến xuất huyết) 3.1.3. Tỉ lệ mẫu nhiễm bệnh Gumboro ở các tỉnh/ thành vùng ĐBSCL Bảng 3.7: Tỉ lệ mẫu nhiễm Gumboro theo địa phương khảo sát Tỉnh Số mẫu Số mẫu nhiễm Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Bến Tre 26 11 Hậu Giang Cần Thơ Trà Vinh Vĩnh Long An Giang Tổng 15 14 19 28 29 131 9 7 9 12 11 59 42,3 60,0 50,0 47,4 42,8 37,9 45,0 P = 0,812 Qua khảo sát 131 đàn gà nghi bệnh có 59 đàn được xác định là mắc bệnh Gumboro với tỉ lệ 45,0% thông qua triệu chứng và bệnh tích đặc trưng. Giữa các tỉnh khảo sát, đàn gà nuôi tại Hậu Giang có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất (60,0%) và thấp nhất ở An Giang, (37,9%). 3.1.4 Tỉ lệ gà chết do bệnh Gumboro Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy tỉ lệ chết của gà do bệnh Gumboro trong khảo sát này không cao (4,81%). Tuy nhiên có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỉ lệ chết giữa các tỉnh khảo sát (P = 0,001), tỉ lệ gà chết cao nhất ở tỉnh An Giang, thấp nhất ở tỉnh Bến Tre 15 Bảng 3.8: Tỉ lệ gà chết do bệnh Gumboro Số gà Tỉnh Số đàn bệnh Số gà bệnh chết Tỉ lệ chết (%) Bến Tre 26 11.200 365 3,25 Hậu Giang 15 4.500 225 5,00 Cần Thơ 14 3.600 153 4,25 Trà Vinh 19 7.200 450 6,25 Vĩnh Long 28 9.200 455 4,95 An Giang 29 3.900 259 6,64 Tổng 131 39.600 1.907 4,81 P = 0,001 Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy tỉ lệ chết của gà do bệnh Gumboro trong khảo sát này không cao (4,81%). Tuy nhiên có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỉ lệ chết giữa các tỉnh khảo sát (P = 0,001), tỉ lệ gà chết cao nhất ở tỉnh An Giang, thấp nhất ở tỉnh Bến Tre 3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm di truyền virus Gumboro phân lập trên gà bệnh tại ĐBSCL Kết quả thực hiện phản ứng PCR, giải trình tự gen VP2. Sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 474 bp, kết quả điện di ở Hình 3.3 cho thấy chất lượng tốt, băng DNA sáng, đơn băng Hình 3.3: Điện di sản phẩm PCR của các chủng IBDV. M: chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lambda được cắt bằng HindIII. 16 3.2.1 Trình tự chuỗi nucleotide và chuỗi amino acid của các chủng phân lập và vaccine Bảng 3.9: Vị trí sai khác Nucleotide dẫn đến sai khác amino acid giữa các mẫu nghiên cứu Vị trí sai khác M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M 10 nucleotide 724 A A A A A A A A A A 725 A A A A G A A A A A 726 C C C C C C C C C C 766 C C C C C C G G C C 767 G G G T C G T T T T 881 A G G A A A A A A A M1: Trà Vinh; M2: Hậu Giang 1; M3: Hậu Giang 2; M4: An Giang; M5: Cần Thơ 1; M6: Cần Thơ 2; M7: Bến Tre 1; M8: Bến Tre 2; M9: Vĩnh Long 1; M10: Vĩnh Long 2 Kết quả phân tích cho thấy có 53 vị trí sai khác về nucleotide khi so sánh 10 mẫu virus thu thập được trong nghiên cứu. Trong số các vị trí sai khác này có 6 vị trí của nucleotide 724, 725, 726, 766, 767, 881 dẫn đến thay đổi các amino acid tại các vị trí quan trọng là 242, 256, 294 đã làm biến đổi độc lực của các mẫu thực địa (Bảng 3.9). Bảng 3.10: Vị trí sai khác Nucleotide dẫn đến sai khác amino acid giữa các mẫu nghiên cứu và vaccine M1: Trà Vinh; M2: Hậu Giang 1; M3: Hậu Giang 2; M4: An Giang; M5: Cần Thơ 1; M6: Cần Thơ 2; M7: Bến Tre 1; M8: Bến Tre 2; M9: Vĩnh Long 1; M10: Vĩnh Long 2; VC1: IBD Blen; VC2: Bur 706; VC3: Cevac Gumboro L; VC4: Georgia; VC5: Nobilis Kết quả giải trình tự gen và qua phân tích đặc điểm amino acid như đã trình bày Bảng 3.10. Các mẫu thu được tại thực địa M1, M2, M3, M4, 17 M6, M7, M8, M9, M10 cho thấy tại các vị trí 222, 242, 253, 256, 279, 294, 299 và 329 có dãy amino acid là A-I-Q-I-D-A-I-S-A là dạng sắp xếp tìm thấy của tất cả các chủng độc lực cao. Mẫu M5 thuộc nhóm các chủng nhược độc có nhiều biến đổi nhất, 8 vị trí (A222 P; I242V; Q253H; I256V; D279N; A284T; I294L; S299N) sai khác so với các chủng độc lực cao. So sánh trình tự nucleotide của các mẫu vaccine và trình tự nucleotide của các mẫu virus thu thập tại thực địa, nhận thấy có 81 vị trí sai khác nhưng chỉ có 8 vị trí 724, 725, 726, 766, 767, 836, 837, 881 làm thay đổi amino acid (242, 256, 279, 294) dẫn đến biến đổi độc lực. Như vậy có 3 trên 5 vị trí quan trọng nhất làm biến đổi độc lực là 242, 256, 294. Bảng 3.11: Vị trí amino acid thay đổi của nhóm quyết định kháng nguyên kháng nguyên VP2 ở các chủng thực địa với ngân hàng gen (gen bank) STT Chủng Độc lực cao 1 M1 2 M2 3 M3 4 M4 5 M6 6 M7 7 M8 8 M9 9 M10 10 GTG 11 GTG25 12 GTN 13 GT1ST 14 GPT GHUT 15 12 16 YS07 17 9109 variant 18 E 19 GLS 20 HuN11 Biến đổi độc lực Phân nhó m độc lực Vị trí amino acid của nhóm quyết định kháng nguyên kháng nguyên có biến đổi 222 242 25 3 256 279 284 294 299 32 9 vv vv vv vv vv vv vv vv vv vv vv vv vv vv A A A A A A A A A A A A A A A I I I I I I I I I I I I I I I Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q I I I I I I I I I I I I I I I D D D D N D D D D D D D D D D A A A A A A A A A A A A A A A I I I I I I I I I I I I I I I S S S S S S S S S S S S S S S A A A A A A A A A A A A A A A vv A I Q I D A I S A vv vv A A I I Q Q I I D D A A I I S S A A vv A I Q I D A I S A vv vv A A T I I V Q Q Q I I V D D N A A A I I L S S N A A A 18 STT Chủng Phân nhó m độc lực av av av av av Vị trí amino acid của nhóm quyết định kháng nguyên kháng nguyên có biến đổi 222 242 25 3 256 279 284 294 299 32 9 21 STC N V Q V D A L N A 22 IM N I Q V D A L N A 23 Cu-1wt P I Q V D A L N A 24 VC1 P G Y L N T L T A 25 VC5 S V Q I N A L N V Nhược độc P V H V N T L N R 26 M5 at P V N V N T L N A 27 D78 at P V H V N T L N A 28 HZ2 at P V H V N T L N A 29 JD1 at P V H V N T L N A 30 HN04 at P V H V N T L N A 31 VC2 at P V H V N T L N A 32 VC3 at P V H V N T L N A 33 VC4 at P V H V N T L N A M1: Trà Vinh; M2: Hậu Giang 1; M3: Hậu Giang 2; M4: An Giang; M5: Cần Thơ 1; M6: Cần Thơ 2; M7: Bến Tre 1; M8: Bến Tre 2; M9: Vĩnh Long 1; M10: Vĩnh Long 2; VC1: IBD Blen; VC2: Bur 706; VC3: Cevac Gumboro L; VC4: Georgia; VC5: Nobilis. vv: very virulent (siêu cường độc/độc lực rất cao); av: antigenic variant (biến đổi kháng nguyên/độc lực thay đổi at: attenuated (nhược độc). Như vậy, các chủng IBDV phân lập được tại các tỉnh Vĩnh Long, Trà Vinh, Bến Tre, Cần Thơ, Hậu Giang, An Giang đều thuộc nhóm độc lực cao, biểu hiện rõ qua các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích khi mổ khám. Tất cả các mẫu này được thu từ những đàn gà không được tiêm phòng Gumboro. Các mẫu thu tại Cần Thơ có thêm M5 là chủng nhược độc (Bảng 3.11) với các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích không rõ ràng, mẫu này được thu tại đàn gà sau khi đã tiêm phòng lần thứ 2 (3 ngày). 3.2.2 Phân tích tương đồng chuỗi nucleotide, chuỗi amino acid giữa các chủng thực địa và các chủng vaccine Đoạn gen 389 nucleotide (634-1022) mã hóa cho 128 amino acid vùng siêu biến đổi ở gen VP2 của các mẫu virus thu thập được từ thực địa và 05 mẫu vaccine được đưa vào chương trình Mega 6.0 để phân tích mức độ tương đồng về nucleotide và amino acid giữa các nhóm với nhau. Kết quả phân tích cho thấy: Mẫu M1, M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10 có độ tương đồng về nucleotide với các chủng vaccine từ 80 – 93%, vaccine 1 có độ tương đối thấp với tất cả các chủng thực địa (80 – 86%), vaccine 4 có độ tương đồng 19