Tài liệu Kỹ thuật điện di adn dna electrophoresis

Kỹ thuật điện di ADN DNA electrophoresis Khái niệm DNA electrophoresis là quá trình phân tách một hỗn hợp các phân tử DNA nhờ một chất nền cố định (gel) trong một điện trường. Điện di ADN   ADN tich điện âm vì gốc phosphat hình thành khung đường-phosphate của phân tử AND tích điện âm. Trong điện trường di chuyển về cực dương Điện di ADN    Bản gel hoạt động như một giá thể để phân tách các đoạn ADN. ADN thêng ®îc ®iÖn di trªn hai lo¹i gel: agarose vµ acrylamid Các lỗ được tạo ra trong bản gel. Chúng được xem như là các giêngs để chứa dung dịch AND Agarose và Polyacrylamide Agarose: có khả năng phân tách các phân tử AND có kích thước lớn khác nhau từ hàng chục thậm chí hàng trăm Kilobase. Không độc Polyacrylamide: Có độ phân giả cao hơn song chỉ phân tách được các đoạn AND có kích thước sai khác ít. Rất độc Điện di ADN  Dung dịch AND chứa hỗn hợp các đoạn AND có kích thước khác nhau được đổ vào các giêngs trong bản gel. Điện di ADN   Chất nền gel hoạt động như một tấm sàng (sieve). Các phân tử AND lớn đi qua các lỗ trong bản gel khó khăn hơn các phân tử AND nhỏ. Vì vậy, các đoạn phân tử lớn hơn sẽ bị chậm lại so với các phân tử nhỏ khi AND di chuyển trong bản gel. Điện di ADN  Quá trình phân tách cứ tiếp tục tạo ra sự phân tách giữa các đoạn AND càng rõ hơn. Điện di ADN    Thang phân tử chuẩn thương được đienj di cùng với AND. Thang chuẩn thường là hỗn hợp các đoạn AND đã biết trước kich thước. Được dùng để ước lượng kích thước của các đoạn AND trong mẫu nghiên cứu. Fig 20-1: DNA separation by gel electrophoresis http://a32.lehman.cuny.edu/molbio_course/agarose.htm Một số bước chính trong kỹ thuật điện di HiÖn hinh c¸c băng ADN trªn bản gel ®iÖn di   Ph¬ng ph¸p nhuém Ethydium bromid, thuèc thö nµy t¹o c¸c liªn kÕt nhuém víi c¸c baz¬ nit¬. Khi chiÕu ¸nh s¸ng tö ngo¹i (cùc tÝm) vµo bản gel c¸c liªn kÕt nhuém sÏ hÊp phô c¸c bíc sãng 300 – 360nm vµ ph¸t huúnh quang ë bíc sãng 590 nm (mµu da cam), kÕt quả cã thÓ ghi nhËn b»ng m¾t thêng vµ chôp ảnh ®îc. Ph¬ng ph¸p nhuém b¹c. Bản gel sau ®iÖn di ®îc ng©m vµo dung dÞch AgNO3, ADN sÏ t¬ng t¸c víi AgNO3, khi bæ sung formaldehyt ë pH kiÒm, ion b¹c chuyÓn thµnh b¹c nguyªn tö t¹o c¸c h¹t b¹c kÕt tô cã mµu x¸m, cã thÓ ph¸t hiÖn dÔ dµng. Kết quả điện di AND trên gel   This photograph is of various types of DNA that have been electrophoresed on the same gel. Note that high molecular weight DNAs do not separate well on this gel. This can be corrected by altering gel density. Kết quả điện di AND trên gel có nông đô khác nhau Faster migration in a less concentrated gel Tương quan giữa NĐ agarose và độ lớn của ADN Stt % agarose KÝch thíc mảnh ADN (kb) 1. 0,3 5 - 60 2. 0,6 1 - 20 3. 0,7 0,8 - 10 4. 0,9 0,5 - 7 5. 1,2 0,4 - 6 6. 1,5 0,2 - 4 7. 2,0 0,1 - 3 C¸c ®o¹n DNA được cắt bằng RE cã thÓ t¸ch khái nhau t¬ng øng víi kÝch thíc cña chóng khi ch¹y ®iÖn di trªn gel agarose. Sau khi ®iÖn di c¸c gel ®îc nhuém ethidium bromide vµ cã thÓ quan s¸t trùc tiÕp c¸c ®o¹n c¾t díi ¸nh s¸ng tö ngo¹i hoÆc chôp ảnh. .vntime Kỹ thuật lai phân tử Cơ sở khoa học  Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế bổ sung (Complementarity)  Các dạng phức hợp lai bổ sung 1) DNA-DNA. 2) DNA-RNA. 3) Protein-Protein (thường ở dạng phức hợp kháng nguyên-kháng thể ) Lai DNA-DNA hoặc DNA-RNA Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai mạch đơn DNA. Cơ sở của việc lai phân tử là các mối liên kết hydro giữa các base trên hai mạch. Giữa một base A và một base T hình thành hai liên kết hydro còn giữa G và C hình thành ba liên kết. DNA có thể biến tính hoặc tái hồi khi đun nóng hoặc làm lạnh Để tiến hành phản ứng lai phân tử trước hết DNA mạch kép phải được biến tính. Đó là một quá trình trong đó các liên kết hydro của mạch DNA kép ban đầu bị phá vỡ giải phóng hai mạch đơn với toàn bộ các base sẵn sàng tiếp nhận các liên kết hydro mới.