Tài liệu Kết quả các chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá basa chưa thủy phân (nguyên liệu ban đầu)

Chương IV: Kết quả và biện luận 4.1 Kết quả các chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá Basa chưa thủy phân (nguyên liệu ban đầu) Bảng 4.1 : Chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá Basa Khoáng Canxi Photpho Đạm Độ ẩm 4,277% 0,63% 1,59% 9,835% 73,531% 4.2 Thu nhận enzyme trước tinh sạch Lấy 400 g chế phẩm enzyme thô thêm 1200ml nước cất (tỷ lệ 1:3) khuấy trong 30 phút, lọc thô qua vải, lặp lại quá trình này 3 lần. Gom các dịch lọc mang ly tâm ở tốc độ 6000/ phút trong 15 phút, thu dịch chiết thô, bảo quản dịch chiết thô này trong tủ lạnh ở 40C Bảng 4.2: Hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme thô của nấm mốc Asp.awamori Hoạt tính enzyme (U/g CP) 82,3 Hàm lượng protein (mg/g CP) 37,15 HTR (U/mg) 2,215 4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 4.3.1 Ảnh hưởng của pH Mỗi loại enzyme có một giới hạn nhất định về pH. Để thu được nhiều protein hòa tan ta phải tạo điều kiện thích hợp nhất cho quá trình thủy phân cơ chất. Chính vì vậy ta cần khảo sát pH tối ưu để thủy phân trong điều kiện ở nhiệt độ (370C) Bảng 4.3: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của pH 50 Chương IV: Kết quả và biện luận pH HT (u/g CP) 6 111,838 7 147,395 8 112,632 9 99,618 10 81,417 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease 160 147.4 140 120 112.63 111.84 100 99.62 Hoạt tnh (U/g CP) 81.42 80 60 40 20 0 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme Nhận xét: Enzyme rất nhạy với pH của môi trường. pH thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng enzyme. Mỗi enzyme thích hợp với một vùng pH nhất định. Từ đồ thị 4.1 cho thấy pH tối ưu cho hoạt động của protease là pH=7( 147,395 U/g CP). Ở pH thấp hay cao hơn pH tối ưu, hoạt tính enzyme đều giảm 51 Chương IV: Kết quả và biện luận 4.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ Khảo sát nhiệt độ tối ưu từ 30-700C trong cùng điều kiện pH tối ưu ở trên Bảng 4.4: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của nhiệt độ 0 C HT (U/g CP) 30 156,15 40 213,152 50 169,098 60 135,047 70 130,048 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease 250 213.15 200 150 169.1 156.15 135.05 130.05 60C 70C Hoat tnh (U/g CP) 100 50 0 30C 40C 50C Đồ thị 4.2 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme Nhận xét: 52 Chương IV: Kết quả và biện luận Nhiệt độ là một yếu tố vật lý có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme, chúng liên quan đế khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất. Thông thường tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt qua giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm Enzyme là một protein do vậy enzyme chỉ hoạt động trong một khoảng nhiệt độ nhất định, khoảng nhiệt độ này không làm cho protein bị biến tính, mất hoạt tính sinh học. Khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng enzyme xúc tác tăng. Nếu cứ tiếp tục tăng nhiệt độ đến mức nào đó thì một mặt vận tốc phản ứng tăng theo nhiệt độ thông thường, một mặt ở nhiệt độ cao thì protein của enzyme bắt đầu bị biến tính mạnh mẽ, hoạt tính xúc tác sẽ giảm nhanh, lúc này vận tốc phản ứng cũng tiến dần đến 0. Do vậy trong trường hợp này khi hoạt độ của enzyme đạt giá trị cao nhất thì lúc này nhiệt độ đạt giá trị tối ưu Từ đồ thị 4.2 cho thấy enzyme protease hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 400C (213,152U/g CP). Vượt quá nhiệt độ này hoạt tính enzyme giảm và đặc biệt giảm mạnh ở 700C do sự biến tính protein 4.3.3 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt Bảng 4.5: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của độ bền nhiệt Độ bền nhiệt ( phút) 0 phút 10 phút 20 phút 30 phút 40 phút 50 phút 60 phút Hoạt tính(U/g CP) 237,234 205,249 191,932 174,064 163,741 153,642 150,798 53 Phần trăm theo hoạt tính (%) 100 86,52 80,9 73,37 69,02 64,76 63,57 Chương IV: Kết quả và biện luận Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme protease 250 200 hoạt tnh (U/g CP) 150 100 50 0 10 phút20 phút30 phút60 phút Đồ thị 4.3 0:phút Ảnh hưởng củaphút40 độ phút50 bền nhiệt đến hoạt tính enzyme Nhận xét: Trong quá trính thủy phân thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Trong đó thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme cắt các liên kết trong cơ chất. Khi cơ chất cần thủy phân đã hết thì quá trình thủy phân kết thúc. Thời gian thủy phân phải thích hợp để bảo đảm hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng tốt Nhìn vào đồ thị 4.3 ta có thể thấy thời gian thủy phân (độ bền nhiệt) ở 0 phút có hoạt tính cao hơn những mốc thời gian khác. Những mốc thời gian sau thì có hoạt tính không cao bằng mốc 0 phút Khi thủy phân ở độ bền nhiệt 10 phút thì hoạt tính giảm 13,86 % so với khi thủy phân ở độ bền nhiệt 0 phút 54 Chương IV: Kết quả và biện luận Nếu cho thời gian thủy phân kéo dài thêm 20 phút thì hoạt tính giảm 19,1% so với độ bền nhiệt 0 phút Giảm 26,63% hoạt tính ở độ bền nhiệt 30 phút và giảm 30,98% hoạt tính so với thủy phân với độ bền nhiệt 0 phút Nếu cứ kéo dài thời gian thủy phân thì hoạt tính enzyme giảm 35,24% ở độ bền nhiệt 50 phút và giảm 36,43% ở độ bền nhiệt 60 phút so với độ bền nhiệt 0 phút Vì thế khi thủy phân ta chọn độ bền nhiệt 0 phút 4.4 Kết quả tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel: 4.4.1 Kết quả tinh sạch enzyme của hãng Amano Đồ thị 4.4 : Sắc ký của hãng Amano Nhìn vào đồ thị ta thấy enzyme của hãng Amano có 3 peak 55 Chương IV: Kết quả và biện luận Peak 1 từ ống 15-ống 20 Peak 2 từ ống 22-ống 28 Peak 3 từ ống 29-ống 52 Theo đồ thị thì ta nhận thấy rằng peak 3 khá cao nên có thể chứa protease mà ta quan tâm Bảng 4.6: Tổng hoạt tính và tỏng hàm lượng enzyme của hãng Amano Enzyme hãng Amano Hoạt tính (U) 58,87 Hàm lượng (mg) Hoạt tính riêng (U/mg) 8,977 6,55 4.4.1 Kết quả tinh sạch enzyme của mẫu enzyme Đồ thị 4.5 :Đồ thị sắc ký lọc gel Qua sắc kí ta thu được 3 peak 56 Chương IV: Kết quả và biện luận Peak 1: từ ống 15- ống 21 Peak 2: từ ống 21- ống 25 Peak 3: từ ống 30- ống 52 Xác định hàm lượng và hoạt tính cho từng peak. Tuy nhiên hoạt tính và hàm lượng protein của peak 3 là cao nhất nên có thể dự đoán peak 3 có chứa protease quan tâm Bảng 4.7: Tổng hàm lượng và tổng hoạt tính sau khi tinh sạch Hoạt tính enzyme (U/g CP) 56,76 Hàm lượng protein (mg/g CP) 9,62 HTR (U/mg) 5,9 Nhận xét: Sau khi tinh sạch enzyme qua sắc ký lọc gel ta có thể nhận thấy hàm lượng protein khi sau khi khi tinh sạch thấp hơn hàm lượng protein trước khi tinh sạch. Hoạt tính của enzyme sau khi tinh sạch cũng giảm so với mẫu enzyme trước tinh sạch. Kết quả như vậy là do trong protein của ta có chứa protein tạp nên hàm lượng sau tinh sạch thấp hơn hàm lượng trước tinh sạch. Sau khi tinh sạch thì protein tạp bị loại bỏ, nên hoạt tính riêng của enzyme sau tinh sạch tăng hơn nhiều so với hoạt tính riêng của enzyme trước tinh sạch Bảng 4.8: Tổng hàm lượng và tổng hoạt tính của enzyme Mẫu enzyme ⅀ Hoạt ⅀ Hàm Enzyme thô Enzyme sau tính (U) 82,3 56,76 lượng (mg) 37,15 9,62 tinh sạch Enzyme hãng 58,87 8,977 Amano 57 Hoạt tính Độ tinh riêng (U/mg) sạch (lần) 2,215 1 5,9 2,66 6,55 2,95 Hiệu suất (%) 100 68,96 71,53 Chương IV: Kết quả và biện luận 3.50 2.95 3.00 2.66 2.50 2.00 1.50 1.00 1.00 0.50 0.00 Đồ thị 4.6 : Độ tinh sạch trước và sau sắc ký Nhận xét: Sau qui trình sắc ký lọc gel độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch tăng lên 2,66 lần so với enzyme trước tinh sạch Enzyme của hãng Amano tăng lên 2,95 lần so với enzyme thô Enzyme của hãng Amano tăng 1,11 lần so với enzyme sau khi tinh sạch 58 Chương IV: Kết quả và biện luận 4.5 Kết quả tinh sạch enzyme bằng phương pháp điện di: Hình 4.1: Kết quả chạy điện di của mẫu protein Giếng 1: Thang chuẩn Giếng 2: Peak 2 Giếng 3: Peak 3 Giếng 4: Enzyme thô Giếng 5: Enzyme của hãng Amano Vì hoạt tính peak 1 quá thấp nên ta không xác định trọng lượng phân tử của protein enzyme của peak 1. Ta chỉ quan tâm tới peak 2 và peak 3 59 Chương IV: Kết quả và biện luận Bảng 4.9:Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein trong thang chuẩn Rf 0,147 0,258 0,276 0,345 0,414 0,552 0,621 Trọng lượng phân tử (Dalton) 150000 100000 75000 50000 35000 25000 15000 Log ( trọng lượng phân tử) 5,176 5,00 4,875 4,699 4,544 4,398 4,176 6.000 5.000 f(x) = - 2.06x + 5.46 R² = 0.98 4.176 log Mw 4.000 3.000 2.000 1.000 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 Rf Đồ thị 4.7: Sự tương quan giữa log của trọng lượng phân tử và giá trị Rf Phương trình tuyến tính thu được Y = -2.0597x + 5.4641 Trong đó: y=log (trọng lượng phân tử protein) X=Rf Tỷ số khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di chuyển của vạch màu bromophenol blue cuối cùng tính từ gel phân tích 60 Chương IV: Kết quả và biện luận Từ phương trình tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lượng phân tử của protein Trọng lượng phân tử protein = 10y Giá trị Rf từng vạch của mỗi ba peak và trong mẫu thô Bảng 4.10: Giá trị Rf từng vạch của của mỗi peak trong mẫu Vạch 1 Peak 2 0,155 Peak 3 0,158 Mẫu thô 0,138 Hãng Amano 0,138 2 3 0,224 0,259 0,379 Không có 0,19 0,224 0,259 Không có 4 Không có Không có 0,276 Không có 5 Không có Không có 0,448 Không có Bảng 4.11: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Hãng Amano Thứ tự vạch X=Rf Y Trọng lượng phân tử protein (Daltons) Vạch 1 0,139 5,178 150660 Vạch 2 0,259 4,931 85310 Dựa vào bảng 4.10 ta thấy trọng lượng phân tử protein của hãng Amano nằm trong khoảng 85310-150660 Daltons Bảng 4.12: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Peak 2 Thứ tự vạch Vạch 1 Vạch 2 Vạch 3 X=Rf 0,155 0,224 0,259 Y 5,145 5,003 4,931 Trọng lượng phân tử protein (Daltons) 139636 100693 85310 Bảng 4.13: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Peak 3 Thứ tự vạch Vạch 1 Vạch 2 X=Rf 0,158 0,397 Y 5,139 4,646 61 Trọng lượng phân tử protein (Daltons) 137720 44258 Chương IV: Kết quả và biện luận Dựa vào các bảng trọng lượng phân tử của từng peak ta có thể kết luận được trọng lượng phân tử protein nằm trong khoảng 44258 – 139636 Daltons Bảng 4.14: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở mẫu thô Thứ tự vạch X=Rf Y Trọng lượng phân tử protein (Daltons) Vạch 1 0,138 5,180 151356 Vạch 2 0,19 5,073 118304 Vạch 3 0,224 5,003 100693 Vạch 4 0,276 4,896 78704 Vạch 5 0,448 4,541 34753 Trọng lượng phân tử protein của mẫu thô nằm trong khoảng 34753-151356 Daltons Nhận xét: Ta có thể so sánh trọng lượng phân tử protein của mẫu enzyme trước và sau khi tinh sạch Dựa vào hình 4.1: Mẫu enzyme thô có chứa nhiều vạch và có màu đậm, do trong mẫu có chứa protein tạp vì vậy trong giếng của mẫu enzyme thô có nhiều vạch ảnh hưởng đến enzyme Vì vậy khi xác định trọng lượng phân tử của protein ta nên xác định bằng mẫu protein đã được tinh sạch vì nó không chứa nhiều protein tạp không ảnh hưởng nhiều đến trọng lượng phân tử của protein mà ta quan tâm 4.6 Kết quả thủy phân nội tạng cá: 4.6.1 Thủy phân ở 400C 4.6.1.1 Hàm lượng protein phương pháp Biure Bảng 4.15: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 400C 62 Chương IV: Kết quả và biện luận Thời gian Nồng độ enzyme 0,7% 0,9% 0,5% thủy phân 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h 10h 2.32 2.87 3.08 3.47 3.61 3.77 3.92 4.18 4.29 4.48 4.72 2.49 2.91 3.13 3.59 3.85 3.97 4.06 4.2 4.38 4.52 4.83 1,1% 2.51 3.33 3.96 4.24 4.59 4.72 4.86 5.27 5.48 5.84 6.56 2.66 3.37 4.06 4.32 4.65 4.83 4.91 5.23 5.51 5.92 6.62 Hàm lượng protein ở nhiệt độ 400C (% so với lượng ban đầu) 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 0h 1h 2h 3h 0,5% 4h 5h 0,7% 63 6h 0,9% 7h 1,1% 8h 9h 10h Chương IV: Kết quả và biện luận Đồ thị 4.8: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở nhiệt độ 400C Nhận xét: Ở mốc thời gian 10h lượng protein của nồng độ 0,5% tăng 2,03 lần so với lượng protein ở mốc thời gian 0h Nồng độ enzyme 0,7% ở 10h có lượng protein tăng 1,94 lần so với mốc thời gian ban đầu Lượng protein ở mốc thời gian 10h của nồng độ 0,9% tăng 2,61 lần và tăng 2,49 lần của nồng độ 1,1% so với mốc thời gian 0h Như vậy nồng độ enzyme thích hợp thủy phân nhất là 0,9% 4.6.1.2 Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 400C Bảng 4.16: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 400C Thời gian thủy phân 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 0,5% Nồng độ enzyme 0,7% 0,9% 5.22 6.42 6.89 7.27 7.47 7.63 7.91 5.85 6.94 7.23 7.25 7.49 7.68 7.93 5.95 7.63 8.06 8.83 9.22 9.51 9.65 6.23 7.32 8.17 8.63 9.64 9.79 10.11 10.2 8.22 8.26 9.75 5 10.3 8.24 8.8 9.85 1 10.4 8.39 8.45 9.04 9.15 9.95 10.4 9 10.5 8h 9h 10h 1,1% 64 Chương IV: Kết quả và biện luận 6 8 Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 400C (% so với lượng ban đầu) 180 170 160 150 140 130 120 110 100 0h 1h 2h 3h 0,5% 4h 5h 0,7% 6h 7h 0,9% 8h 9h 10h 1,1% Đồ thị 4.9: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 400C Nhận xét: Đạm amin là thành phần quan trọng trong quá trình thủy phân. Trong thủy phân người ta chỉ quan tâm đến hàm lượng đạm amin. Bảng 4.16 hàm lượng đạm amin đạt giá trị cao nhất ở nồng độ 1,1% nhưng khi thủy phân người ta quan tâm đến thành phần % lượng amin sinh ra tăng bao nhiêu lần so với lượng đạm amin ở mốc thời gian ban đầu Đạm amin sinh ra nhiều nhất ở nồng độ 0,9% 4.6.1.3 Hàm lượng NH3 ở nhiệt độ 400C Bảng 4.17: Hàm lượng NH3 ở nhiệt độ 400C Thời gian thủy phân Nồng độ enzyme 0,7% 0,9% 0,5% 65 1,1% Chương IV: Kết quả và biện luận 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h 10h 1.52 1.91 2.43 2.65 2.86 3.14 3.39 3.88 4.94 5.36 5.54 1.45 1.84 2.05 2.29 2.46 2.59 2.95 3.37 4.47 4.69 4.91 1.42 1.71 1.91 2.04 2.15 2.53 2.74 3.04 4.21 4.55 4.61 1.34 1.66 1.81 1.89 1.97 2.23 2.37 2.69 3.82 3.94 4.07 Hàm lượng NH3nhiệt độ 400C (% so với lượng ban đầầu) 400 350 300 250 200 150 100 0h 1h 2h 3h 0,5% 4h 5h 0,7% 6h 0,9% Đồ thị 4.10: Hàm lượng NH3 ở nhiệt độ 400C Nhận xét: 66 7h 1,1% 8h 9h 10h Chương IV: Kết quả và biện luận Dựa vào đồ thị 4.10 ta thấy hàm lượng NH 3 ở nồng độ 0,5% sinh ra mạnh nhất. Tại nồng độ enzyme này thì cơ chất chưa bị thủy phân gây nên mùi hôi. Thời gian có ảnh hưởng rất lớn đến thời gian thủy phân, thời gian phải thích hợp để enzyme thủy phân hết cơ chất. Với nồng độ enzyme cao thì cơ chất bị thủy phân nhanh hơn vì thế ở nồng 0,7%, 0,9%,1,1% thì lượng NH 3 sinh ra thấp hơn lượng NH3 ở nồng độ 0,5% Lượng NH3 tăng nhanh trong khỏang thời gian 8h-10h Vì thế khi tiến hành thủy phân nên tránh kéo dài thời gian thủy phân từ 8h 4.6.2 Thủy phân ở 500C 4.6.2.1 Hàm lượng protein theo phương pháp Biure Bảng 4.18 : Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở nhiệt độ 500C Thời gian thủy phân 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h 10h 0,5% Nồng độ enzyme 0,7% 0,9% 1.03 1.91 2.17 2.46 2.87 3.21 3.39 3.67 3.94 4.05 4.23 1.06 1.93 2.72 2.84 3.09 3.48 3.73 3.94 4.25 4.28 4.31 67 1.37 2.64 3.44 3.67 4.86 5.11 5.23 5.35 5.59 5.89 6.74 1,1% 1.94 3.96 4.63 4.72 4.94 5.29 5.45 5.65 5.69 5.91 6.75 Chương IV: Kết quả và biện luận Hàm lượng protein ở nhiệt độ 500C (% so với lượng ban đầu) 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 0h 1h 2h 3h 0,5% 4h 5h 0,7% 6h 0,9% 7h 8h 9h 10h 1,1% Đồ thị 4.11: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 500C Nhận xét: Nồng độ enzyme 0,9% có hàm lượng protein cao nhất. Vì nồng độ enzyme khác nhau nên lượng protein tạo ra trong quá trình thủy phân cũng khác nhau. Đối với nồng độ 0,5% thì enzyme thấp không thủy phân hết cơ chất ban đầu nên hàm lượng protein sinh ra thấp hơn hàm lượng protein của các nồng độ khác Lượng protein của nồng độ 0,9% tương đương với lượng protein của nồng độ 1,1% . Nếu thủy phân với nồng độ 1,1% thì lượng protein cũng ngang ngang nhau mà ta phải tốn thêm enzyme điều đó gây lãng phí Vì thế khi thủy phân thì ta nên chọn nồng độ enzyme 0,9% . 68 Chương IV: Kết quả và biện luận 4.6.2.2 Hàm lượng đạm amin Bảng 4.19: Hàm lượng đạm amin ở 500C Thời gian thủy phân 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h 10h 0,5% 4.2 5.25 5.84 6.09 6.78 7.01 8.34 8.56 8.75 8.77 8.92 Nồng độ enzyme 0,7% 0,9% 5.42 6.64 8.96 10.05 11.01 12.48 13.64 13.81 14.15 14.43 14.94 69 5.56 7.89 9.82 10.6 11.82 12.91 14.37 14.77 15.23 15.95 16.57 1,1% 6.77 7.95 9.96 11.85 13.1 14.37 15.54 15.93 16.09 16.24 16.63