Tài liệu Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy dna tinh trùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN MINH THU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHA CHẾ BỘ XÉT NGHIỆM ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ĐỨT GÃY DNA TINH TRÙNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Hà Nội – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN MINH THU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHA CHẾ BỘ XÉT NGHIỆM ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ĐỨT GÃY DNA TINH TRÙNG Chuyên ngành: Y Sinh học - Di truyền Mã số: 60720102 LUẬN VĂN THẠC SỸ HƯỚNG DẪN 1: TS. NGUYỄN THỊ TRANG HƯỚNG DẪN 2: TS. TRIỆU TIẾN SANG LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Thị Trang, giảng viên Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội và TS. Triệu Tiến Sang, Bộ môn Sinh học và Di truyền y học , Học viện Quân Y, những người thầy đã hướng dẫn tận tình, quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và học tập để em hoàn thành luận văn. Em xin cảm ơn các thầy cô, các anh chị kĩ thuật viên, các anh chị em nội trú trong Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và chỉ bảo cho em trong thời gian học tập và nghiên cứu tại bộ môn. Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, Thư viện trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn này. Lời cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnh ủng hộ, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho em không chỉ trong thời gian thực hiện luận văn mà còn trong suốt quá trình học tập và làm việc. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Nguyễn Minh Thu LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn “Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng” dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Trang và TS. Triệu Tiến Sang là hoàn toàn do tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng công bố trước đây. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Nguyễn Minh Thu MỤC LỤ Chương 1. TỔNG QUAN.................................................................................3 1.1. Tổng quan về đứt gãy DNA tinh trùng..........................................3 1.2. Lịch sử nghiên cứu đứt gãy DNA tinh trùng..................................4 1.3. Nguyên nhân gây đứt gãy DNA tinh trùng....................................5 1.4. Cơ chế gây đứt gãy DNA tinh trùng..............................................5 1.5. Ảnh hưởng của đứt gãy DNA tinh trùng đến khả năng sinh sản ở nam giới.........................................................................................................9 1.6. Các phương pháp xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng trên thế giới.........................................................................................................13 1.7. Các tiêu chí đánh giá bộ xét nghiệm theo Tiêu chuẩn Việt Nam hiện nay.......................................................................................................16 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................20 2.1. Đối tượng nghiên cứu...................................................................20 2.2. Phương pháp nghiên cứu..............................................................20 2.3. Các bước tiến hành xét nghiệm....................................................22 2.4. Các bước tiến hành nghiên cứu....................................................26 2.5. Phân tích và xử lý số liệu.............................................................30 2.6. Đạo đức nghiên cứu.....................................................................30 Chương 3. KẾT QUẢ......................................................................................31 3.1. Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng.................................................................31 3.2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng và đánh giá tương đương kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng bằng bộ xét nghiệm tự pha và bộ xét nghiệm thương mại.........39 Chương 4. BÀN LUẬN..................................................................................44 4.1. Hoàn thiện quy trình xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng. 44 4.2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng và đánh giá tương đương kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng bằng bộ xét nghiệm tự pha và bộ xét nghiệm thương mại.........51 Chương 5. KẾT LUẬN...................................................................................57 5.1. Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng.................................................................57 5.2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng và đánh giá tương đương kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng bằng bộ xét nghiệm tự pha và bộ xét nghiệm thương mại.........57 KIẾN NGHỊ....................................................................................................58 TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................59 Phụ lục 1. HỒ SƠ NGHIÊN CỨU..................................................................64 Phụ lục 2. BẢNG PHÂN PHỐI CHUẨN STUDENT....................................65 Phụ lục 3. ĐỘ LẶP LẠI TỐI ĐA CHẤP NHẬN (THEO AOAC)................66 Phụ lục 4. DANH SÁCH BỆNH NHÂN THAM GIA NGHIÊN CỨU.........67 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DNA WHO DFI IUI IVF ICSI AOT SCSA TB TUNEL SCD TCVN Deoxyribonucleic acide World Health Organization DNA fragmentation index intrauterine insemination in vitro fertilization intracytoplasmic sperm injection Acridine Orange Test Sperm Chromatin Structure Assay Toluidine Blue Terminal deoxynucleotidyl tranferase mediated dUTP nick end labeling assay Sperm Chromatin Dispersion test Tiêu Chuẩn Việt Nam DANH MỤC HÌNH VẼ Hình vẽ Hình 1.1. Các cơ chế gây đứt gãy DNA tinh trùng Hình 1.2. Cấu trúc DNA tinh trùng theo Ward L. (1997) Hình 1.3. Độ chính xác Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu Hình 2.2. Hình ảnh tinh trùng có quầng halo và không có quầng halo Hình 3.1. Hình ảnh lam kính với tiêu bản bằng thạch của bộ kit Halosperm Hình 3.2. Hình ảnh lam kính với tiêu bản bằng thạch tự pha Hình 3.3. Hình ảnh tiêu bản của bộ xét nghiệm Halosperm Hình 3.4. Tiêu bản làm bằng bộ xét nghiệm tự pha Hình 3.5. Tiêu bản làm bằng bộ xét nghiệm thương mại Hình 3.6. Biểu đồ so sánh tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng bằng kit tự pha và kit thương mại Halosperm Hình 3.7. Biểu đồ Bland Altman đánh giá mối tương quan giữa 2 phương pháp Trang 6 8 17 21 24 31 31 32 38 38 39 42 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng biểu Bảng 2.1. Bảng quy ước xác định độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm Bảng 3.1. So sánh kết quả giữa các nồng độ thạch agarose. Bảng 3.2. So sánh kết quả giữa các nồng độ thạch phủ lam kính. Bảng 3.3. Kết quả tạo tiêu bản tinh dịch - thạch trên các loại lam kính Bảng 3.4. So sánh DFI giữa các dung dịch biến tính. Bảng 3.5. So sánh DFI giữa các dung dịch ly giải Bảng 3.6. Kết quả thử nghiệm xác định độ chụm của bộ xét nghiệm tự pha. Bảng 3.7. Kết quả kiểm nghiệm mức độ đứt gãy DNA tinh trùng. Bảng 3.8. Bảng kiểm định hệ số tương quan giữa 2 phương pháp Bảng 3.9. Bảng kiểm định T - test của chênh lệch giữa 2 phương pháp Bảng 4.1. So sánh quy trình xét nghiệm của kit Halosperm và kit tự pha. Trang 28 30 31 32 33 - 34 34 - 35 36 - 37 40 41 41 54 - 55 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đứt gãy DNA tinh trùng là một trong những rối loạn vật chất di truyền dẫn tới khả năng thụ tinh kém, thai kém phát triển hoặc thai dị tật bẩm sinh, dễ sảy thai. Theo ước tính, khoảng 25% bệnh nhân nam vô sinh có mức độ đứt gãy DNA tinh trùng cao [1]. Có rất nhiều mối liên quan giữa đứt gãy DNA tinh trùng và kết quả tinh dịch đồ. Nam giới có kết quả xét nghiệm tinh dịch đồ với tinh trùng có khả năng di động kém thường có tỷ lệ đứt gãy DNA cao. Tuy nhiên, có khoảng 10% bệnh nhân vô sinh nam có vấn đề về đứt gãy DNA tinh trùng lại cho kết quả tinh dịch đồ hoàn toàn bình thường [2]. Ngoài ra, ở những cặp vợ chồng vô sinh, đứt gãy DNA tinh trùng còn liên quan đến tiền sử sảy thai, thai lưu nếu đứt gãy xảy ra ở các vị trí gen liên quan đến làm tổ [3]. Chỉ số đứt gãy DNA tinh trùng cũng có giá trị rất cao trong việc tiên lượng khả năng sinh sản của nam giới, giúp lựa chọn phương pháp hỗ trợ sinh sản thích hợp và dự đoán tỷ lệ thành công của phương pháp hỗ trợ sinh sản đó [4]. Trên thế giới hiện nay có rất nhiều phương pháp đánh giá mức độ đứt gãy DNA tinh trùng, phổ biến nhất là khảo sát mức độ phân tán chất nhiễm sắc của tinh trùng. Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện với chi phí thấp so với những phương pháp khác và hiệu quả cao, phù hợp với điều kiện hiện nay [5]. Tuy nhiên, bộ kit xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng hiện nay phải nhập ngoại hoàn toàn, tại Việt Nam chưa có bộ kit riêng. Vì vậy, xét nghiệm này ở nước ta phụ thuộc nhiều vào nhà cung cấp cũng như nhà vận chuyển không chỉ về giá thành mà còn cả thời gian làm xét nghiệm. Để hạn chế nhược điểm này, góp phần đưa xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng đến gần hơn với bệnh nhân, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu "Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng" với các mục tiêu sau: 2 1. Hoàn thiện quy trình pha chế bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng. 2. So sánh kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng ở nam giới bằng bộ xét nghiệm tự pha với bộ xét nghiệm thương mại Halosperm. 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đứt gãy DNA tinh trùng Tinh trùng là tế bào sinh sản của nam giới, mang bộ nhiễm sắc thể đơn bội, 23 nhiễm sắc thể. Mỗi tinh trùng có kích thước 65 - 70 µm. Tinh trùng gồm ba phần: đầu, cổ và đuôi. Tinh trùng được biệt hóa cao độ để thực hiện chức năng sinh sản là di chuyển trong đường sinh dục nữ, nhận biết trứng và thụ tinh cho trứng [6]. Tinh trùng là tế bào đảm nhận chức năng sinh sản ở nam giới. Bình thường tinh trùng được sinh ra từ các ống sinh tinh trong tinh hoàn, và trải qua nhiều giai đoạn để có thể trưởng thành, hoàn thiện về cấu trúc và các chức năng để có thể thụ tinh. Tinh trùng bình thường sẽ có cấu tạo ba phần cơ bản là: đầu tinh trùng, cổ tinh trùng và đuôi tinh trùng. Đầu tinh trùng thường có hình trứng, có "mũ" acrosome đảm nhận chức năng ly giải màng trứng để giúp tinh trùng kết hợp với trứng khi thụ thai, bên trong đầu tinh trùng chứa nhân, và trong nhân chứa bộ gen (DNA) chính là vật liệu di truyền căn bản nhất để kết hợp với bộ gen của trứng để tạo ra hợp tử. Cổ tinh trùng chứa các ty thể có nhiệm vụ giải phóng năng lượng để giúp tinh trùng di chuyển, đuôi tinh trùng có nhiệm vụ giúp tinh trùng "bơi" để có thể vào được vòi trứng và thụ tinh [6]. Đứt gãy DNA tinh trùng là sự tổn thương một hoặc hai mạch của phân tử DNA, đây là sự tách rời hoặc phá vỡ các sợi DNA thành từng mẩu nhỏ, có thể xảy ra với cả DNA trong nhân và DNA của ty thể tinh trùng. Đứt gãy DNA tinh trùng cũng giống như với các tế bào khác, đó là sự tích tụ dần dần ảnh hưởng do các tác nhân bên trong cũng như bên ngoài cơ thể. Tuy nhiên, 4 DNA tinh trùng có cơ chế tự sửa chữa kém và do đó đứt gãy DNA tinh trùng có ảnh hưởng lớn tới chất lượng tinh trùng [7], [8]. 1.2. Lịch sử nghiên cứu đứt gãy DNA tinh trùng Năm 1946, Pollister và Mirsky đã phát hiện ra phần lớn các protein bao quanh DNA trong tinh trùng không phải histones mà là các protamine. Sau đó các nhà khoa học ước tính chỉ có 5 - 15% protein của chất nhiễm sắc trong tinh trùng là histones, còn lại là các protamine [9]. Năm 1953, Leuchtenberger đã phát hiện ra rằng chất lượng của một mẫu tinh trùng không chỉ là vấn đề về số lượng và khả năng vận động của tinh trùng, và có sự khác biệt giữa chất lượng DNA tinh trùng của nam giới vô sinh và nam giới bình thường về khả năng sinh sản [10]. Vào những năm bảy mươi, sự quan tâm ngày càng tăng về mối liên hệ có thể có giữa phơi nhiễm các tác nhân gây tổn hại DNA và giảm khả năng sinh sản. Năm 1970, Ringertz và cộng sự đã thực hiện một xét nghiệm trong đó tinh trùng bò bị đốt nóng và sự tổn thương DNA tinh trùng sau đó được phát hiện khi nhuộm màu cam acridine. Ringertz cũng nhận ra `rằng các tinh trùng có sự ổn định về DNA tăng dần trong quá trình trưởng thành [11]. Mười năm sau, năm 1980, Evenson và cộng sự, nhờ sự tiến bộ của công nghệ sinh học phân tử, đã phát triển một xét nghiệm tế bào học dòng chảy để phát hiện sự đứt gãy DNA trong tinh trùng, gọi là phương pháp khảo sát cấu trúc chromatin tinh trùng (Sperm Chromatin Structure Assay - SCSA) [12]. Sau đó, trong nhiều thập kỷ, hàng loạt các phương pháp giúp phát hiện sự đứt gãy DNA tinh trùng ra đời như COMET (1980), TUNEL (1990), DBD - FISH (2000) hay SCD (2003) chứng tỏ tầm quan trọng cũng như sự quan tâm của giới khoa học cho vấn đề đứt gãy DNA tinh trùng nói chung và sức khỏe sinh sản nói riêng. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp mới xác định đứt gãy DNA tinh trùng vẫn đang được nghiên cứu và phát triển [5]. 5 Song song với việc xây dựng các phương pháp xác định đứt gãy DNA tinh trùng, các nghiên cứu về nguyên nhân đứt gãy DNA tinh trùng, mối liên hệ giữa đứt gãy DNA tinh trùng và sức khỏe sinh sản, lựa chọn các phương pháp hỗ trợ sinh sản phù hợp với cặp vợ chồng khi người chồng có tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng cao cũng được tiến hành và cho nhiều kết quả khả quan [5]. 1.3. Nguyên nhân gây đứt gãy DNA tinh trùng 1.3.1. Nguyên nhân bên trong cơ thể - Quá trình tái tổ hợp không hoàn chỉnh trong quá trình sinh tinh trùng. - Bất thường trong quá trình trưởng thành tiền tinh trùng. - Bất thường tỉ lệ protamine. - Chết tế bào theo chương trình không hoàn toàn. - Tác động của các chất oxy hoá trong cơ thể [5],[13]. 1.3.2. Nguyên nhân từ bên ngoài cơ thể - Khoảng thời gian kể từ lúc xuất tinh. - Tác động của các chất oxy hoá sau khi xuất tinh. - Giãn tĩnh mạch tinh. - Nhiễm khuẩn. - Nhiệt độ tinh hoàn. - Do thuốc, vaccine và các phương pháp trị liệu khác. - Tiếp xúc hoá chất độc hại [5],[13]. 1.4. Cơ chế gây đứt gãy DNA tinh trùng Đứt gãy DNA tinh trùng do nhiều nguyên nhân gây ra, các nguyên nhân trên được phân loại thành 6 cơ chế chính, có thể xảy ra trong quá trình sản xuất hoặc vận chuyển tinh trùng, xuất hiện riêng lẻ hoặc phối hợp với nhau 6 gây nên đứt gãy DNA tinh trùng [14]. Các cơ chế này được mô tả trong hình 1.1 như sau: Hình 1.1. Các cơ chế gây đứt gãy DNA tinh trùng [14]. 1.4.1. Rối loạn quá trình chết theo chương trình trong sản xuất tinh trùng Trong quá trình sản sinh tinh trùng, cơ chế loại bỏ tế bào mầm bất thường được điều chỉnh bởi tế bào Sertoli. Có 50 - 60% tế bào bất thường được loại bỏ theo cơ chế này. Ban đầu, các tế bào mầm bất thường được nhận biết, đánh dấu và sau đó bị thực bào bởi tế bào Sertoli [7], [14], [15], [16]. Khi cơ chế trên bị rối loạn, các tế bào mầm bất thường không được tiêu diệt, tạo ra tinh trùng có DNA bất thường trong tinh dịch người bệnh. Hậu quả của sự rối loạn này, gây ra sự thay đổi chất lượng DNA giữa tế bào mầm và tế bào tinh trùng qua quá trình phân chia và biệt hóa. Do vậy, hình thái tinh trùng có hình thái bình thường thì không có nghĩa là chất lượng DNA tinh trùng đó cũng bình thường [7], [14], [16]. 7 Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng ở bệnh nhân nam giới có oligospermia - ít tinh trùng - thì xác suất một tinh trùng có hình thái bình thường nhưng DNA đứt gãy cao hơn rất nhiều so với nam giới có số lượng tinh trùng bình thường. Từ đó có thể kết luận có mối liên quan giữa sự toàn vẹn của DNA tinh trùng và sự trưởng thành, biệt hóa của tinh trùng đó [14]. 1.4.2. Quá trình tái tổ hợp trong sản sinh tinh trùng không hoàn chỉnh Sự rối loạn quá trình tái tổ hợp trong sản sinh tinh trùng có thể là nguyên nhân dẫn đến sự đứt gãy DNA tinh trùng. Chất nhiễm sắc chứa trong hạt nhân tinh trùng con người nói riêng và động vật có vú nói chung là một cấu trúc cực kỳ nhỏ gọn và ổn định. DNA tinh trùng phải được tổ chức một cách đặc biệt, khác biệt đáng kể so với các tế bào soma, để đạt được trạng thái ngưng tụ này. Tác giả Ward L. (1997) đã đề nghị một mô hình DNA tinh trùng trong đó cấu trúc DNA tinh trùng ban đầu bị phá vỡ, các protein histon sẽ được thay thế bằng protamin [6]. Hình 1.2. Cấu trúc DNA tinh trùng theo Ward L. (1997) [6]. 8 Do đó, trong quá trình trưởng thành, sự phá vỡ cấu trúc DNA tinh trùng là hoàn toàn cần thiết, tuy nhiên các vết nứt từ quá trình này nếu không được phục hồi có thể gây ra đứt gãy DNA tinh trùng sau này. Cơ chế này thường xảy ra ở thời kỳ tiền tinh trùng và làm tinh trùng dễ tổn thương hơn trong quá trình vận chuyển sau tinh hoàn [14], [17], [18], [19]. 1.4.3. Đứt gãy DNA tinh trùng trong quá trình vận chuyển sau tinh hoàn Các nghiên cứu gần đây cho thấy mức độ đứt gãy DNA của tinh trùng sau xuất tinh cao hơn nhiều so với tinh trùng trong tinh hoàn. Chính bản thân tinh trùng chưa trưởng thành sản xuất ra một hàm lượng gốc oxi tự do cao, có thể gây tổn thương DNA ở tinh trùng trưởng thành. Ảnh hưởng của các gốc oxi tự do này tác động lên tinh trùng chủ yếu trong quá trình vận chuyển sau tinh hoàn. Vì mặc dù thời gian bán hủy của các gốc oxi tự do rất ngắn, chỉ từ nano giây đến micro giây, nhưng sự tiếp xúc giữa tinh trùng chưa trưởng thành và tinh trùng trưởng thành trong ống dẫn tinh và mào tinh đã tạo điều kiện cho DNA tinh trùng cảm ứng với các gốc oxi tự do [14], [15], [20], [21]. 1.4.4. Tác động của caspase nội sinh và enzym endonuclease Caspase (cysteine - aspartic protease) là enzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình chết tế bào theo chương trình. Endonuclease là enzym giới hạn, phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases. Sự hoạt hóa enzym caspase và endonuclease bởi các gốc oxi tự do và các yếu tố lý hóa cũng có thể gây ra đứt gãy DNA tinh trùng [14], [20], [22]. 1.4.5. Tác động của tia xạ và hóa chất Việc tiếp xúc với tia xạ và hóa chất cũng có thể gây ra đứt gãy DNA tinh trùng. Các phương pháp điều trị ung thư được cho là có ảnh hưởng bất lợi đến khả năng sinh sản nam và làm giảm số lượng tinh trùng, phát sinh từ các tác 9 dụng độc tế bào của hóa trị hoặc xạ trị trên biểu mô tinh trùng [14], [23]. Một nghiên cứu của O’Flaherty cho thấy rằng sự toàn vẹn của DNA tinh trùng bị ảnh hưởng ở bệnh nhân ung thư tinh hoàn và u lympho Hodgkin sau khi hóa trị [24]. 1.4.6. Tác động của chất độc trong môi trường Nam giới sống trong môi trường có ô nhiễm không khí, nguồn nước... có tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng cao hơn do có sự phơi nhiễm với các chất độc trong môi trường. Tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng càng tăng khi thời gian phơi nhiễm càng kéo dài [14]. 1.5. Ảnh hưởng của đứt gãy DNA tinh trùng đến khả năng sinh sản ở nam giới Theo Sheena Lewis (2013), 80% số cặp vợ chồng vô sinh không rõ nguyên nhân là do chất lượng tinh trùng quá yếu hay đứt gãy DNA tinh trùng. Khi DNA đứt gãy tại những vị trí chứa gen liên quan đến khả năng sinh sản hay sự phát triển, làm tổ của phôi thì khả năng có con rất thấp. Khoảng 25% bệnh nhân nam vô sinh có mức độ đứt gãy DNA cao [1]. Có 3 mức độ đứt gãy DNA tinh trùng: - DFI < 15% là tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng thấp. - DFI 15 – 30%: tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng trung bình. - DFI > 30%: tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng cao [25]. Erenpreiss J. (2006) nhận thấy tỷ lệ có thai tự nhiên gần như bằng không ở nam giới có DFI > 30% [26]. Nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Sơn (2017) trên 80 bệnh nhân vô sinh nam cho thấy DFI trung bình là 34,0 ± 24,9%, trong đó 79% bệnh nhân có DFI >15% [27]. Tình hình vô sinh hiện nay đang là vấn đề cấp thiết của xã hội và đang có xu hướng gia tăng. Theo nghiên cứu của Nguyễn Viết Tiến (2009) thực 10 hiện trên 14.936 cặp vợ chồng trong độ tuổi 15 - 49 ở 8 tỉnh với 8 vùng sinh thái khác nhau, tỉ lệ vô sinh chung trên toàn quốc hiện ở mức 7,7%, trong đó vô sinh nguyên phát là 3,9% và vô sinh thứ phát là 3,8%. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tỉ lệ vô sinh cao nhất ở Khánh Hoà (13,9%) và thấp nhất là Hải Phòng (3,8%) [28]. Trần Thị Trung Chiến, Trần Văn Hanh, Lê Văn Vệ (2009) cho biết tỉ lệ vô sinh do nguyên nhân hoàn toàn từ phía người chồng là khoảng 40,8%, từ cả 2 phía là 10,3% và còn 11,5% chưa rõ nguyên nhân [29]. - Mối liên quan giữa đứt gãy DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ Nghiên cứu của Utsuno H. (2013) đã chứng minh đứt gãy DNA có liên quan đến hình thái bất thường của tinh trùng [30]. Cassuto N.G. (2012) phân tích 10.400 tinh trùng của 26 bệnh nhân và thấy tồn tại mối tương quan thuận giữa đứt gãy DNA tinh trùng và các thông số bất thường hình thái tinh trùng [31]. Irvine (2000) cũng nhận định các thông số tinh dịch, đặc biệt là mật độ tinh trùng có mối tương quan nghịch với tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng [32]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Nasrin Sheikh (2008) cho rằng ở nhóm bệnh nhân vô sinh có mối tương quan nghịch rõ giữa tỷ lệ đứt gãy DNA với khả năng di động của tinh trùng. Tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng cũng tương quan nghịch với hình thái bình thường của tinh trùng nhưng không có tương quan đáng kể với mật độ tinh trùng [33]. Tại Việt Nam, Nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Sơn (2017) trên 80 nam giới vô sinh cho thấy có sự khác biệt về DFI có ý nghĩa thống kê giữa 2 nhóm bệnh nhân có tinh dịch đồ bình thường và bất thường. Cụ thể có mối tương quan nghịch giữa tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng và tỷ lệ di động tiến tới, vận tốc trung bình, đồng thời có mối tương quan thuận với bất thường hình thái tinh trùng. Tuy nhiên các mối tương quan này chỉ ở mức thấp [27]. 11 Mã Phạm Quế Mai, Nguyễn Thị Thuý An và cộng sự (2014) nghiên cứu trên 29 mẫu tinh dịch kết luận tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng tương quan nghịch với mật độ, tỷ lệ di động tiến tới, tỷ lệ sống và tỷ lệ hình thái bình thường của tinh trùng [2]. - Liên quan giữa đứt gãy DNA tinh trùng với thất bại của hỗ trợ sinh sản Tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng của bệnh nhân càng cao thì khả năng thụ thai sau các chu trình hỗ trợ sinh sản càng thấp. Khi DFI > 20%, khả năng sinh sản của nam giới giảm. Khi DFI > 30%, cơ hội để thụ tinh tự nhiên, thụ tinh nhân tạo (IVF) hoặc bơm tinh trùng vào buồng tử cung (IUI) gần như bằng không, thay vào đó nên lựa chọn phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI) [4]. Qua nghiên cứu, Avendano và cộng sự (2009) nhận thấy tinh trùng di động tốt và có tỷ lệ hình thái bình thường cao vẫn có nhiều khả năng bị đứt gãy DNA, đồng thời phát hiện tỷ lệ tinh trùng hình thái bình thường nhưng bị đứt gãy DNA có mối tương quan nghịch với kết quả thụ thai sau ICSI cũng như chất lượng phôi [34]. Virro M.R và cộng sự (2004) cho rằng nam giới có DFI > 30% khi thực hiện hỗ trợ sinh sản có khả năng tạo phôi thấp và có tỷ lệ thất bại cao khi làm IUI/IVF [35]. Như vậy, DFI có giá trị cao dự đoán vô sinh nam cũng như tỷ lệ thành công của các phương pháp hỗ trợ sinh sản. Tuy nhiên, việc xác định khả năng sinh sản của nam giới lại đang được đánh giá chủ yếu bởi những chỉ số trong tinh dịch đồ như hình thái tinh trùng, mật độ, độ di động… ở hầu hết các bệnh viện và trung tâm hỗ trợ sinh sản tại Việt Nam. Điều này giải thích vì sao bệnh nhân với kết quả tinh dịch đồ bình thường vẫn có khả năng vô sinh cũng như tỷ lệ có thai sau điều trị còn thấp.