Tài liệu Hoàn chỉnh kỹ thuật xác định đột biến gen cftr ở nam giới không có tinh trùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI -------***------- TRƯƠNG VĂN HỢP Hoàn chỉnh kỹ thuật xác định đột biến gen CFTR ở nam giới không có tinh trùng KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA KHÓA 2009 - 2015 Hà Nội – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI -------***------- BỘ Y TẾ TRƯƠNG VĂN HỢP Hoàn chỉnh kỹ thuật xác định đột biến gen CFTR ở nam giới không có tinh trùng KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA KHÓA 2009 - 2015 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. TRẦN ĐỨC PHẤN Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS. TS. Trần Đức Phấn, Trưởng Bộ môn Y sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội, người đã dành cho tôi sự quan tâm, trực tiếp chỉ bảo tận tình từ những bước đầu trong quá trình nghiên cứu đến hoàn thiện khóa luận, thầy đã đặt những viên gạch đầu tiên làm nền móng cho con đường nghiên cứu khoa học của tôi. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Trang, Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ hết lòng trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới: Toàn thể các Thầy Cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Y sinh họcDi truyền Trường Đại học Y Hà Nội đã luôn gần gũi, động viên, giúp đỡ tôi và cho tôi những lời khuyên quý báu. Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Đại học Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập, hoàn thành khóa luận này. Xin bày tỏ lòng kính yêu sâu sắc đến bố mẹ và những người thân trong gia đình, bạn bè, đã luôn ở bên hỗ trợ, cổ vũ và động viên tôi hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 25/ 05/ 2015 Sinh viên Trương Văn Hợp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tác giả luận văn Trương Văn Hợp MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 2 1.1. Tình hình vô sinh và vô sinh nam........................................................... 2 1.1.1. Vô sinh ............................................................................................. 2 1.1.2. Vô sinh nam ..................................................................................... 2 1.1.3. Tình hình vô sinh và vô sinh nam trên thế giới................................ 2 1.1.4. Tình hình vô sinh và vô sinh nam ở Việt Nam ................................ 3 1.2. Nguyên nhân vô sinh nam ...................................................................... 4 1.2.1. Phân loại nguyên nhân vô sinh nam theo Tổ chức Y tế thế giới ..... 4 1.2.2. Nguyên nhân vô sinh nam do rối loạn di truyền .............................. 5 1.2.3. Các nguyên nhân không do di truyền gây vô sinh nam ................... 6 1.3. Đột biến gen CFTR và vô sinh nam ....................................................... 7 1.3.1. Đột biến gen CFTR .......................................................................... 7 1.3.2. Mối liên quan giữa đột biến gen CFTR và vô sinh nam ................ 10 1.3.3. Các phương pháp xác định đột biến gen CFTR ............................. 12 1.3.4. Kỹ thuật Multiplex - PCR .............................................................. 13 1.3.5. Kỹ thuật điện di .............................................................................. 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 16 2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân............................................................ 16 2.1.2. Cỡ mẫu ........................................................................................... 16 2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 16 2.2.1. Lấy mẫu .......................................................................................... 17 2.2.2. Chuẩn bị dụng cụ - vật liệu ............................................................ 17 2.3. Phương pháp tiến hành kỹ thuật xác định đột biến gen CFTR ............ 18 2.3.1. Tóm tắt các bước ............................................................................ 18 2.3.2. Tiến hành xác định đột biến gen CFTR bằng kỹ thuật Multiplex PCR và điện di đứng trên thạch polyacrylamid 10% ............................... 19 2.4. Xử lý số liệu .......................................................................................... 23 2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu ......................................................... 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 24 3.1. Đặc điểm chung của nam giới không có tinh trùng .............................. 24 3.1.1. Phân bố theo tuổi ............................................................................ 24 3.1.2. Đặc điểm tinh dịch của nam giới không có tinh trùng ................... 25 3.2. Hoàn chỉnh kỹ thuật Multiplex-PCR và điện di đứng sản phẩm trên thạch polyacrylamid 10% ............................................................................ 26 3.2.1. Chuẩn hóa quy trình xác định đột biến gen CFTR ........................ 27 3.2.2. Độ tinh sạch của DNA tách chiết ................................................... 27 3.2.3. Điện di đứng sản phẩm phản ứng Multiplex - PCR trên thạch polyacrylamid 10% .................................................................................. 28 3.2.4. Phân tích kết quả thu được trên hình ảnh điện di ........................... 30 3.3. Đặc điểm đột biến gen CFTR ở nam giới không có tinh trùng ............ 32 3.3.1. Các đột biến gen CFTR .................................................................. 32 3.3.2. Phân bố các loại đột biến gen CFTR .............................................. 33 3.3.3. Số lượng đột biến gen CFTR ở mỗi người nam không có tinh trùng .................................................................................................................. 34 3.3.4. Tỷ lệ đột biến gen CFTR ở dạng đồng hợp tử và dị hợp tử ........... 34 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 35 4.1. Đặc điểm chung về nam giới không có tinh trùng ............................... 35 4.1.1. Đặc điểm về tuổi ............................................................................ 35 4.1.2. Thể tích tinh dịch............................................................................ 36 4.1.3. Độ pH ............................................................................................. 37 4.2. Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật xác định đột biến gen CFTR bằng phản ứng Multiplex - PCR và điện di đứng trên thạch polyacrylamid 10% ........ 38 4.2.1. Độ tinh sạch của DNA sau khi tách chiết ...................................... 38 4.2.2. Điện di đứng sản phẩm Multiplex - PCR trên thạch polyacrylamid 10% ........................................................................................................... 39 4.2.3. Phân tích kết quả đột biến gen CFTR trên ảnh điện di .................. 41 4.2.4. Quy trình xác định đột biến gen CFTR ở nam giới không có tinh trùng bằng phương pháp Multiplex - PCR và điện di sản phẩm trên thạch polyacrylamid 10% .................................................................................. 42 4.3. Mô tả các đột biến gen CFTR ở nam giới không có tinh trùng ............ 43 KẾT LUẬN .................................................................................................... 46 KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AR Androgen Receptor - Thụ thể androgen AZF Azoospermia factor CBAVD Congenital bilateral aplasia of the vas deferens Bất sản ống dẫn tinh hai bên CF Cystic Fibrosis – Xơ nang CFTR Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator CFTR - RD Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator related disorder ddNTP 2',3' dideoxynucleotides DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid KRNN Không rõ nguyên nhân mRNA Messenger ribonucleic acid - ARN thông tin M-PCR Multiplex polymerase chain reaction NBD Nucleotide-binding domains OD Optical Density NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction WHO World health organization - Tổ chức Y tế Thế giới DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các nhóm nguyên nhân vô sinh nam giới (Theo WHO) [6] ............ 4 Bảng 2.1. Thành phần các chất để tách chiết DNA ........................................ 17 Bảng 2.2. Thành phần các chất cho phản ứng Multiplex-PCR....................... 17 Bảng 2.3. Thành phần các chất để pha thạch polyacrylamid 10% ................. 18 Bảng 2.4. Chu trình luân nhiệt của phản ứng Multiplex - PCR. ..................... 20 Bảng 2.5. Kích thước của 11 loại đột biến gen CFTR .................................... 21 Bảng 3.1. Độ pH tinh dịch của nam giới không có tinh trùng ........................ 26 Bảng 3.2. Tỷ lệ phát hiện các loại đột biến gen CFTR ở nam giới không có tinh trùng ......................................................................................................... 32 Bảng 3.3. Số lượng các loại đột biến gen CFTR trên mỗi bệnh nhân ............ 34 Bảng 4.1. Quy trình kỹ thuật xác định đột biến gen CFTR ở nam giới không có tinh trùng. ................................................................................................... 42 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vị trí của gen CFTR trên nhiễm sắc thể ........................................... 7 Hình 1.2. Tỷ lệ phần trăm về các đột biến gen CFTR ở những bệnh nhân xơ nang tại Nga [39] ............................................................................................... 9 Hình 3.1. Phân bố theo tuổi của bệnh nhân nam không có tinh trùng ............ 24 Hình 3.2. Phân bố tỉ lệ về thể tích tinh dịch .................................................... 25 Hình 3.3. Hình ảnh điện di đứng sản phẩm phản ứng Multiplex - PCR trên thạch polyacrylamid 10% của gen CFTR ....................................................... 28 Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm trên thạch polyacrylamid 10% chụp bằng máy quang phổ tử ngoại .................................................................................. 29 Hình 3.5. Đột biến gen CFTR loại 394delTT trên ảnh điện di ....................... 31 Hình 3.6. Đột biến gen CFTR loại 1677delTA trên ảnh điện di..................... 31 Hình 3.7. Đột biến gen CFTR loại 604insA trên ảnh điện di ......................... 32 Hình 3.8. Phân bố các loại đột biến gen CFTR .............................................. 33 Hình 3.9. Tỷ lệ đột biến gen CFTR ở dạng đồng hợp tử và dị hợp tử ............ 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vô sinh ảnh hưởng rất nhiều đến hạnh phúc gia đình vì đứa con chính là cầu nối giữa người vợ và người chồng. Vô sinh không chỉ ảnh hưởng đến gia đình mà nó còn ảnh hưởng đến cả xã hội vì gia đình chính là tế bào của xã hội [1]. Vô sinh có thể do nguyên nhân từ vợ, từ chồng hoặc cả hai. Việc chẩn đoán và tìm ra nguyên nhân vô sinh ở nam giới là điều rất quan trọng để có hướng điều trị. Để xác định nguyên nhân vô sinh ở nam giới thì xét nghiệm tinh dịch đồ là xét nghiệm không thể thiếu được sau đó cần có các xét nghiệm chuyên biệt để xác định đúng nguyên nhân của vô sinh, qua đó có biện pháp điều trị thích hợp [1], [2], [3]. Trong vô sinh, tình trạng không có tinh trùng có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau, do bệnh lý của tinh hoàn, do các đột biến gen liên quan đến việc sản xuất tinh trùng hoặc gây tắc đường dẫn tinh…trong đó bệnh xơ nang (CF - Cystic Fibrosis) do đột biến gen CFTR (Cystic fibrosis transmembrance conductance regulator) là một nguyên nhân [4], [5]. Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào công bố về xác định đột biến gen CFTR gây không có tinh trùng. Để góp phần tìm hiểu nguyên nhân dẫn đến không có tinh trùng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Hoàn chỉnh kỹ thuật xác định đột biến gen CFTR ở nam giới không có tinh trùng”. Thực hiện nghiên cứu này, chúng tôi nhằm hai mục tiêu sau:  Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật Multiplex - PCR để xác định đột biến gen CFTR ở nam giới không có tinh trùng.  Mô tả các đột biến gen CFTR ở nam giới không có tinh trùng. 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình vô sinh và vô sinh nam 1.1.1. Vô sinh Theo Tổ chức Y tế thế giới, vô sinh là tình trạng không có thai sau thời gian một năm chung sống vợ chồng mà không dùng một biện pháp tránh thai nào. Có hai loại vô sinh là vô sinh nguyên phát và vô sinh thứ phát, trong đó: + Vô sinh nguyên phát là chưa hề có thai lần nào sau một năm xây dựng gia đình. + Vô sinh thứ phát chưa có thai lại sau lần có thai trước được một năm [4]. 1.1.2. Vô sinh nam Vô sinh nam là trường hợp mà nguyên nhân vô sinh là do phía người nam giới. Một trong những tình trạng nặng của vô sinh nam là không có tinh trùng trong tinh dịch [1]. 1.1.3. Tình hình vô sinh và vô sinh nam trên thế giới Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (1991), trên thế giới có khoảng 12% - 15% cặp vợ chồng vô sinh tương đương 50 - 80 triệu người [6]. Theo Hội Y học sinh sản Hoa Kỳ, khoảng 6,1 triệu người Mỹ bị vô sinh, trong đó 1/3 là do nữ, 1/3 là do nam giới, phần còn lại là do cả hai hoặc không rõ nguyên nhân (KRNN) [7]. Ở châu Âu, vô sinh nam chiếm 20% [8]. Tại Pháp, tỷ lệ vô sinh chiếm 13,5% các cặp vợ chồng. Theo Thonneau (1991), có khoảng 15% các cặp vợ chồng không thể có con sau một năm, trong đó do nam giới 20% [9]. Ali 3 Hellani cũng cho rằng khoảng 10% - 15% cặp vợ chồng vô sinh, nguyên nhân do nam chiếm 50% và khoảng 30% - 40% vô sinh nam KRNN [10]. Theo nghiên cứu của D. Stewart Irvine (1998) thì vô sinh là một vấn đề phổ biến trên thế giới, chiếm 14% - 17% ở các cặp vợ chồng, trong đó nguyên nhân do nam giới khó xác định [5]. Krauz và cộng sự cũng cho rằng nguyên nhân gây vô sinh do nam khoảng 50%. Trong đó, khoảng 40% - 50% những người này là do có bất thường về số lượng và chất lượng tinh trùng [11]. Nhìn chung, tỷ lệ vô sinh thay đổi từ 10% - 20%, trong đó nguyên nhân vô sinh do nam và nữ tương đương nhau, tỷ lệ này có xu hướng ngày càng tăng, tỷ lệ vô sinh KRNN còn nhiều. 1.1.4. Tình hình vô sinh và vô sinh nam ở Việt Nam Ở Việt Nam, theo điều tra dân số quốc gia năm 1982, vô sinh chiếm 13%. Trần Thị Trung Chiến và cộng sự đã công bố tỷ lệ vô sinh chiếm 5%, trong đó vô sinh do nam giới chiếm 40,8% [1]. Ngô Gia Hy (2000), đã nhận định rằng trong số các cặp vợ chồng bị vô sinh thì nguyên nhân do người chồng là 40%, do người vợ là 50% và do cả hai vợ chồng là 10% [3]. Theo báo cáo của Trần Thị Phương Mai (2001), vô sinh nguyên nhân do nữ giới khoảng 30% - 40%. Vô sinh nam giới chiếm khoảng 30% các trường hợp. Khoảng 20% các trường hợp tìm thấy nguyên nhân vô sinh ở cả hai vợ chồng. Bên cạnh đó, có khoảng 20% các cặp vợ chồng không tìm thấy nguyên nhân [12]. Báo cáo của Nguyễn Viết Tiến tại Hội thảo quốc tế “Cập nhật về hỗ trợ sinh sản” (2013) tại Hà Nội cho thấy kết quả điều tra ở Việt Nam thì tỷ lệ vô sinh là 7,7%. Trong đó, nguyên nhân do nam giới chiếm 25 - 40%, phụ nữ 40 - 55%, còn lại do cả hai vợ chồng và KRNN [2]. 4 Nguyên nhân chủ yếu dẫn đến vô sinh nam là do rối loạn sinh tinh. Ngoài ra vô sinh nam còn do một số nguyên nhân khác như: rối loạn về tình dục và xuất tinh, rối loạn nội tiết, tắc ống dẫn tinh. Theo Trần Đức Phấn (2010) trong số các cặp vợ chồng vô sinh có 44% có tinh dịch đồ bất thường [13]. 1.2. Nguyên nhân vô sinh nam 1.2.1. Phân loại nguyên nhân vô sinh nam giới theo Tổ chức Y tế thế giới Vô sinh nam giới có thể có rất nhiều nguyên nhân khác nhau, hầu hết các nguyên nhân đều dẫn đến hậu quả là người nam giới không có tinh trùng, ít tinh trùng, bất thường về hình thái tinh trùng... Việc chẩn đoán nguyên nhân rất phức tạp, do đó đề xuất được phương pháp điều trị và tư vấn di truyền còn gặp nhiều khó khăn. Tổ chức Y tế thế giới đã đưa ra một bảng phân loại các nguyên nhân gây vô sinh nam giới một cách có hệ thống [6] (xem bảng 1.1). Bảng 1.1. Các nhóm nguyên nhân vô sinh nam giới (Theo WHO) [6] Rối loạn về tình dục và phóng tinh Nhiễm trùng tuyến sinh dục phụ Miễn dịch Nội tiết Bất thường tinh dịch Tinh trùng ít Bệnh lý toàn thân Tinh trùng di động yếu Dị tật bẩm sinh Tinh trùng dị dạng Tổn thương tinh hoàn mắc phải VT do tắc nghẽn Giãn tĩnh mạch tinh VT không rõ nguyên nhân Nguyên nhân do khám và điều trị Cách phân loại trên đã giúp tiêu chuẩn hóa việc chẩn đoán các nguyên nhân vô sinh do nam giới trên thế giới và để so sánh các nghiên cứu. Tuy nhiên, với sự tiến bộ của y học, gần đây, các thầy thuốc đã tìm ra các nguyên 5 nhân vô sinh nam giới, đặc biệt các nguyên nhân liên quan đến di truyền, cách phân loại này cũng đang được tiếp tục nghiên cứu, cải thiện để phù hợp với sự phát triển của kỹ thuật chẩn đoán [14]. 1.2.2. Nguyên nhân vô sinh nam do rối loạn di truyền 1.2.2.1. Các bất thường nhiễm sắc thể thường gặp Hội chứng Klinefelter: năm 1942, Klinefelter và cộng sự đã mô tả lần đầu tiên hội chứng này như một rối loạn nội tiết. Năm 1959, Jacob và Strong chứng minh rằng karyotyp của người bệnh này là 47,XXY. Tần số của bệnh khoảng 1/1000 trẻ sơ sinh nam [14]. Nam có bộ NST 48,XXYY: kiểu hình giống Klinefelter còn các triệu chứng về hành vi tâm thần thường nặng hơn người mắc hội chứng Klinefelter [14]. Nam 47,XYY: xét nghiệm tinh dịch không cso tinh trùng hoặc rất ít tinh trùng. Sinh thiết, mô học tinh hoàn thấy tế bào dòng tinh thiểu sản và hầu như không trưởng thành, ngoài ra còn xơ hóa ống sinh tinh [15]. Nam có bộ NST 46,XX: hầu hết có tinh hoàn nhỏ và có một số dấu hiệu của thiểu năng androgen tương tự như người mắc Hội chứng Klinefelter, xét nghiệm không thấy tinh trùng trong tinh dịch [14], [15]. Nhiều gen liên kết X quy định đặc điểm hình thái, chức năng tinh hoàn và được cho là có liên quan đến sự hình thành giao tử ví dụ như gen thụ thể Androgen (Androgen Receptor) giúp chuyển đổi từ tinh bào thành tinh tử [16]. Hội chứng Prader-Willi do mất đoạn nhánh dài phần gần tâm của NST số 15 ở băng q11-q13. Biểu hiện béo phì, trương lực cơ nhẽo, chậm phát triển trí tuệ, cơ quan sinh dục teo nhỏ, tay chân ngắn, thân hình thấp… Nam giới bị hội chứng này thường vô sinh do không có quá trình sinh tinh [17]. 6 1.2.2.2. Các rối loạn di truyền ở mức độ phân tử trong vô sinh nam Ước tính khoảng 2000 gen có liên quan đến sự sinh tinh, phần lớn chúng ở trên NST thường và khoảng 30 gen có mặt trên NST Y. Các nhà khoa học đã phát hiện mất đoạn nhỏ trên NST Y có liên quan đến quá trình sinh tinh [10]. Hội chứng Kallmann do đột biến gen KALIG-1 ở nhánh ngắn (Xp22.3) dẫn đến suy hạ đồi và tuyến sinh dục, biểu hiện lâm sàng mất khứu giác và cơ quan sinh dục chậm phát triển [18]. Mất đoạn nhỏ trên NST Y: Với sự phát triển không ngừng của các kỹ thuật di truyền phân tử, các tác giả đã chỉ rõ được mất những đoạn nhỏ trong vùng AZF liên quan đến không có tinh trùng hay ít tinh trùng mà trước đây cho là không rõ nguyên nhân. Các vùng AZF trên nhánh dài NST Y liên quan đến sinh tinh trùng là AZFa, AZFb và AZFc, AZFd [19], [20]. Ngoài ra các đột biến DNA ty thể, di truyền đa nhân tố cũng có khả năng gây vô sinh nam. Xơ nang do đột biến gen CFTR trên nhánh dài NST số 7 (Kerem và cộng sự (1989); Riordan và cộng sự (1989)) gây nên, bệnh thường gặp ở người da trắng. Nam giới bị bệnh này thường không có ống dẫn tinh hoặc tắc ống dẫn tinh gây không có tinh trùng. Sinh thiết tinh hoàn vẫn có quá trình sinh tinh xảy ra. Theo Irvine (1998) thì đột biến gen CFTR chiếm khoảng 2% nam giới không có tinh trùng do tắc nghẽn [5]. Nguyên nhân này sẽ được chúng tôi trình bày trong phần dưới đây. 1.2.3. Các nguyên nhân không do di truyền gây vô sinh nam Một số nguyên nhân gây vô sinh nam không do di truyền gồm: Giãn tĩnh mạch tinh, viêm tinh hoàn, chấn thương tinh hoàn…. 7 1.3. Đột biến gen CFTR và vô sinh nam 1.3.1. Đột biến gen CFTR Gen CFTR nằm trên nhánh dài của nhiếm sắc thể số 7 ở locus q31.2 [21], dài 230000 cặp base, chứa 27 exon và phiên mã tạo ra một mRNA khoảng 6,5 kb, tổng hợp protein CFTR gồm 1480 acid amin nằm trên màng tế bào, gồm 5 phần: 2 phần xuyên màng TMD1 và TMD 2, 2 phần gắn nucleotid trong tế bào chất (nucleotide-binding domains (NBD1 and NBD2)) và phần điều chỉnh R [22], [23]. Hình 1.1. Vị trí của gen CFTR trên nhiễm sắc thể Nguồn http://ghr.nlm.nih.gov/gene/CFTR Protein CFTR là một protein xuyên màng vận chuyển ion Cl -, qua đó kiểm soát sự ra vào của nước trong các mô, cần thiết cho việc tạo thành lớp chất nhầy mỏng để bảo vệ niêm mạc đường hô hấp, hệ tiêu hóa, hệ thống sinh sản, và các cơ quan khác. Đồng thời protein CFTR cũng điều chỉnh hoạt động của kênh vận chuyển ion Natri mang điện tích dương qua màng tế bào rất cần thiết cho các chức năng bình thường của phổi, tụy và các tuyến ngoại tiết [23]. Đột biến gen CFTR gây ra bệnh xơ nang (CF - Cystic Fibrosis) với các biểu hiện lâm sàng ở một số cơ quan bao gồm bất sản ống dẫn tinh hai bên, 8 giãn phế quản lan tỏa, viêm tụy mãn tính và viêm xoang mãn tính [24]. Đây là bệnh di truyền gen lặn, biểu hiện bệnh khi các đột biến nằm trên cả hai alen của gen CFTR. Nếu chỉ có đột biến trên một alen, người ta gọi là người lành mang gen đột biến [25]. Cho đến nay hơn 1700 đột biến gen CFTR đã được mô tả, nhưng chỉ có gần 20 đột biến xảy ra với tần số lớn hơn 0,1% và 5 đột biến xảy ra với tần số lớn hơn 1%. Phổ biến nhất là đột biến delF508, chiếm khoảng 70% ở bệnh nhân xơ nang trên toàn thế giới [26]. Tỷ lệ đột biến này thay đổi ở các dân tộc khác nhau, ví dụ tại châu Âu là 1/1800 trẻ sơ sinh ở Ireland còn Phần Lan là 1/26000 (WHO, 2004). Ở quần thể người da trắng, đột biến delF508 chiếm khoảng 2/3 trong tổng số đột biến gây ra bệnh xơ nang. Tuy nhiên đột biến W1282X có tần số cao hơn đột biến delF508 trong một số quần thể người Do Thái [27], [28]. Năm 2002, Bobadilla công bố một phân tích cộng gộp lớn về đột biến gen CFTR ở bệnh nhân xơ nang cho thấy rằng tần số đột biến gen loại delF508 thay đổi từ 100% ở Quần đảo Faroe của Đan Mạch đến 24,5% ở Thổ Nhĩ Kỳ [29], [30]. Trên thế giới, các tác giả gặp một số giới hạn các alen đột biến có tần số cao hơn 1%, ví dụ như các đột biến G542X phổ biến ở khu vực Địa Trung Hải có thể do kết quả sự di cư của người Phoenician quanh vùng biển này [31]. Các đột biến G551D thường gặp ở quần thể người Celtic và cũng phổ biến ở Ireland và Brittany [32], đột biến N1303K cũng khá phổ biến trong quần thể người ở trung tâm châu Âu [33]. Bên cạnh những đột biến khá phổ biến phân bố chủ yếu ở người da trắng, còn có một số đột biến khác như đột biến Y122X có tần số 24% ở đảo Reunion [34], hoặc đột biến 394delTT ở các nước Bắc Âu giáp biển Baltic [35]. Một đột biến phổ biến ở Trung và Đông Âu là đột biến mất các exon 2 9 và 3 của gen CFTR [36]. Trong số người gốc Châu Âu tại Bắc Mỹ thì tỷ lệ gặp các đột biến F508del, G542X, G551D, W1282X và N1303K khoảng hơn 1% [37]. Hiểu biết chính xác về sự phân bố các đột biến gen CFTR trên toàn thế giới đã tạo điều kiện cho việc sàng lọc bệnh xơ nang ở hầu hết các nước châu Âu và trong hầu hết các tiểu bang của Mỹ và Australia [38]. Theo nghiên cứu của Nick Petrov Valentinovna về các đột biến gen CFTR ở bệnh nhân xơ nang với một cỡ mẫu lớn (n = 776) từ các vùng khác nhau của Liên Bang Nga thì thấy các đột biến gen CFTR phổ biến là: delF508 (54,2%), CFTRdele2,3 (21kb) (7,2%), 2143delT (2,1%), W1282X (2,0%), N1303K (1,9%), 3849 + 10kbC> T (1,9%), 2184insA (1,7%), G542X (1,3%), 1677delTA (0,8%), 3821delT (0,8%), R334W (0,7%), L138ins (0,6%) và 394delTT (0,5%). Còn lại tỷ lệ của các đột biến khác là 23% [39]. (Hình 1.2). Hình 1.2. Tỷ lệ phần trăm về các đột biến gen CFTR ở những bệnh nhân xơ nang tại Nga [39] 10 1.3.2. Mối liên quan giữa đột biến gen CFTR và vô sinh nam Bất thường gen CFTR làm rối loạn về kênh clo trên màng của tế bào biểu mô dẫn đến bệnh phổi tiến triển, rối loạn chức năng tụy, nồng độ clorua cao trong mồ hôi và gây vô sinh nam [40]. Vô sinh ở nam giới liên quan đến bệnh xơ nang là do bất sản ống dẫn tinh hai bên (Congenital bilateral aplasia of the vas deferens, CBAVD). Khi phân tích tinh dịch của những bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh hai bên không thấy có tinh trùng. Trong một nghiên cứu gần đây, hơn 70% các bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh hai bên có các triệu chứng nhẹ của bệnh xơ nang, nên có thể cho rằng CBAVD là một dạng nhẹ hoặc biểu hiện không đầy đủ của bệnh xơ nang. Việc chẩn đoán CBAVD tương đối dễ thực hiện, dựa trên phân tích tinh dịch đồ thấy thể tích < 1,5ml, pH có tính acid, giảm hoặc mất hoàn toàn fructose và không có tinh trùng trong tinh dịch. Khám thực thể và siêu âm qua trực tràng không thấy ống dẫn tinh. Silber và cộng sự nghiên cứu năm 1995 thấy rằng bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh hai bên có thể bình thường hoặc chỉ giảm nhẹ sự sinh tinh. Những bệnh nhân CBAVD muốn có con có thể sử dụng các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản như chọc hút tinh trùng từ mào tinh, thụ tinh trong ống nghiệm… Nhiều ca sinh ra bằng các phương pháp này đã được báo cáo [41]. Tần số đột biến gen CFTR ở nam giới vô sinh do CBAVD cao hơn gấp 20 lần so với tần số mang gen đột biến trong cộng đồng. Phổ biến nhất trong nhóm này là đột biến delF508, chiếm khoảng 70% trong tổng số các đột biến ở bệnh nhân xơ nang. Các đột biến khác thường thấy ở bệnh nhân CBAVD là G542X, R553X, W1282X (tất cả các đột biến vô nghĩa trong đó X ký hiệu cho một codon kết thúc), N1303K (sai nghĩa), 2184delA (khung đọc) và R1162X (vô nghĩa).