Tài liệu Giáo trình kỹ thuật lên men công nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI ----------------------------------- GIÁO TRÌNH KỸ THUẬT LÊN MEN CÔNG NGHIỆP PGS. TS. Lê Gia Hy Hà Nội, 7/ 2021 1 2 LỜI NÓI ĐẦU Công nghệ lên men là nền tảng của công nghiệp sinh học, bởi chính công nghệ sinh học đưa ra các quy trình công nghệ mới, sản phẩm có giá trị thương mại cao, góp phần quan trọng đưa các thành quả của nghiên cứu và triển khai công nghệ vào sản xuất công nghiệp. Hiểu các quá trình công nghệ lên men, các ứng dụng của vi sinh vật trong thực tiễn sản xuất là nhiệm vụ chính của các cán bộ nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học. Trong quá trình công nghệ lên men sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học thì được chia làm 2 giai đoạn chính: Giai đoạn lên men và giai đoạn thu hồi và hoàn thiện sản phẩm, hiểu rõ các kỹ thuật lên men nhằm nâng cao năng suất lên men là rất quan trọng, vừa góp phần hoàn thiện quy trình sản xuất, vừa tạo ra các sản phẩm có ý nghĩa thương mại cao. Lên men công nghiệp là một ngành khoa học liên ngành áp dụng các nguyên tắc liên quan đến sinh học và kỹ thuật, khía cạnh sinh học tập trung vào vi sinh vật học và hóa sinh, còn khía cạnh kỹ thuật áp dụng động lực học chất lỏng và kỹ thuật vật liệu. Quá trình lên men công nghiệp chủ yếu gắn liền với việc khai thác thương mại vi sinh vật trên quy mô lớn, các vi sinh vật được sử dụng có thể là loài tự nhiên, đột biến hoặc đã được biến đổi gene. Nhiều sản phẩm có giá trị kinh tế đáng kể được tạo ra từ quá trình lên men công nghiệp được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, trong công nghệ dược phẩm, trong sản xuất hóa chất, trong sản xuất nông nghệp, trong sản xuất năng lượng sinh học và trong bảo vệ môi trường. Cuốn “Giáo trình kỹ thuật lên men công nghiệp” được xem là cuốn sách chuyên sâu về kỹ thuật lên men công nghiệp các sản phẩm công nghệ sinh học, một phần rất quan trọng trong cả quá trình sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học. Do vậy, mục đích của của cuốn sách nhằm cung cấp các kiến thức cơ bản về công nghệ lên men nói chung, các nguyên lý, kỹ thuật lên men ở mức độ công nghiệp các sản phẩm công nghệ sinh học cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành công nghệ sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học. Cuốn Giáo trình gồm 5 chương được soạn theo Đề cương chi tiết học phần Kỹ thuật lên men công nghiệp, mã số BEKL, của Trường Đại học Mở Hà Nội: Chương 1: Đại cương về công nghệ lên men, mục đích, phân loại và các công đoạn chính của quá trình lên men và lên men công nghiệp. Chương 2: Chuẩn bị chủng giống sản xuất ở mức độ công nghiệp và các giải pháp kỹ thuật để cấp giống chất lượng cho quá trình sản xuất. Chương 3: Chuẩn bị môi trường và hệ thống thiết bị lên men cho quá trình sản xuất ở mức độ công nghiệp. Chương 4: Giới thiệu các kỹ thuật lên men và các công đoạn chính trong quá trình lên men sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học ở quy mô công nghiệp. Chương 5: Giới thiệu các giải pháp hạn chế nhiễm tạp trong sản xuất công nghiệp, đánh giá hiệu quả lên men để mở rộng quy mô sản xuất và xây dựng phương án phát triển sản phẩm mới. 3 Tuy nhiên, do thời gian có hạn, cuốn sách mới chỉ tập trung vào những phần cơ bản của kỹ thuật lên men theo Đề cương chi tiết của học phần, chắc chắn còn nhiều thiếu sót, rất mong sự đóng góp ý kiến của độc giả để cuốn sách được bổ sung hoàn thiện hơn. Hà Nội, tháng 7 năm 2021 Tác giả 4 Chương 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CÔNG NGHỆ LÊN MEN 1.1. Khái niệm về công nghệ lên men 1.1.1. Công nghệ lên men 1.1.1.1. Lên men Lên men là công nghệ lâu đời nhất trong tất cả các quá trình công nghệ sinh học. Theo tiếng Latin, động từ fevere, có nghĩa là sự sôi xuất hiện trong nước chiết quả hoặc malt nghiền dưới tác động của nấm men trong quá trình sản xuất rượu. Lên men là quá trình chuyển hóa hóa học nhờ các cơ thể sống hoặc sản phẩm của chúng thường sinh khí (CO2) và nhiệt. Các nhà vi sinh vật xem sự lên men như là “bất kỳ quá trình sản xuất một sản phẩm bằng cách nuôi cấy một lượng lớn vi sinh vật”, còn các nhà sinh hóa học xem sự lên men như là một quá trình sinh năng lượng trong một hợp chất hữu cơ của tất cả chất nhường và nhận điện tử, vì thế lên men là quá trình kỵ khí mà ở đó năng lượng được sản sinh không có sự tham gia của oxy hoặc chất nhận điện tử vô cơ. Đây là quá trình lên men kỵ khí nhờ các vi sinh vật lên men hay còn gọi là lên men truyền thống. Lên men là một phương pháp dùng để chuyển hóa nguyên liệu để thu được sản phẩm phục vụ cho đời sống con người. Ban đầu lên men chỉ được dùng trong sản xuất các loại thực phẩm như rượu, giấm, sữa chua,… Cùng với sự phát triển của khoa học và các ưu điểm vượt trội của mình, lên men còn được dùng để sản xuất nhiều loại sản phẩm và dịch vụ khác như kháng sinh, hóa chất, xử lý nước thải. Kỹ thuật lên men cũng trở nên ngày càng phong phú về nhiều mặt khác nhau: nguyên liệu, sản phẩm, trang thiết bị. Quá trình lên men có oxy phân tử tham gia, để sinh tổng hợp các chất trao đổi sơ cấp và thứ cấp, sinh tổng hợp các loại enzyme v.v… là lên men hiếu khí hay còn gọi là lên men sinh tổng hợp. 1.1.1.2. Công nghệ lên men Nói một cách đơn giản hơn, công nghệ sinh học có nghĩa là sử dụng các cơ thể hoặc các sản phẩm của chúng ở mức độ công nghiệp. Công nghệ sinh học hiện nay là lĩnh vực khoa học hầu như bao gồm các mặt khoa học, công nghệ và thương mại của mọi lĩnh vực hoạt động của con người từ sản xuất nông nghiệp đến bảo vệ môi trường. Do vây, công nghệ sinh học là gì? Theo định nghĩa của Liên đoàn châu Âu và Công nghệ sinh học (năm 1981) thì “Công nghệ sinh học được coi là một tập hợp các ngành sinh hóa học, vi sinh vật học, tế bào học, di truyền học với mục tiêu đạt tới sự ứng dụng công nghệ các vi sinh vật, các mô, các tế bào nuôi và các cấu phần của tế bào”. Để hiểu rõ khái niệm này, người ta thể hiện trên mô hình cây công nghệ sinh học (Hình 1.1). Trong ba thành phần trung tâm của công nghệ sinh học thì vi sinh vật học chính là nền tảng cho sự phát triển của công nghệ sinh học. Công nghệ sinh học là một lĩnh vực rộng lớn. Nếu sắp xếp theo đối tượng sinh học, công nghệ sinh học được chia thành các ngành: 1- Công nghệ sinh học vi sinh vật là công nghệ nhằm khai thác tốt nhất khả năng kỳ diệu của vi sinh vật, tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật hoạt động với hiệu suất cao (công nghệ lên men). 5 2- Công nghệ tế bào (tế bào động vật và thực vật): Công nghệ nhằm tạo điều kiện cho các tế bào động thực vật phát triển tốt trong các môi trường xác định và an toàn. Công nghệ chủ yếu của công nghệ tế bào là kỹ thuật nuôi cấy mô. 3- Công nghệ gen là công nghệ nền, cải biến chủng giống nhằm nâng cao hiệu suất của chủng giống sản xuất và đa dạng hóa sản phẩm sinh học. Công nghệ sinh học vi sinh vật học trở thành nền tảng cho sự phát triển của công nghệ sinh học theo 3 giai đoạn: Giai đoạn 1. Công nghệ sinh học truyền thống là các quá trình dân dã nhằm chế biến, bảo quản các loại thực phẩm, xử lý đất đai, phân bón để phục vụ nông nghiệp... Hình 1.1: Mô hình cây công nghệ sinh học. Giai đoạn 2. Công nghệ sinh học cận đại là quá trình sử dụng các nồi lên men công nghiệp để sản xuất ở quy mô lớn các sản phẩm sinh học như mỳ chính, axit amin, axit hữu cơ, dung môi hữu cơ, chất kháng sinh, một số vitamin (như vitamin B2, B12, C...), nhiều loại enzyme... Giai đoạn 3. Công nghệ sinh học hiện đại chia ra các lĩnh vực như: Công nghệ di truyền (genetic engineering), công nghệ tế bào (cell engineering), công nghệ enzyme và protein (enzymprotein engineering), công nghệ vi sinh vật/ công nghệ lên men (microbial engineering/ fermentation), công nghệ môi trường (environmental engineering). Công nghệ sinh học hiện đại thường gắn liền với các cơ thể mang gene tái tổ hợp (recombination gene). Như vậy, công nghệ sinh học vi sinh vật hay còn gọi là công nghệ vi sinh vật là ngành công nghệ nhằm khai thác tốt nhất khả năng kỳ diệu của vi sinh vật. Vi sinh vật được coi là nhà máy cực kỳ nhỏ và tinh vi, mà nhiệm vụ của công nghệ vi sinh vật là tạo ra các điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật hoạt động với hiệu suất cao nhất. Chính vì vậy, trước đây ngoài ngành vi sinh vật học đại cương người ta còn phát triển thành ngành vi sinh vật công nghiệp. Chỉ từ khi công nghệ sinh học hình thành thì người ta cũng coi đây là ngành công nghệ vi sinh vật, mà điều kiện thuận lợi để cho các vi sinh vật hoạt động với hiệu suất cao nhất chính là điều kiện nuôi cấy vi sinh vật. Về bản chất của công nghệ sinh học vi sinh vật chính là công nghệ lên men. Trong công nghệ sinh học, khái niệm công nghệ lên men được sử dụng theo nghĩa rộng, nghĩa là không chỉ sử dụng các vi sinh vật lên men (fermentative microorganisms) lên men trong điều kiện kỵ khí tạo ra các sản phẩm lên men truyền thống, mà sử dụng cả các vi sinh vật hiếu khí, các tế bào động vật và thực vật lên men trong các nồi lên men và nồi phản ứng sinh học có sục khí để sinh tổng hợp các sản phẩm mong muốn, còn được gọi là lên men sinh tổng hợp. 6 1.1.2. Sơ lược lịch sử phát triển của công nghệ lên men 1.1.2.1. Các giai đoạn phát triển của công nghệ lên men ứng dụng Giai đoạn 1: Thời kỳ trước Pasteur (đến 1865) Con người ứng dụng tiềm năng của vi sinh vật sản xuất các sản phẩm khi còn chưa nhận thức được sự tồn tại của chúng trong tự nhiên như sản xuất đồ uống chứa rượu, như rượu vang, bia, sản xuất thực phẩm lên men như muối chua rau quả, ủ chua thức ăn cho gia súc… Khoảng 7000 năm trước Công nguyên, nho bắt đầu được trồng, và sau đó, rượu vang bắt đầu được sản xuất. Các nhà khảo cổ cũng tìm được một số dụng cụ mà họ cho là dùng để sản xuất rượu, bia có niên đại 6000 đến 5000 năm trước Công nguyên ở Georgia, Iran và Ai Cập. Lên men sữa để sản xuất sữa chua (lên men lactic) xuất hiện ở Babylon vào khoảng 3500 năm trước Công nguyên. Trong khoảng từ năm 200 trước Công nguyên đến năm 200, thêm nhiều sản phẩm lên men ra đời: Rau muối chua, phô mai, tương và một số sản phẩm từ đậu nành như tương nén (tempeh) ở Indinesia, tương miso ở Nhật Bản,... Đầu thế kỷ 17, Jan Baptist van Helmont quan sát thấy rằng cặn của rượu vang cũng có thể dùng để lên men rượu được và ông gọi chất cặn này là "fermentum". Thuật ngữ này có xuất xứ La tinh, có thể là “fervere” nghĩa là sôi, cũng có thể là “ferveo” nghĩa là sủi bọt (vì khi lên men rượu, bề mặt của dịch lên men xuất hiện rất nhiều bọt như sôi). Ông cũng nhận xét rằng chất khí thoát ra trên bề mặt dịch lên men cũng chính là chất khí tạo ra khi đốt than. Vào đầu thế kỷ 17, một dụng cụ mới ra đời và tạo điều kiện cho sự phát triển mạnh mẽ của sinh học, đó là kính hiển vi quang học. Nhờ dụng cụ này ta có thể tìm hiểu cấu trúc của sinh vật một cách cặn kẽ hơn. Một trong những nhân vật có những đóng góp đáng kể trong lĩnh vực này là Anton Philips van Leeuwenhoek. Ông là một người chuyên mài tinh chế các thấu kính dùng để chế tạo kính hiển vi và cũng là một người chế tạo kính hiển vi. Ông cũng có thói quen ghi chép những gì quan sát được và tìm cách giải thích chúng. Bằng cách này ông ta trở thành một nhà nghiên cứu khoa học nghiệp dư. Tuy vậy, các công trình này cũng rất có giá trị và được các nhà nghiên cứu khác coi trọng và khối lượng nghiên cứu cũng rất đáng kể (560 báo cáo được ghi nhận). Năm 1675 van Leeuwenhoek, đã quan sát được vi sinh vật và các hoạt động của chúng. Ông được xem như là người phát minh ra vi sinh vật học. Năm 1836, Dore Schwann đã khám phá ra nguyên nhân của lên men rượu là do sinh vật đơn bào sử dụng đường, mà ông gọi tên là “nấm đường” (Saccharomyces). Sau đó, Charles Caignard de Latour xác định loại sinh vật đơn bào này là nấm men, sử dụng đường để sinh ra rượu và CO2, sinh sản bằng cách nẩy chồi. Đặc trưng của giai đoạn một là lên men truyền thống (Traditional fermentation), các quá trình lên men tạo ra các sản phẩm lên men nhờ vi sinh vật, được sản xuất thủ công, mang sắc thái kinh nghiệm và bản sắc riêng của từng dân tộc. Giai đoạn 2: Thời kỳ sau Pasteur (1865-1940) Giai đoạn này được xem là giai đoạn phát triển của công nghiệp lên men, bao gồm các công trình của Pasteur (1865) về lên men và học thuyết về mầm bệnh, Pasteur cũng đã đề ra phương pháp thanh trùng Pasteur để khử trùng rượu nho, bia mà không làm hỏng phẩm chất, mà ngày nay vẫn được sử dụng trong công nghệ thực phẩm. Bởi vậy, Pasteur được coi là người sáng lập ra vi sinh vật công nghiệp. Cũng trong giai đoạn này, sự phát triển của hoá 7 sinh học với các kiến thức về trao đổi chất trung gian đã phát hiện và làm chủ việc phát hiện và sử dụng các loại enzyme trong sản xuất công nghiệp. Năm 1854, Louis Pasteur, bác bỏ Thuyết tự sinh (Hình 1.2 và 1.3) tìm ra mối liên hệ giữa lên men và nấm men. Ông kết luận rằng loại vi sinh vật này đã sử dụng cơ chất là đường có sẵn trong nho để chuyển hóa thành rượu và trong điều kiện kỵ khí. Từ đó, thuật ngữ lên men (fermentation) còn có một nghĩa khác là sự hô hấp trong điều kiện kỵ khí. Pasteur cũng nhận thấy rằng, nếu sau khi đã lên men đạt yêu cầu, ta đun nóng thì rượu vang sẽ bảo quản được lâu hơn nhiều. Kỹ thuật xử lý nhiệt này sau đó được mang tên ông: Khử trùng Pasteur (pasteurization). Hình 1.2: Luis Pasteur (1822-1895) Hình 1.3: Thí nghiệm của Louis Pasteur bác bỏ thuyết tự sinh. Tuy một số quá trình được thực hiện ở quy mô rộng rãi, nhưng những sự thành công đó còn phụ thuộc vào sự ngẫu nhiên hay kinh nghiệm của những người thợ giỏi truyền cho các thế hệ sau. Vai trò của vi sinh vật trong sự chuyển hóa các chất hữu cơ được con người biết đến khoảng hơn 100 năm trước đây. Năm 1883, Emil Christian Hansen, nhà thực vật học người Dan Mạch, đã đi sâu nghiên cứu về nấm học và sinh lý lên men, đã làm cuộc cách mạng về công nghiệp lên men bia bằng phát minh của mình về phương pháp nuôi cấy chủng nấm men thuần khiết. Như vậy, việc nghiên cứu và sử dụng các chủng Hình 1.4: Christian Hình 1.5: Eduard nấm men thuần khiết Saccharomyces Buchner (1860-1917) Hansen (1842-1909) carlsbergensis trong sản xuất bia có thể xem là bước mở đầu cho công nghiệp lên men dựa trên cơ sở khoa học. Công nghệ sinh học đã bắt đầu với ngành sản xuất bia. Vào thời đó, Đức là một quốc gia tiêu thụ rất nhiều bia. Sản xuất loại thức uống có cồn này là một ngành có lợi nhuận lớn, mặt khác thuế đánh trên mặt hàng này cũng đóng góp phần không nhỏ vào ngân sách nhà nước. Điều này đã thúc đẩy các nghiên cứu có chiều sâu về quá trình lên men bia và tìm cách ứng dụng vào công nghiêp. Trung tâm nghiên cứu nổi tiếng nhất về lĩnh vực này là Viện Carlsberg đã tìm ra nhiều quy trình rất đặc biệt để nấu bia. 8 Năm 1897, Eduard Buchner - nhà hóa học và men học đã khám phá ra nguyên nhân sâu xa hơn của sự lên men. Ông đã dùng các chất chiết từ nấm men sau khi đã nghiền và lọc qua phễu lọc sứ (sau này gọi là phễu Buchner) để lên dịch quả vô trùng thành rượu mà không cần tế bào nấm men sống và đã đi đến kết luận là sự chuyển hóa các loại đường có trong dịch quả thành rượu có bản chất hóa học mà không phải là sinh học. Buchner cũng khám phá ra rằng chất do nấm men tiết ra để chuyển đường thành rượu có bản chất là protein và ông gọi đó là “zymase” và từ đó tiếp vĩ ngữ “ase” được dùng để chỉ enzyme. Ông cũng đã nhận được Giải thưởng Nobel về Hóa học năm 1907. Trong Thế chiến thứ nhất, do chiến tranh và sự cấm vận mà sự cung cấp các nhu yếu phẩm cho con người cũng như nguyên liệu cho công nghiệp bị giảm sút. Các nhà khoa học đã tham gia để giải quyết vấn đề này và công nghệ sinh học bắt đầu phát triển mạnh. Đức đã sử dụng sinh khối từ quá trình lên men để thay thế 60% thức ăn gia súc mà trước đó họ phải nhập khẩu, sản xuất axit lactic, aceton, butanol,... Năm 1917, James Currie, khám phá ra rằng một số chủng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng tạo axit citric rất tốt và ngay lập tức Công ty Pfizer đã sản xuất axit này ở quy mô công nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt. Đặc trưng của giai đoạn thứ hai là sự hiểu biết về hoạt tính của vi sinh vật, vai trò của vi sinh vật trong lên men sản xuất đồ uống có cồn, giai đoạn được đánh dấu bằng việc đặt cơ sở khoa học cho quá trình lên men sản xuất lớn các sản phẩm lên men truyền thống. Giai đoạn 3. Thời kỳ phát triển lên men công nghiệp (1941-1970) Đây là giai đoạn phát triển công nghiệp kháng sinh, hóa chất và kiểm soát môi trường, bao gồm sự xuất hiện của các chất kháng sinh, những tiến bộ về di truyền học trong việc chọn lọc các thể đột biến vi khuẩn, sự nghiên cứu các điều kiện lên men tối ưu, kỹ thuật học lên men, việc tách và tinh chế sản phẩm... Hình 1.6: Ngài Alexander Năm 1928, Alexander Fleming - nhà vi sinh vật học, Fleming (1881-1955). sinh lý học và dược học người Scotland, người đã phát minh ra lysozym năm 1923, đã khám phá rằng các chất benzylpenicillin (penicillin G) từ nấm mốc Penicillium notatum có khả năng tiêu diệt một số vi sinh vật gây bệnh rất hiệu quả. Đến 1940, penicillin, chất kháng sinh đầu tiên được sản xuất ở quy mô công nghiệp bằng phương pháp lên men và được ứng dụng rất hiệu quả trong y học. Ông đã cùng Howard Florey and Ernst Boris Chain nhận Giải Hình 1.7: Selman A. Waksman tại phòng thưởng Nobel về sinh lý học và y học năm thí nghiệm, Đại học Rutgers, nơi nghiên 1945. Ông cũng có nhiều công trình công bố cứu phát minh ra chất kháng sinh về vi sinh vật học, miễn dịch học và hóa trị actinomycin, 1940. liệu. Từ đó đã mở ra hướng ứng dụng lên men 9 để sản xuất các loại kháng sinh và hàng loạt các chất khác như steroid, vitamin. Nhiều năm sau này, những phát minh penicillin, streptomycin và phát triển thương mại các chất này được xem khởi đầu cho kỷ nguyên kháng sinh. Ngay từ những năm 1940, Selman A. Waksman, nhà vi sinh vật đất tại Trường Đại học Rutgers (Mỹ) đã thành công trong lĩnh vực kháng sinh nhờ phát minh ra nhiệu chất kháng sinh mới từ vi khuẩn sợi (xạ khuẩn) như actinomycin D, neomycin, và đặc biệt là một loại “thuốc tuyệt vời” và nổi tiếng đó là streptomycin. Kết hợp với việc phát triển các quá trình công nghiệp giữa các trường đại học Rutgers, Princeton, Columbia và Merck & Co., Inc. đã sinh ra lĩnh vực mới kỹ thuật sinh hóa (biochemical engineering). Sau đó nhiều chất kháng sinh từ xạ khuẩn được phát hiện và trở thành “thuốc tuyệt vời” như chloramphenicol (1947), tetracyclin (1948), các kháng sinh macrolid như erythromycin (1952), các kháng sinh glycopeptid như vancomycin (năm 1956), các kháng sinh aminoglycosid như gentamicin (1963), các kháng sinh β-lactam như cephamycin (1970) và carbapenem (1979), các kháng sinh ansamycin như rifamycin (1957) và các kháng sinh polyen như nystatin (1950). Gần 15.000 chất trao đổi thứ cấp được phát hiện, trong đó có khoảng 12.000 chất kháng sinh, trong đó khoảng 70% từ xạ khuẩn, còn vi khuẩn chiếm 10% và nấm mốc chiếm 20%. Năm 1957, bột ngọt (monosodium glutamat) được Ajinomoto đưa vào sản xuất ở quy mô lớn bằng phương pháp lên men. Đặc trưng của giai đoạn thứ ba là sự phát triển của một nền công nghiệp vi sinh vật độc lập. Người ta đã điều khiển được các quá trình siêu tổng hợp ở vi sinh vật và tạo ra được hàng loạt các chủng đột biến. Nhờ đó đã sản xuất ở quy mô lớn các chất kháng sinh, mỳ chính, lysine và nhiều loại axit amin khác. Giai đoạn 4. Giai đoạn phát triển công nghệ sinh học hiện đại (1980 đến nay) Nhờ các phát minh ra hiện tượng biến nạp (transformation) của Griffith (1928) và hiện tượng tiếp hợp của Lederberg và Tatum (1946), chứng minh vật liệu di truyền là DNA của Avery, MacLeod (1944), khám phá ra cấu trúc của DNA của Watson và Crick (1953) và phát hiện sự điều hoà tổng hợp protein của Jacob & Monod (1957) đã đặt nền móng cho kỹ thuật di truyền. Từ năm 1973, Berg, Boyer & Cohen đề xuất kỹ thuật di truyền. Sau khi phát hiện ra enzyme cắt giới hạn (restrictase) của Nathans, Smith & Arber (1971), enzyme sao chép ngược của Dulbecco, Temin, Baltimore (1975) và enzyme endonuclease giới hạn của Werner Arber (1978) đã đề xuất ra công nghệ DNA tái tổ hợp dựa trên phát triển công nghệ gene. Hình 1.8: Chọn dòng (cloning) gen bằng Như vậy, giai đoạn này được được đánh dấu plasmid ứng dụng trong công nghệ sinh bằng sự phát hiện ra các enzyme cắt giới hạn học. restrictase và các plasmid với sự gắn các 10 gene lạ mang các thông tin tổng hợp các protein đặc biệt vào một cơ thể đã trở thành một phương pháp thông dụng và sự kiểm soát ngày càng tốt hơn sự biểu hiện của các gene này. Từ những nghiên cứu sâu về bộ gene (genome) của vi khuẩn, người ta đã lập được bản đồ gene giới hạn của nhiều loài vi sinh vật và cũng từ đó đã thiết lập được Ngân hàng gene của nhiều loài sinh vật. Với những nghiên cứu sâu sắc về genome của vi sinh vật đã góp phần phát triển mạnh mẽ ngành công nghệ sinh học (Hình 1.8). Ngược lại, cũng nhờ những thành công của công nghệ di truyền đã góp phần phát triển mạnh mẽ công nghệ vi sinh vật. Ngày nay, sản xuất penicillin và cephalosporin công nghiệp vẫn được lên men bằng các chủng của loài Penicillium chrysogenum và Aspergillus chrysogenum. Hầu hết các chủng sản xuất được tuyển chọn bằng đột biến có định hướng. Ví dụ, năm 1972, chủng P. chrysogenum của hãng Panlabs chỉ đạt 20.000 đv/ml sau 7 ngày lên men (tương đương 12 mg penicillin G, Na/ml), năm 1990, chủng cải biến đã đạt 70.000 đv/ml, năm 1993, đạt 100.000 đv/ml tăng 500 lần so với chủng P. chrysogenum NRRL 1951 sản xuất ở mức độ công nghiệp đầu tiên năm 1951. Hiện nay, các chủng sản xuất penicillin công nghiệp có hiệu suất rất cao khoảng 150.000đ v/ml môi trường lên men. Do hiệu suất tăng, nên giá thành penicillin G trên thế giới ngày càng hạ. Công nghệ di truyền đã được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong lĩnh vực y tế, bảo vệ sức khỏe con người. Từ những năm 1980, cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, của kỹ thuật gene, người ta có thể tạo ra các chủng vi sinh vật có những tính chất công nghệ tốt, thì kỹ thuật lên men càng phát triển mạnh, ứng dụng của lên men được mở rộng và sản phẩm của lên men trở nên rất đa dạng. Đặc trưng của giai đoạn thứ tư là các quá trình lên men theo hướng công nghệ sinh học tiến tới sản xuất các sản phẩm ở cấp độ công nghiệp sinh học, không những đa dạng các loại sản phẩm mà còn nâng cao hiệu quả kỹ thuật, hiệu quả kinh tế, chất lượng của sản phẩm đáp ứng yêu cầu của thị trường. 1.1.2.2. Một số thành tựu nổi bật hiện nay của công nghệ vi sinh vật 1. Đối với y học - Sản xuất vaccin thế hệ mới: Vaccin ribosom, vaccin kỹ thuật gene, vaccin tạo ra từ các thành phần của virus... có rất nhiều ưu điểm: Rất an toàn vì không sử dụng trực tiếp vi sinh vật gây bệnh; giá thành hạ vì không phải nuôi virus trên phôi gà hay các tổ chức mô động vật vốn rất phức tạp và tốn kém, giảm bớt được chi phí vận chuyển và chi phí kiểm tra trước khi dùng. Vaccin ribosome được chế tạo từ ribosome của từng loại vi khuẩn gây bệnh, ít độc và tính miễn dịch cao; vaccin các mảnh virus được chế tạo từ glycoprotein của vỏ virus gây bệnh như gây bệnh cúm và vaccin tái tổ hợp được chế tạo từ vi khuẩn hay nấm men tái tổ hợp, có mang gene mã hoá việc tổng hợp protein kháng nguyên của virus hay vi khuẩn gây bệnh nào đó. - Sản xuất Insulin: Việc sản xuất insulin ở quy mô công nghiệp có lẽ là một trong những thành công rực rỡ và sớm nhất của công nghệ gen. Trước đây để có 100g insulin từ tụy tạng 4000-5000 con bò, do vậy giá thành cao và cũng có bệnh nhân không nhạy cảm với protein tách chiết từ động vật. Bằng kỹ thuật di truyền thông qua vi khuẩn E. coli đã thu nhận được một lượng lớn insulin. Dung tích nồi lên men 1000 lit, sau một thời gian ngắn nuôi cấy có thể thu được 200g insulin, tương đương với lượng insulin chiết xuất từ 8.000 đến 10.000 con bò. 11 Thành công này hết sức có ý nghĩa và lý thú vì gene của con người có thể làm việc một cách có hiệu quả trong genome của vi sinh vật. - Sản xuất Interferon: Interferon có bản chất protein, là yếu tố miễn dịch không đặc hiệu, là chất giúp cơ thể có thể chống lại nhiều loại bệnh (có phổ tác dụng kháng virus rộng). Để thu nhận interferon, người ta phải tách chiết chúng từ máu người nên rất tốn kém. Bằng phương pháp tương tự như insulin, hiện nay người ta có thể điều chế một lượng lớn interferon thông qua cơ thể vi sinh vật đã được tái tổ hợp gene để phục vụ cho việc điều trị bệnh nhiễm trùng. Trước đây, người ta đã sử dụng tế bào E. coli tái tổ hợp, thì ngày nay người ta đã sử dụng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp để thu nhận interferon và có hiệu suất cao gấp 10.000 lần so với E. coli. - Sản xuất các chất kháng sinh: Chất kháng sinh là một trong những loại thuốc thường xuyên sử dụng trong điều trị bệnh, nhưng do sử dụng thuốc bừa bãi, nên nhiều loại thuốc không còn hiệu quả do vi sinh vật nhờn thuốc. Ngày nay, ngoài việc tìm kiếm các loại kháng sinh từ tự nhiên mới, người ta sử dụng kỹ thuật di truyền tạo những chủng sản sinh các chất kháng sinh có đặc tính chữa bệnh mới, các chất kháng sinh bán tổng hợp. 2. Đối với nông nghiệp - Tạo chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi sinh vật: Từ lâu, người ta đã sử dụng vi khuẩn Bacillus thurigiensis để chống sâu hại hoa màu. Tuy nhiên, chỉ hạn chế ở sâu xanh. Hiện nay, nhờ công nghệ di truyền, người ta đã cải tạo nhiều nòi của loài này có khả năng diệt nhiều loại sau khác như sâu khoang, ấu trùng muỗi v.v... Người ta đã xây dựng hàng loạt các nhà máy sản xuất chế phẩm vi sinh vật diệt côn trùng, nhằm khắc phục sử dụng thuốc hoá học ảnh hưởng xấu đến cây trồng và gây ô nhiễm môi trường sinh thái. - Sản xuất phân bón cho cây trồng: Phân bón hữu cơ vi sinh đã mang lại hiệu quả kinh tế cao, không những tạo độ phì cho đất, nâng cao năng suất cây trồng, mà góp phần cân bằng sinh thái, bảo vệ môi trường. Nhiều loại vi sinh vật được sử dụng để tạo phân bón vi sinh: Azotobacterin, nitragin, phosphorin,... góp phần tăng năng suất cây trồng. 3. Đối với bảo vệ môi trường - Giải quyết vấn đề năng lượng phục vụ con người: Nguồn năng lượng truyền thống (như than đá, thuỷ điện, dầu khí) ngày càng cạn dần và thậm chí có nơi lại không có nguồn tài nguyên này. Công nghệ vi sinh vật đã góp phần đưa thêm nguồn năng lượng mới. Cồn (etanol được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền như dịch thuỷ phân gỗ và cellulose, đường và rỉ đường. Khí sinh học (biogas): Biogas thường chứa khoảng 60-80% khí metan (CH4) từ các phụ, phế phẩm nông nghiệp, các loại rác thải giàu cellulose cùng với phân, nước tiểu của người và gia súc, gia cầm. - Bảo vệ môi trường, tạo cân bằng sinh thái: Công nghệ vi sinh vật đã tích cực tham gia giải quyết một số vấn đề thuộc lĩnh vực này nhằm giúp con người bảo vệ môi trường như sử dụng thuộc tính quý báu của vi sinh vật có khả năng phân giải các chất khó phân huỷ như hydrocarbon, các chất hữu cơ khó phân giải để thực hiện quá trình xử lý nước thải, chất thải. Ngoài công tác chọn giống vi sinh vật từ tự nhiên, bằng kỹ thuật di truyền, người ta đã tuyển chọn những chủng có hoạt tính phân giải cao, phân huỷ được những chất khó phân huỷ như dầu mỏ, thuốc trừ sâu,... 12 Kết quả của quá trình xử lý này góp phần làm cho môi trường trong sạch hơn, tạo được sự cân bằng sinh thái. 1.1.3. Đặc điểm của các quá trình lên men 1.1.3.1. Đặc điểm 1. Nhiều loại sản phẩm sản sinh trong dịch lên men Về thực chất, biến đổi của cơ chất do tác động của enzyme do vi sinh vật tạo ra, thường không tạo ra một enzyme mà nhiều enzyme khác nhau. Do đó, sản phẩm của quá trình lên men gồm nhiều thành phần, bên cạnh thành phần chính, còn có một số thành phần phụ. Điều này làm cho mỗi một sản phẩm lên men sẽ có những nét đặc trưng khác nhau, thí dụ hương vị đặc trưng của từng loại bia. 2. Vi sinh vật hoạt động giữa các pha trong môi trường lên men Nếu trong dịch lên men có tồn tại nhiều pha, thí dụ như lỏng-khí, thì vi sinh vật thường hoạt động ở bề mặt giao tiếp giữa các pha. Như vậy, việc làm gia tăng diện tích tiếp xúc giữa các pha là một yêu cầu quan trọng. Thường thì pha lỏng là một dung dịch nước. 3. Sự phù hợp nồng độ cơ chất và sản phẩm trong môi trường lên men Nồng độ của cơ chất và sản phẩm trong thiết bị lên men thường không cao. Một trong các lý do quan trọng là nồng độ cao của các chất này có thể ức chế quá trình lên men (thí dụ hàm lượng đường cao hay rượu cao đều ảnh hưởng xấu đến lên men rượu). Một lý do khác là nồng độ tối ưu của cơ chất và sản phẩm cho sự hoạt động của vi sinh vật thường trong một khoảng tương đối hẹp. 4. Sự thích ứng của vi sinh vật với môi trường lên men Vi sinh vật có thể điều chỉnh (trong một phạm vi nhất định) các tiến trình bên trong cơ thể mình để đáp ứng với môi trường bên ngoài. Như vậy, cho ta thấy một mặt, quá trình lên men có tính khá linh hoạt có thể đáp ứng với một số biến động của môi trường lên men, mặt khác môi trường lên men có thể có những tác động đáng kể đến sản phẩm thu được. Nho trên cùng một thửa ruộng, thu hoạch trong hai năm khác nhau sẽ có chất lượng vang khác nhau, ngay cả khi các điều kiện khác về lên men đều được giữ giống hệt nhau. 5. Sự thích ứng của vi sinh vật với điều kiện lên men Các chủng vi sinh vật dùng trong công nghiệp lên men thường khá nhạy cảm với môi trường (pH, nhiệt độ, lượng oxy,…). Do đó, việc duy trì môi trường và điều kiện lên men tối ưu là công việc rất quan trọng. Hiện nay việc duy trì này thường được thực hiện một cách tự động bởi các hệ thống đo lường và điều khiển tiên tiến. 6. Sự thoái hóa của chủng giống sản xuất Các chủng giống vi sinh vật bị thoái hóa sau khi hoạt động một thời gian, tính chất của vi sinh vật bị thay đổi theo chiều hướng xấu đi, năng suất và chất lượng của sản phẩm bị giảm đi. Nếu sử dụng các phương pháp lên men liên tục thì thời gian hoạt động liên tục cũng bị hạn chế, không thể dài như nhiều ngành công nghiệp khác. 1.1.3.2. Ưu điểm và hạn chế của lên men 1. Ưu điểm So với các chuyển hóa được thực hiện bằng phương pháp hóa học, ta thấy lên men có một số điểm vượt trội sau: 13 - Điều kiện phản ứng ôn hòa hơn: Nhiệt độ, áp suất và pH của môi trường lên men thường trong khoảng giá trị của môi trường tự nhiên, do đó ôn hòa hơn khá nhiều so với các phản ứng hóa học. Nhờ vậy, chi phí năng lượng để sản xuất chỉ ở mức thấp. - Số giai đoạn để chuyển hóa nguyên liệu thành sản phẩm trong lên men thường ít hơn so với sản xuất hóa học. Phần lớn các biến đổi chính thường chỉ xẩy ra tại thiết bị lên men. - Nguyên liệu trong lên men thường có nguồn gốc tự nhiên, chủ yếu là các sản phẩm từ sản xuất nông nghiệp, như ngũ cốc, thậm chí là phế phẩm như mật rỉ. Do đó thường có sẵn và có khả năng tái tạo được. - So với phương pháp hóa học, chất thải của lên men ít độc hại hơn, kỹ thuật xử lý các chất thải này cũng dễ dàng hơn, cho nên ảnh hưởng đến môi trường ít hơn nhiều so với công nghiệp hóa học Từ các đặc điểm trên, chi phí để sản xuất thường không cao, giá thành của sản phẩm thấp. Đổi với thực phẩm, các sản phẩm lên men thường có giá trị dinh dưỡng cao hơn so với nguyên liệu ban đầu: nhiều chất bổ dưỡng hơn, nhiều vitamin hơn, dễ tiêu hóa hơn, ít độc tố và chất kháng dinh dưỡng hơn. 2. Hạn chế - Do các tiến trình trong vi sinh vật khá nhạy cảm với điều kiện môi trường nên để sản xuất một sản phẩm có các tính chất ổn định, ta cần khống chế điều kiện và môi trường lên men một cách rất chặt chẽ. Đây là một điều khó khăn do phải theo dõi và điều khiển khá nhiều thông số cùng một lúc. - Việc giữ cho môi trường lên men không bị tạp nhiễm là việc tương đối khó khăn vì vi sinh vật tồn tại ở mọi nơi. - Trong lên men ở quy mô lớn, việc duy trì sự đồng nhất trong toàn bộ thiết bị lên men là một việc phức tạp, khó thực hiện. 1.1.4. Khái niệm về lên men công nghiệp Việc sử dụng các quá trình lên men sản xuất các thực phẩm lên men nhờ vi sinh vật có nguồn gốc từ xa xưa, thường được sản xuất thủ công, nhỏ lẻ và mang sắc thái kinh nghiệm và bản sắc riêng của từng dân tộc. Sau đó, do nhu cầu thị trường, nhiều sản phẩm được sản xuất với số lượng lớn có tính chất thương mại với độ phức tạp và giá cả đa dạng như cồn sinh học, các loại axit hữu cơ, enzyme, vaccin và protein trị liệu, thì nhiều sản phẩm lên men mới được được sản xuất với số lượng lớn theo hướng công nghiệp. Lên men công nghiệp là việc sử dụng có chủ đích quá trình lên men các vi sinh vật cũng như các tế bào động vật và thực vật, để tạo ra các sản phẩm có ích cho con người. Các nguyên tắc công nghiệp cơ bản và thiết kế quy trình tương tự nhau trong tất cả các ứng dụng, nhưng sự thích nghi về khía cạnh sinh học, kỹ thuật, kinh tế và môi trường cần thiết cho mỗi sản phẩm là điểm cơ bản của quá trình lên men công nghiệp (xem mục 4.1, chương 4). Quá trình lên men được thực hiện trong các thiết bị lên men hoặc bình phản ứng sinh học lớn, thường có thể tích vài nghìn lít. Lên men công nghiệp là một phần của nhiều ngành công nghiệp, bao gồm vi sinh, thực phẩm, dược phẩm, công nghệ sinh học và hóa chất. Các sản phẩm lên men được ứng dụng trong thực phẩm cũng như trong ngành công nghiệp nói chung, ví dụ một số hóa chất thương phẩm như axit acetic, axit citric và etanol được tạo ra bằng cách lên men, thì tốc độ lên men phụ thuộc vào nồng độ vi sinh vật, tế bào, 14 thành phần tế bào và enzyme cũng như nhiệt độ, pH và oxy cho quá trình lên men hiếu khí, việc thu hồi sản phẩm thường liên quan đến nồng độ của dung dịch loãng; các enzyme được sản xuất thương mại, như lipase, invertase và rennet, gần như được tạo ra bằng cách lên men với vi sinh vật biến đổi gene và trong một số trường hợp, mục tiêu sản xuất lại là sinh khối, như protein đơn bào, nấm men bánh mỳ và vi khuẩn axit lactic để sản xuất pho mát. Nói chung, quá trình lên men có thể được chia thành bốn loại: (1) Sản xuất sinh khối (vật liệu tế bào sống được), (2) Sản xuất các chất trao đổi ngoại bào (hợp chất hóa học), (3) Sản xuất các thành phần nội bào (enzyme và các protein khác) và (4) Chuyển hóa cơ chất (trong đó cơ chất được biến đổi chính là sản phẩm). Tuy những quá trình lên men này không phải khác biệt nhau, mà cung cấp cho ta cơ sở để hiểu sự khác biệt trong cách tiếp cận khi sử dụng các sinh vật có thể là vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, tảo, tế bào động vật hoặc tế bào thực vật, trong quá trình lên men với các điều kiện lên men khác nhau như mức độ oxy hòa tan, mức độ dinh dưỡng, pH môi trường và nhiệt độ nuôi cấy. Trong hầu hết các quá trình lên men công nghiệp, các vi sinh sinh vật hoặc tế bào thực vât và động vật nuôi cấy trong môi trường lỏng hoặc lên men diễn ra trên bề mặt ẩm của môi trường xốp. Ngoài ra, cần quan tâm đến quá trình sản xuất công nghiệp liên quan đến quá trình lên men, như để tránh ô nhiễm quá trình nuôi cấy, môi trường lên men, không khí và thiết bị lên men phải được khử trùng; kiểm soát bọt có thể đạt được bằng cách phá hủy bọt cơ học hoặc các chất chống tạo bọt hóa học hoặc đo và kiểm soát áp suất, nhiệt độ, tốc độ khuấy và độ nhớt của thiết bị lên men. Yếu tố quan trọng đối với quá trình lên men công nghiệp là nâng cấp quy mô lên men từ quy trình trong phòng thí nghiệm sang quy trình công nghiệp. Trong lĩnh vực vi sinh vật học công nghiệp đã chứng minh những gì hoạt động tốt ở quy mô phòng thí nghiệm có thể hoạt động kém hoặc hoàn toàn không hoạt động khi thử lần đầu tiên ở quy mô lớn, cho nên không thể lấy các điều kiện lên men đã hoạt động trong phòng thí nghiệm áp dụng ngay cho các thiết bị quy mô công nghiệp, mà phải nâng cấp từ quy mô phòng thí nghiệm sang quy mô sản xuất thử (pillot) đạt yêu cầu mới chuyển sang quy mô sản xuất công nghiệp. Một quy trình lên men công nghiệp thành công đòi hỏi đội ngũ chuyên gia đa ngành kết hợp các nguyên tắc sinh học và các kỹ thuật để phát triển và mở rộng quy mô các quy trình lên men. Đội ngũ này tham gia vào việc phân lập và sử dụng các loại vi sinh vật cần thiết cho sản xuất công nghiệp, như môi trường và điều kiện nuôi cây thích hợp, thiết kế thiết bị lên men và xây dựng các phương pháp và điều kiện tốt nhất để thu hồi sản phẩm sinh học. Như vậy, mục đích của lên men công nghiệp là các kết quả nghiên cứu công nghệ tất cả các giai đoạn liên quan đến quá trình lên men từ phân lập và cải biến các chủng giống ứng dụng công nghiệp, tạo môi trường nuôi cấy thích hợp và tối ưu hóa điều kiện lên men, thiết kế và điều kiện hoạt động thiết bị lên men (hay thiết bị phản ứng sinh học), xây dựng kỹ thuật tách chiết và thu hồi sản phẩm sinh học. 1.2. Mục đích của quá trình lên men 1.2.1. Đảm bảo yêu cầu và chất lượng sản phẩm lên men 15 Mục đích của quá trình lên men là đáp ứng được yêu cầu đặt ra cho lên men một sản phẩm cụ thể đáp ứng được yêu cầu sản xuất. Để quá trình lên men vận hành ổn định, đạt hiệu quả, năng suất cao, chất lượng tốt, chi phí thấp, ta cần đáp ứng các yêu cầu sau: - Chủng vi sinh vật dùng trong lên men phải có hoạt tính mạnh, ổn định. Thông thường các vi sinh vật đã được tuyển chọn, thuần hóa và cải biến để phù hợp với điều kiện lên men sản xuất. - Vi sinh vật cần được cung cấp đầy đủ các dưỡng chất cho sự sinh trưởng, phát triển và sinh tống hợp các sản phẩm mong muốn. Các dưỡng chất này gồm các nguồn cung cấp cacbon, nitơ, vitamin, khoáng cũng như các nguyên tố vi lượng khác. - Môi trường lên men cần được duy trì thường xuyên ở điều kiện tối ưu. Các thông số như nhiệt độ, áp suất, pH, lượng oxy phải được thường xuyên theo dõi và khống chế ở giá trị tối ưu. - Cần phải có những biện pháp để có sự đồng nhất trong toàn bộ môi trường lên men. Điều này đặc biệt quan trọng khi thiết bị lên men có kích thước lớn, các thành phần của môi trường lên men có khối lượng riêng chênh lệch đáng kể. - Cần hạn chế sự nhiễm tạp đến mức thấp nhất. Môi trường lên men, thiết bị lên men, các thiết bị phụ trợ, không khí cần được khử trùng một cách nghiêm ngặt. 1.2.2. Ứng dụng của các quá trình lên men Quá trình lên men phụ thuộc vào việc ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm trong từng lĩnh vực cụ thể mà trước đây do các ưu điểm của lên men nên từ chỗ chỉ được dùng trong chế biến thực phẩm, ngày nay kỹ thuật này được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Sau đây là một số hướng ứng dụng chính như sau: 1. Trong công nghệ thực phẩm Thực phẩm được xem là một ứng dụng truyền thống của lên men. Với phương pháp này ta có thể tạo ra nhiều loại thực phẩm khác nhau. Theo Takabio, trên thế giới có khoảng 3500 loại thực phẩm được sản xuất bằng các phương pháp lên men truyền thống. Các nhóm sản phẩm chính là: (a) Thức uống có cồn như rượu, bia; (b) Các sản phẩm sữa: sữa chua, phô mai, (c) Các sản phẩm từ đậu nành: tương, chao, tempeh, miso, nước tương, (d) Các sản phẩm rau: rau muối chua, kim chi, (e) Các sản phẩm từ thịt, cá: nem chua, salami, nước mắm và (g) Chế biến trà, cacao. 2. Trong công nghệ dược phẩm Bắt đầu được dùng năm 1940 trong sản xuất penicillin, cho đến nay, lên men đã được ứng dụng trong sản xuất nhiều loại dược phẩm. Một số thí dụ trong lĩnh vực này là: - Kháng sinh: ngoài penicillin, còn có tetracylin, streptomycin, chloramphenicol,… - Vitamin: B2 và B12 được sản xuất chủ yếu bằng lên men. Các vitamin C, H, E, K cũng có thể sản xuất bằng con đường ấy nhưng không có ưu thế bằng các phương pháp hóa học. - Vaccin: lên men là một trong 3 phương pháp chính trong sản xuất vaccin. - Steroid: nổi bật nhất là cortisone 3. Trong sản xuất hóa chất Nhiều loại hóa chất có thể được sản xuất bằng lên men từ những loại nguyên liệu rẻ tiền. Ta có thể kể đến: (a) Etanol, butanol, aceton, (b) Một số axit hữu cơ: axit citric, axit lactic, 16 axit fumaric,…(c) Enzyme: amylase, protease, pectinase,… và (d) Polymer: xanthan, dextran, polyhydroxyalkanoate (PHA). 4. Trong sản xuất nông nghiệp Các ứng dụng quan trọng nhất của lên men trong nông nghiệp là sản xuất thức ăn gia súc phục vụ cho chăn nuôi, sản xuất phân bón vi sinh, thuốc trừ sâu vi sinh. 5. Trong năng lượng Lên men được dùng trong sản xuất etanol (xăng sinh học) và khí metan (biogas) ở quy mô lớn. 6. Trong bảo vệ môi trường Lên men là một phương pháp đơn giản, hữu hiệu và có chi phí thấp trong xử lý nước thải và rác thải. 1.3. Phân loại quá trình lên men 1.3.1. Cơ sở phân loại các quá trình lên men Lên men là một quá trình phong phú và đa dạng về nhiều mặt, do đó chúng ta có nhiều kỹ thuật lên men khác nhau. Ta có thể phân loại chúng theo một số cách dựa vào các tiêu chí sau: - Dựa vào loại vi sinh vật dùng để lên men, ta có lên men bằng vi khuẩn, nấm men, hay nấm mốc. Cũng có khi người ta sử dụng phối hợp hai loại vi sinh vật hay thậm chí nhiều hơn nữa. - Tùy theo vai trò của oxy khi lên men, ta có lên men hiếu khí và lên men kỵ khí. Tuy vậy cũng có trường hợp, trong quá trình lên men, có giai đoạn hiếu khí và cũng có giai đoạn kỵ khí. - Dựa vào tính liên tục của quá trình lên men, ta có thể tiến hành lên men từng mẻ (gián đoạn) hoặc liên tục. Một dạng lên men liên tục đặc biệt là cơ chất không được bổ sung một cách liên tục mà được đưa vào môi trường lên men theo từng đợt (fed-batch). - Sản phẩm chính thu được từ quá trình lên men có thể là sinh khối của vi sinh vật (như nấm men), có thể là sản phẩm của quá trình trao đổi chất của vi sinh vật, cũng có thể là sự chuyển hóa của nguyên liệu ban đầu (steroid, xử lý nước thải). Dựa vào đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật và kỹ thuật lên men, người ta đưa ra khái niệm 8 kiểu lên men nói chung như sau: 1. Lên men theo mẻ (batch fermentation): là một hệ thống nuôi cấy khép kín, môi trường dinh dưỡng không thay đổi và lên men trong thời gian xác định trong điều kiện lên men tối ưu: ôxy hòa tan, chất chống tạo bọt, pH môi trường được kiểm soát trong quá trình lên men. Nghĩa là, quá trình lên men được thực hiện trong một thời gian nhất định hoặc cho đến khi các chất dinh dưỡng cạn kiệt thì thu hoạch và tách sản phẩm. Quá trình lên men theo mẻ có ưu điểm là ít bị nhiễm bẩn và biến đổi, vận hành đơn giản và giảm nguy cơ ô nhiễm, nhưng có các nhuợc điểm sau: (a) Phải làm sạch thiết bị và hệ thống lên men mỗi lần lên men; (b) Mỗi quá trình lên men chỉ có khoảng thời gian ngắn có năng suất; (c) Cơ chất sử dụng ban đầu cao, nhưng không cao cả quá trình; (d) Tổng thời gian lên men sản xuất không cao do phải gián đoạn; (e) Chi phí vận hành lớn hơn cho việc chuẩn bị và bảo quản chủng giống; (g) Tần suất khử trùng tăng lên cũng ảnh hưởng đến thiết bị đo và đầu dò; (h) Môi trường khử 17 trùng mới và chủng giống thuần khiết phải được thực hiện cho mỗi đợt lên men; và (i) Hiệu suất của sản phẩm mong muốn cũng có thể bị thay đổi. 2. Lên men liên tục (continuous fermentation): là một hệ thống lên men khép kín, không xác định thời gian lên men, môi trường dinh dưỡng mới được bổ sung liên tục hoặc gián đoạn vào thiết bị lên men và lượng tương đương của môi trường đã sử dụng có vi sinh vật được rút ra liên tục hoặc gián đoạn để phục hồi tế bào hoặc sản phẩm lên men. Kết quả là, khối lượng môi trường và nồng độ các chất dinh dưỡng ở mức tối ưu được duy trì do được vận hành một cách tự động. Máy lên men liên tục có công dụng tối đa trong thời gian dài để đạt năng suất cao, giảm thời gian lên men và giảm chi phí vận hành. Ở Phương thức liên tục, môi trường khởi đầu và giống bổ sung vào thiết bị lên men, sau khi giống phát triển, thiết bị lên men được cung cấp môi trường dinh dưỡng vào và dịch lên men được rút ra với tốc độ giống nhau để duy trì một thể tích dịch lên men không đổi trong thiết bị lên men. Ở phương thức lên men liên tục có quay vòng tế bào, khối lượng tế bào được đưa trở lại thiết bị lên men bằng cách sử dụng màng các vi lọc giữ lại tế bào vi khuẩn hoặc sợi nấm. Quá trình lên men liên tục thường được thực hiện theo những cách sau: (a) Lên men một giai đoạn, (b) Lên men quay vòng và (c) Lên men nhiều giai đoạn (chi tiết xem mục 4.1.4). 3. Lên men theo mẻ bổ sung (fed batch fermentation): là kiểu cải tiến của quá trình lên men theo mẻ, cơ chất được bổ sung định kỳ theo từng đợt trong quá trình lên men, do đó chất chất luôn ở nồng độ tối ưu. Điều này là cần thiết vì một số chất chuyển hóa thứ cấp bị ức chế chất dị hóa bởi nồng độ cơ chất cao (như glucose, các hợp chất carbohydrat hoặc nitơ khác) có trong môi trường. Vì lý do này, các yếu tố quan trọng của môi trường dinh dưỡng được bổ sung với số lượng thấp trong giai đoạn đầu của quá trình lên men và các chất nền này tiếp tục được bổ sung với liều lượng nhỏ trong giai đoạn sản xuất. Phương pháp này thường được sử dụng để sản xuất các chất như penicillin. Yoshida (1973) lần đầu tiên đưa ra thuật ngữ này để cho cơ chất vào môi trường khi chất dinh dưỡng cạn kiệt, để duy trì chất dinh dưỡng ở mức tối ưu. Quá trình lên men theo mẻ có bổ sung có thể có ba loại: (a) Nuôi cấy theo mẻ bổ sung khối lượng thay đổi: Cùng một môi trường được thêm vào dẫn đến tăng khối lượng. (b) Nuôi cấy theo mẻ bổ sung khối lượng cố định: Một dung dịch rất đậm đặc của cơ chất giới hạn được thêm vào với một lượng rất ít dẫn đến thể tích môi trường tăng không đáng kể. (c) Nuôi cấy theo mẻ bổ sung quay vòng: Vì không thể đo nồng độ cơ chất bằng các phương pháp trực tiếp trong quá trình lên men, điều này cần thiết để kiểm soát quá trình nuôi dưỡng, nên thường sử dụng các phương pháp gián tiếp. Ví dụ, trong sản xuất axit hữu cơ, giá trị pH có thể được sử dụng để xác định tốc độ sử dụng glucose. 4. Lên men kỵ khí (anaerobic fermentation): là quá trình lên men được thực hiện trong điều kiện không có oxy, nhưng vi sinh vật kỵ khí có 2 loại: kỵ khí bắt buộc không thể chịu được oxy (như vi khuẩn Clostridium sp chỉ hoạt động trong điều kiện thiếu oxy) và vi sinh vật kỵ khí ưa thích: vẫn hoạt động trong điều kiện thiếu oxy và tạo ra lượng sản phẩm mong muốn tối ưu (như vi khuẩn axit lactic có thể chịu được một lượng nhỏ oxy hay nấm men yêu cầu sục khí ban đầu để tạo ra sản lượng tế bào cao trước khi tạo điều kiện lên men kỵ khí). Điều kiện kỵ khí trong thiết bị lên men được tạo ra bằng cách rút oxy có trong không gian đầu bằng máy bơm xả và bơm một số khí trơ như nitơ, argon, v.v. hoặc bằng cách xả nó ra ngoài, bởi sự xuất hiện của một số khí như CO2 hoặc hydro. 18 5. Lên men hiếu khí (aerobic fermentation): là quá trình lên men được thực hiện với sự có mặt của oxy. Trong hầu hết các quy trình thương mại và phần lớn các sản phẩm phục vụ con người được sản xuất bằng loại lên men này. Quá trình lên men có thể là nuôi cấy bề mặt hoặc nuôi cấy tĩnh và chìm. 6. Lên men bề mặt (surface fermentations): là những quá trình lên men mà ở đó cơ chất có thể là chất rắn hoặc chất lỏng, vi sinh vật phát triển trên cơ chất và hút các chất dinh dưỡng từ cơ chất. Những loại lên men này là phù hợp khi các sản phẩm được sản xuất dựa trên quá trình lên men từ bào tử. Nhược điểm vi sinh vật tiếp xúc với các điều kiện lên men không đồng đều, cả oxy và chất dinh dưỡng. 7. Lên men chìm (submerged fermentations): là những quá trình trong đó chất dinh dưỡng là chất lỏng và vi sinh vật phát triển bên trong cơ chất. Các điều kiện nuôi cấy được thực hiện đồng nhất với sự trợ giúp của thiết bị phân phối khí và cánh khuấy. Hầu hết các quá trình lên men công nghiệp thuộc loại này. Cơ chất luôn ở trạng thái lỏng và môi trường như vậy còn được gọi là môi trường lên men lỏng. 8. Lên men trạng thái rắn (solid state fermentation, SSF hay lên men xốp, LMX): là sự phát triển của vi sinh vật trên vật liệu rắn ẩm khi không có hoặc gần không có nước tự do. Trong những năm gần đây SSF đã cho thấy nhiều hứa hẹn trong việc phát triển một số quy trình và sản phẩm sinh học, SSF đã được sử dụng một cách mơ hồ như lên men ở trạng thái rắn hoặc lên men cơ chất rắn. Tuy nhiên, để phân biệt giữa hai quá trình, quá trình lên men cơ chất rắn là quá trình lên men nguồn cacbon chỉ khi không có hoặc gần như không có nước tự do, còn quá trình lên men trạng thái rắn là quá trình lên men sử dụng cơ chất tự nhiên như trên hoặc cơ chất trơ được sử dụng làm chất rắn bổ sung. Quá trình lên men cơ chất rắn SSF quy mô lớn, người ta thường sử dụng ba loại thiết bị lên men: Thiết bị phản ứng sinh học khay nuôi (tray bioreactor), thiết bị phản ứng sinh học khối ủ (packed-bed bioreactors) và thiết bị phản ứng sinh học dạng thùng quay (rotating drum bioreactors) (chi tiết xem mục 4.1.2). 1.3.2. Phân loại quá trình lên men theo tính chất cơ lý Phụ thuộc vào đặc điểm sinh lý của vi sinh vật nuôi cấy đối với oxy, người ta coi các quá trình đó là hiếu khí, kỵ khí hay kỵ khí không bắt buộc (hiếu khí tùy tiện). Để thực hiện được những quá trình này người ta đưa ra các phương pháp lên men dựa vào các phương pháp nuôi cấy: 1. Phương pháp lên men bề mặt (surface fermentation): Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Ví dụ, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường thạch trong hộp Petri hay phát triển trên môi trường dịch thể trong bình nuôi. Phương pháp này đã được sử dụng trong lên men sản xuất amylase, axit citric từ nấm Aspergillus niger và oxy được cung cấp trực tiếp từ không khí. 2. Phương pháp lên men trên môi trường xốp (solid-state fermentation): Môi trường thường ở thể rắn và vi sinh vật cũng phát triển trên bề mặt vật liệu nuôi cấy. Oxy được cấp trực tiếp không khí như nuôi bề mặt. Phương pháp này thường được sử dụng trong ủ mốc làm tương, nuôi mốc trên môi trường cơm để đường hoá trong quá trình làm rượu. Phương pháp này được sử dụng trong ủ rác (composting) làm phân bón hữu cơ… 19 3. Phương pháp lên men chìm (immersed cultivation): Đây là phương pháp nuôi cấy phổ biến trong công nghiệp sản xuất các chế phẩm sinh học. Phương pháp này không những chỉ sử dụng nuôi cấy các chủng vi sinh vật mà ngày nay người ta còn dùng nuôi cấy các tế bào động, thực vật. Nguyên tắc nuôi cấy chìm, các vi sinh vật phát triển trong môi trường dịch thể, đối với các vi sinh vật kỵ khí thì người ta không cấp khí, còn đối với vi sinh vật hiếu khí người ta thường cấp khí để cung cấp oxy cho vi sinh vật phát triển. Tuỳ theo nhu cầu oxy của từng loại vi sinh vật mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau để tăng lượng oxy hoà tan trong môi trường: tăng cường lượng khí cấp, sử dụng cánh khuấy với các tốc độ khác nhau, dùng cánh chắn làm tan bọt khí lớn … 4. Phương pháp lên men bằng tế bào cố định: Các tế bào được cố định trên chất mang là các chất hữu cơ (như algenat, chitosan, polyacrelamid..) hoặc các chất vô cơ có lỗ xốp (như zeolit, diaomit...) thực hiện quá trình lên men. Phương pháp này sử dụng để sản xuất enzyme, chuyển hóa các chất hữu cơ. 1.3.3. Phân loại quá trình lên men theo nguyên lý vận hành Nuôi cấy vi sinh vật để sản xuất các sản phẩm của các chất hoạt hoá sinh học là quá trình tinh vi và phức tạp nhất để thu nhận các sản phẩm tổng hợp vi sinh. Tổng hợp sinh học các chất hoạt hoá sinh học do vi sinh vật tạo ra phụ thuộc vào một số yếu tố như nhiệt độ, pH của môi trường và canh trường phát triển, nồng độ hoà tan, thời gian nuôi cấy, kết cấu và vật liệu thiết bị. Phụ thuộc vào các phương pháp ứng dụng để đánh giá hoạt động thiết bị lên men dùng để cấy chìm vi sinh vật và được chia ra một số nhóm theo các dấu hiệu sau: 1. Theo phương pháp nuôi cấy: Các thiết bị hoạt động liên tục và gián đoạn. 2. Theo độ tiệt trùng: Các thiết bị kín và các thiết bị không đòi hỏi độ kín nghiêm ngặt. 3. Theo kết cấu: Các thiết bị lên men có bộ khuếch tán và tuabin, có máy thông gió dạng quay, có bộ đảo trộn cơ học, có vòng tuần hoàn bên ngoài; các thiết bị lên men dạng tháp, có hệ thông gió kiểu phun. Theo phương pháp cung cấp năng lượng và tổ chức khuấy trộn, thông gió các thiết bị cung cấp năng lượng cho pha khí, pha lỏng và pha tổng hợp. Thực tế trong lên men công nghiệp hầu như tất cả các quá trình lên men sản xuất các chất có hoạt tính sinh học đều được tiến hành bằng phương pháp lên men gián đoạn và trong điều kiện vô trùng. 1.2.4. Phân loại quá trình lên men theo cơ chế điều chỉnh động học Trong điều kiện hiện nay, ở mức độ sản xuất công nghiệp, phương pháp nuôi cấy các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh cũng như các chất có hoạt tính sinh học khác thường được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy chìm. Đó là phương pháp nuôi cấy chủng sản trong môi trường dinh dưỡng dịch thể, được cấp không khí vô trùng và đảo trộn liên tục. Từ đó có thể cải biến thành các phương thức lên men theo phương pháp nuôi cấy chìm các chủng vi sinh vật như sau: 1. Lên men theo mẻ: Cả quá trình phát triển của vi sinh vật diễn ra chỉ trong một nồi lên men, sau khi giải phóng dịch nuôi cấy của mẻ trước, rửa sạch cho môi trường lên men mới, sau thanh trùng lại tiếp tục lên men mẻ mới. 20