Tài liệu Bước đầu nghiên cứu nhân nhanh cây nưa (amorphophallus sp) trong ống nghiệm để bảo tồn và phục vụ sản xuất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÀNH TÂY KHOA CÔNG NGHỆ NÔNG - LÂM - THỰC PHẨM ………………… KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH CÂY NƯA (Amorphophallus sp) TRONG ỐNG NGHIỆM ĐỂ BẢO TỒN VÀ PHỤC VỤ SẢN XUẤT NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN VĂN DƯ (VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT) TS. LÊ XUÂN ĐẮC (VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC) BỘ MÔN – KHOA: CÔNG NGHỆ NÔNG - LÂM - THỰC PHẨM NGƯỜI THỰC HIỆN: LÊ THỊ THANH HUỆ LỚP: K2-CNSH2 HÀ NỘI - 2012 2 LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kì công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng Tác giả Lê Thị Thanh Huệ 3 năm 2012 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Dư, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, TS. Lê Xuân Đắc, Viện Công nghệ sinh học đã luôn tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công nghệ Nông - Lâm - Thực phẩm trường Đại học Thành Tây đã dạy dỗ, truyền đạt cho tôi cho tôi những kiến thức vững chắc và lòng đam mê nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi đến gia đình và bạn bè, những người đã ủng hộ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu khoa học lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất. Hà Nội, tháng 6 năm 2012 4 KÍ TỰ VIẾT TẮT BAP CT CTMT ĐC IAA IBA KTST NAA TB 6 - Benzyl Amino Purin Công thức Công thức môi trường Đối chứng Indoly Acetic Acid Indoly Butyric Acid Kích thích sinh trưởng α – Naphthalen Acetic Acid Trung bình 5 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Kết quả tạo nguyên liệu vô trùng từ hạt Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo đa chồi Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và IAA đến khả năng tạo đa chồi Bảng 5: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và IBA đến khả năng tạo đa chồi Bảng 6: Kết quả tổng hợp thí nghiệm tạo đa chồi cây Nưa Bảng 7: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ Bảng 8: Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ Bảng 9: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ Bảng 10: Ảnh hưởng của giá thể đến cây trồng trong bầu 6 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nưa là một loại cây thường được trồng ở các quốc gia Đông Á như là một cây lương thực và thực phẩm. Ở nước ta, Nưa mọc hoang rải rác ở khắp các vùng rừng núi, được người dân nhiều địa phương đem về trồng cũng đã lâu đời ở trong vườn, quanh bờ ao, dọc hàng rào và trên các đồi để làm thức ăn cho người và gia súc, gặp nhiều ở các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hoà Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế... Củ Nưa có nhiều tinh bột mịn ăn ngon hơn sắn nên trước đây nhân dân ta trồng nhiều để lấy củ làm lương thực ăn thay cơm, bẹ lá nấu canh hay muối để dành làm thức ăn như dưa trong những tháng thiếu rau xanh cho người hoặc chế biến thức ăn cho gia súc. Trong củ Nưa có chứa glucomannan, đây là một polysaccharide hòa tan trong nước. Nó có khả năng làm giảm lượng đường và cholesterol trong máu, giảm cân, thúc đẩy hoạt động đường ruột và tăng cường chức năng miễn dịch. Glucomannan cũng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Cây Nưa không chỉ có giá trị về mặt thực phẩm mà còn có ý nghĩa trong việc chống xói mòn đất. Thực trạng hiện nay, diện tích rừng nước ta đang ngày càng bị thu hẹp, việc khai thác tài nguyên rừng bừa bãi, sự đa dạng sinh học bị phá vỡ, nhiều nguồn gen thực vật có nguy cơ tuyệt chủng. Cùng với thực tế là ngày nay đời sống con người ngày càng nâng cao, nhiều người không còn nghĩ đến một loài cây dân dã nhưng lại có nhiều giá trị to lớn như cây Nưa. Hơn nữa hiện nay những nghiên cứu về cây Nưa chưa nhiều, chính vì vậy việc quan tâm đến cây Nưa là một việc làm cần thiết để có thể nhân giống và bảo tồn giống cây Nưa. Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật. Những thành tựu mà 7 nuôi cấy mô và tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật quý hiếm. (Lê Trần Bình và CS, 1997) Với những lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Bước đầu nghiên cứu nhân nhanh cây Nưa (Amorphophallus sp) trong ống nghiệm để bảo tồn và phục vụ sản xuất”. 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Xây dựng quy trình hoàn chỉnh để nhân nhanh và bảo tồn in vitro cây Nưa. 1.2.2. Yêu cầu - Xây dựng được qui trình nhân cây Nưa trong ống nghiệm với hệ số nhân chồi cao, chi phí sản xuất thấp, giá thành hạ... - Cây con nuôi cấy từ ống nghiệm phát triển tốt ở giai đoạn nhà lưới và vườn ươm. 8 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Vị trí phân loại và giá trị của cây Nưa Cây Nưa (hay khoai Nưa) có tên khoa học là Amorphophallus sp, thuộc họ Ráy (Araceae), lớp Một lá mầm (Monocotyledone) (Hoàng Thị Sản và Hoàng Thị Bé, 2006). Cây thảo có củ lớn hình cầu lõm, đường kính có thể tới 25cm; trước ra hoa, sau ra lá. Mỗi lá chia làm 3 nhánh, các nhánh lại chia đốt, phiến lá xẻ thuỳ sâu hình lông chim, các thuỳ cuối hình quả trám thuôn, nhọn đầu; cuống lá thon, dài 40-80cm, nhẵn, màu lục nâu, có điểm các chấm trắng. Cụm hoa có mo lớn, phần bao mo màu lục nhạt điểm các vết lục thẫm, ở phía mép màu hung tím, mặt trong màu đỏ thẫm. Trục hoa dài gấp đôi mo. Quả mọng. (Hejnowicz Z và Barthlott W 2005), (Jianbin Hu và Jianwu Li, 2008) Khoai Nưa được trồng ở Nhật bản, Trung quốc, Việt Nam và Philippin. Ở nước ta, các dân tộc ở một số vùng đồi núi thuộc các tỉnh Quảng Ninh, Lạng Sơn, Hà Bắc... đã có tập quán trồng khoai Nưa từ lâu đời. Nhiều vùng nông thôn cũng có trồng để lấy củ ăn. Cây Nưa có giá trị thực phẩm rất to lớn. Cuống lá Nưa có thể dùng để nấu canh hoặc muối dưa ăn. Củ, dọc và lá, bã bột khoai Nưa là nguồn thức ăn rất tốt để chăn nuôi gia súc, đặc biệt chăn nuôi lợn. Củ Nưa là phần có giá trị to lớn nhất. Củ Nưa có thể luộc ăn hoặc gọt vỏ thổi độn với cơm, ăn mát, chắc dạ, không nóng ruột như khoai lang. Củ khoai Nưa còn dùng để nấu chè. Tuy nhiên, Nưa chủ yếu được trồng để lấy bột. Bột Nưa trắng mịn như bột sắn nhưng có hàm lượng tinh bột cao hơn. Trong 100g củ khô có tinh bột là 75,16g; protein 12,5g; lipid 0,98; dẫn xuất không protein 3,27; cellulose 3,67; tro 4,42. Tỷ lệ tinh bột nhiều gấp đôi khoai sọ. Bột Nưa từ lâu đã được người Nam Bộ coi như một thứ thực phẩm giải nhiệt hữu hiệu giống như bột sắn. Dân gian còn có thể dùng bột Nưa để làm các loại bánh, làm miến và sử dụng trong công nghiệp để hồ vải. 9 Từ xưa người dân miệt duyên hải Tây Nam Bộ xem bột Nưa như một loại thuốc dân gian. Củ Nưa có thể dùng như một dược liệu để chữa bệnh sốt rét có báng, đờm trệ, ăn không tiêu, đầy bụng. (Đỗ Tất Lợi, 2005) Trong củ Nưa có chứa glucomannan - một polysaccharide hòa tan trong nước. Glucomannan là một chất phụ gia thực phẩm được sử dụng như một chất chuyển đổi sữa hay chất làm đặc. Trong lịch sử, glucomannan đã được sử dụng trong thực phẩm truyền thống châu Á như mì, đậu phụ, và các sản phẩm khác. Ngoài ý nghĩa trong thực phẩm, glucomannan còn đóng vai trò quan trọng trong một số loại dược phẩm (Tamura và CS, 2005). Glucomannan là một chất xơ hòa tan, chính vì vậy nó được sử dụng để điều trị táo bón. Glucomannan có thể làm giảm táo bón bằng cách giảm thời gian vận chuyển phân (Marzio, 1989). Trong điều trị táo bón mãn tính, glucomannan cải thiện đáng kể các triệu chứng táo bón (Passaretti, 1991). Glucomannan cũng có tác dụng giảm colesterol, lipoprotein và chất béo trung tính, do đó nó cũng được bổ sung vào thành phần của các loại thuốc chữa béo phì (Walsh, 1984), (Gallaher, 2002). Chất này cũng được chứng minh là có tác dụng hỗ trợ tích cực trong hỗ trợ điều trị bệnh nhân tiểu đường type 2 do có thể điều chỉnh nồng độ đường trong máu (Chen, 2003). Glucomanan chiếm 70% trong chất khô của củ Nưa, vì vậy việc nghiên cứu nhân giống cây Nưa để thu glucomannan có ý nghĩa rất to lớn. Cây Nưa không kén đất, có thể trồng được trên nhiều loại đất từ đất xấu bạc màu đến đất hoang đồi núi tơi xốp, nhiều mùn. Một trong những đặc điểm sinh lý quan trọng của cây khoai Nưa là khả năng chịu bóng rất cao, dễ quang hợp ở những nơi có ánh sáng tán xạ, độ che phủ cao do đó rất thích hợp để trồng xen dưới các tán rừng, vườn cây ăn quả vừa tận dụng được đất đai, vừa góp phần chống xói mòn bảo vệ đất và rừng rất tốt. Đây là một loại cây có củ bản địa có giá trị kinh tế cần được khôi phục sản xuất để phục vụ nhu cầu kinh tế của xã hội đồng thời góp phần bảo vệ môi trường sinh thái. 10 2.2. Tình hình nghiên cứu cây Nưa trong và ngoài nước 2.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Trên thế giới, những nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn cây Nưa được thực hiện ở nhiều nước, đặc biệt ở Trung Quốc phát triển rất mạnh (ChunLin Long và CS, 2005). Nhiều nước đã có những nhà máy chế biến, sản xuất tinh bột Nưa và tách chiết glucomannan ở qui mô công nghiệp. (Suzuki và CS, 2010) 2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam chi Nưa là chi lớn nhất trong họ Ráy bao gồm 20-25 loài (Nguyễn Văn Dư, 2005). Lần đầu tiên cây Nưa ở Việt Nam được nhà thực vật học người Đức Engler nghiên cứu vào năm 1911 trong cuốn Pflanzenreirich. Trong tài liệu này ông mô tả loài Nưa Bắc Bộ (A. tonkinensis) như một loài mới ở Bắc Việt Nam. Năm 1942, Gagnepain khi viết họ Ráy ở Đông Dương, ông đã thống kê và mô tả 4 loài Nưa ở Việt Nam là Nưa chuông (A. campanulatus = A. paeoniifolius), Nưa Bắc Bộ (A. tonkinensis), Nưa mekong (A. mekongensis), Nưa đứt đoạn (A. interruptus). Mãi tới năm 1993, Phạm Hoàng Hộ viết cuốn Cây cỏ Việt Nam ông cũng thống kê và mô tả ngắn gọn những đặc điểm về cây Nưa. Từ trước đến nay, việc nhân giống cây Nưa chưa được chú trọng, chủ yếu người dân tự để giống hoặc vào rừng khai khác theo hình thức tự cung tự cấp. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về cây Nưa còn rất hạn chế. Gần đây, nhóm nghiên cứu về Thực vật dân tộc học thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và Trại Thực nghiệm sinh học thuộc Viện Công nghệ sinh học đã và đang tiến hành thu thập các giống Nưa với mục đích bảo tồn, tiếp theo là chọn lọc đánh giá các giống Nưa có hàm lượng glucomannan cao, chất lượng tinh bột tốt để nhân nhanh và sản xuất cây Nưa phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm. Ngày 10/3/2011, Sở Khoa học và Công nghệ Thừa Thiên Huế đã tổ chức hội nghị tuyển chọn đề tài “Nghiên cứu hàm lượng, chất lượng, tác dụng và xây dựng quy trình sản xuất glucomannan 11 trong củ Nưa-Amorphophallus (họ Ráy-Araceae) trồng tại tỉnh Thừa Thiên Huế”.(http://skhcn.hue.gov.vn/Portal/? GiaoDien=11&ChucNang=341&NewsID=20110324153307). Sáng ngày 08/02/2012, tại Hội trường Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, NCS. Nguyễn Tiến An, chuyên ngành Hóa Hữu cơ đã bảo vệ thành công Luận án Tiến sĩ về đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học, quy trình tách chiết, biến tính hóa học và khả năng ứng dụng của glucomannan từ củ một số loài nưa (Amorphophallus. sp – Araceae) ở Việt Nam”. (http://vienhoahoc.ac.vn/PrintPreview.aspx?ID=414) 2.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật quan trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Trải qua hơn 100 năm phát triển và đã đạt được những thành tựu nhất định trong lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng (Nguyễn Đức Thành, 2000). 2.3.1. Môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật Thành phần hóa học: Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau: - Các muối khoáng đa lượng và vi lượng - Các vitamin - Các amino axít - Nguồn các - bon: một số các loại đường - Các chất điều hoà sinh trưởng - Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối khô... - Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar) 12 Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro. Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố: - Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trường. - Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống…) - Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…). Độ pH môi trường Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần thiết của thí nghiệm. Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu hết các môi trường nuôi cấy pH 5,0 - 6,0 trước khi khử trùng được xem là tối ưu. Độ pH cao hơn sẽ làm cho môi trường rất rắn trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar. Hầu hết các môi trường nuôi cấy nghèo đệm, vì thế chúng làm dao động giá trị pH, sự giao động này có thể gây bất lợi cho thí nghiệm nuôi cấy dài ngày và sự sinh trưởng của các tế bào đơn hoặc các quần thể tế bào ở mật độ thấp. Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy, đối với từng môi trường nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu. Nuôi cấy callus của nhiều loài cây, pH ban đầu thường là 5,5 - 6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt được giá trị từ 6,0 - 6,5. Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính acid cao như amino acid, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để chỉnh pH môi trường về từ 5,5 - 6,5. 13 Những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn hay tế bào trần thì việc chỉnh độ pH là bắt buộc. Độ pH môi trường thường được điều chỉnh từ 5,8 - 6,0 trước khi khử trùng. Nhìn chung nếu độ PH cao hơn 6 sẽ làm môi trường bị cứng và nếu thấp hơn 5 thì agar khó đông. Các tác nhân làm rắn môi trường Các tác nhân làm rắn hoặc tạo gel được sử dụng phổ biến để chuẩn bị các môi trường nuôi cấy mô dạng rắn (solid) hoặc dạng sệt (semi-solid). Trong nuôi cấy dịch lỏng mô hoặc tế bào bị ngập trong môi trường và chết do thiếu oxy. Các gel tạo một giá đỡ cho mô sinh trưởng trong điều kiện tĩnh (static conditions). Agar là một loại polysaccharide thu được từ một số loài tảo (ngành tảo đỏRhodophyta), chúng có ưu điểm hơn các tác nhân tạo gel khác. Trước tiên, gel của agar không phản ứng với các thành phần của môi trường. Thứ hai, chúng không bị thủy phân bởi các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định ở tất cả các nhiệt độ nuôi cấy được tiến hành. Bình thường, từ 0,5 - 1% agar được dùng trong môi trường để tạo gel rắn chắc ở pH đặc trưng cho môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Trong những nghiên cứu về dinh dưỡng, việc sử dụng agar được tránh bởi vì agar thương phẩm không sạch do có chứa một số ion Ca, Mg, K, Na và một số nguyên tố khác ở dạng vết. Tuy nhiên, các chất bẩn nói trên cũng có thể được loại bỏ bằng cách rửa agar với nước cất hai lần ít nhất là 24 giờ, tráng trong cồn và làm khô ở 60 oC trong 24 giờ. Nói chung, ở 80oC agar ngậm nước chuyển sang trạng thái sol và ở 40oC trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của agar cao từ 6 - 12 g/l nước. Gelatin ở nồng độ cao (10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bị hạn chế sử dụng bởi vì nó nóng chảy ở nhiệt độ thấp (25 oC). Các hợp chất khác đã được thử nghiệm thành công bao gồm methacel, alginate, phytagel và gel-rite. Công ty FMC Corp. gần đây đã phát triển một loại agarose được tinh sạch 14 cao gọi là Sea Plaque(k), loại này có thể được dùng để phục hồi các protoplast đơn (single protoplast) trong nuôi cấy. Cellophane đục lỗ (perforated cellophane), cầu giấy lọc (filter paper bridge), bấc giấy lọc (filter paper wick), bọt polyurethane (polyurethane foam) và xốp polyester (polyester fleece) là các phương thức thay đổi giá thể được dùng trong môi trường nuôi cấy mô hoặc tế bào. Điều thuận lợi khi làm việc với các hợp chất tạo gel nhân tạo là chúng tạo ra các gel sạch ở các nồng độ tương đối thấp (1,25 - 2,5 g/l) và nó có thể giúp phát hiện sự nhiễm bẩn được phát triển trong suốt thời gian nuôi cấy. Các mẫu vật sinh trưởng tốt hơn trên agar hoặc các tác nhân tạo giá thể khác phụ thuộc vào loại mô và từng loài khác nhau. Một số loại môi trường cơ bản thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: Môi trường Murashige-Skoog (MS) là một trong những loại môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Môi trường MS thích hợp cho cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm (Murashige, 1962). Tới nay, có rất nhiều công thức cải tiến môi trường MS trên cơ sở công thức gốc do Murashige và Skoog công bố năm 1962. Môi trường B5 được thiết kế đầu tiên cho nuôi cấy callus hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, sau đó được cải tiến và trở thành môi trường thích hợp cho nuôi cấy protoplast. Môi trường này cũng được sử dụng để tái sinh cây từ protoplast. Môi trường Chu (N6) là loại môi trường rất hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn của lúa, được phát triển đặc biệt cho nuôi cấy bao phấn các loài hòa thảo, mặc dù trong các thí nghiệm nuôi cấy bao phấn môi trường được phát minh bởi Nitsch (1969) vẫn được dùng phổ biến hơn. Môi trường Nitsch ngày càng thích hợp và phổ biến trong nuôi cấy cây đậu tương, cỏ ba lá đỏ (red clover) và các loài legume khác. Thành phần dinh dưỡng của môi trường này đã giúp tăng sinh trưởng của tế bào trong quá trinh phát sinh phôi và nuôi cấy protoplast. 15 Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đối với thành công của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi loài cây, thậm chí mỗi kiểu gen, các kiểu nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào trần, bao phấn, hạt phấn…) có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường. Khi bắt đầu nuôi cấy mô một loài mới hoặc một giống mới, cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp. Cho đến nay, các nhà khoa học đã tạo ra một số lượng rất lớn các môi trường thích hợp với từng đối tượng và mục tiêu nghiên cứu. 2.3.2. Ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật Hiện nay, từ những thành tựu của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô tế bào có thể ứng dụng rất nhiều vào lĩnh vực trồng trọt, như: - Nhân nhanh vô tính các giống cây quý: từ một mẫu nuôi cấy người ta có thể tạo ra hàng triệu cây con như nhau nếu đủ thời gian cấy chuyển. Tuy nhiên, hệ số cấy chuyển phụ thuộc tuỳ giống, càng cấy chuyển nhiều lần càng tạo nhiều biến dị. Ví dụ, các nhà khoa học đã kết luận từ một chồi dứa đưa vào nuôi cấy trong ống nghiệm có thể nhân ra hàng triệu cây dứa giống; từ một chồi chuối đưa vào nuôi cấy có thể nhân ra 2.000 cây chuối giống, nếu qua số này sẽ có tỷ lệ biến dị cao. - Cải lương giống cây trồng bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristerm): để phục tráng những giống cây quý đã nhiễm virus người ta có thể nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để nhân nhanh. Qua một số lần nuôi cấy theo kiểu này sẽ tạo ra được những cây hoàn toàn sạch bệnh từ cây đã nhiễm virus. - Tạo dòng đơn bội từ nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy tế bào hạt phấn: Người ta đã ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn để tạo những cây đơn bội từ bao phấn hoặc hạt phấn, sau đó lưỡng bội hoá và tạo thành dòng đồng hợp tử. Kĩ thuật này đã thành công nhiều ở những cây họ cà. - Khắc phục lai xa bằng cách thụ phấn trong ống nghiệm nhờ kĩ thuật nuôi cấy phôi: Nhờ nuôi cấy trong ống nghiệm đã khắc phục tính bất hợp giao tử trước và sau khi thụ tinh đối với lai giữa các cây khác nhau khá xa về mặt di truyền. - Lai vô tính còn gọi là dung nạp tế bào trần (Protoplast): Nhờ kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mà người ta đã tạo thành cây lai từ 2 giống khác nhau khá xa về mặt di truyền bằng cách dùng các enzim để hoà tan màng tế bào rồi cho các tế bào trần (không còn màng) vào nuôi cấy chung trong môi trường nhân tạo và chúng phát triển thành khối mô sẹo (callus), từ đó chuyển khối callus này sang các môi trường phân hoá chức năng tế bào và để nuôi cấy thành cây lai. (Nguyễn Đức Thành, 2000) 2.3.3. Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro 16 Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích sinh trưởng ở một mức độ thích hợp, chúng ta có thể điều khiển được chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Auxin và cytokinin là hai chất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô (Geoge, 1993). Đặc tính của Auxin Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và sự điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó được sử dụng với cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Cùng với cytokinin các nhóm auxin kích thích sự phân chia tế bào. Các hormone của nhóm này có hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn. Tác động của các auxin thường liên quan đến độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuối cấy mô và tế bào thực vật, auxin được sử dụng để kích thích phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin thường dùng là: IBA (Indoly Butyric Acid), IAA (Indoly Acetic Acid), NAA (α - Naptalen Acetic Acid), 2,4 - D (Dichlorphenoxy Acetic Acid) (Đỗ Năng Vịnh, 2005) Đặc tính của cytokinin Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Các cytokinin thường xuyên được sử dụng nhất là BAP (6 Benzyl Amino Purin), kinetin (N - (2 - furfurylamin) - 1 - H - 6 - amin), 17 zeatin (6 - (4 - hydroxyl - 3 metyl - trans - 2 butanylamin) purin). Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Ngoài 2 nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật người ta còn sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào, qua đó làm tăng kích thước của chồi nuôi cấy… GA 3 là loại được sử dụng nhiều nhất. Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, tuy nhiên người ta hay dùng phối hợp cả auxin và cytokinin ở tổ hợp tỷ lệ khác nhau sẽ cho hiệu quả tốt hơn (Vũ Văn Vụ, 2005) 2.4. Thành tựu bảo tồn nguồn gen cây trồng sử dụng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một trong những phương thức quan trọng nhất để nhân nhanh và bảo tồn, đặc biệt là đối với cây trồng khó nhân nhanh bằng phương pháp truyền thống (Đỗ Năng Vịnh, 2005), (Daniel Lineberger, 1980). Dưới đây là một số thành tựu đã đạt được. Trong nước Ở Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật này để bảo tồn các loài thực vật nhiệt đới quý hiếm, có giá trị kinh tế cũng được các nhà nghiên cứu quan tâm, bắt đầu từ các cây Thông (Taxus sps.) là loài có chứa các hoạt chất chữa ung thư hiệu quả như Taxoid và các hợp chất và một số loài thực vật có giá trị làm thuốc (Lê Thị Xuân và CS, 1996) Cây Màng tang (Litsea verticillata) là một loại cây thân gỗ có chứa một số hợp chất có khả năng kháng HIV (+) – demethoxyapiercelsin và verticillatol (Hoang VD, Zhang HJ). Tác giả Lê Xuân Đắc và cộng sự đã thành công trong việc nhân nhanh và bảo tồn cây Màng tang (Litsea verticillata) được tìm thấy ở vườn Quốc gia Cúc Phương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Lê Xuân Đắc và CS, 2004) 18 Tác giả Nguyễn Thanh Tùng đã nhân giống in vitro thành công cây sưa (Dalbergia tonkinensis Prain), cây thân gỗ quý hiếm và có giá trị kinh tế cao vào năm 2008. Năm 2009 tác giả này cũng thành công với đề tài “Nghiên cứu bảo tồn in vitro một số loài lan rừng Việt Nam quý hiếm”, nhân được nhiều giống lan như: Thanh đạm một hoa, Thủy tiên hường, Ngọc vạn sáp, Mỹ dung dạ lan… (http://www.baomoi.com/8X-bao-ton-gien-nhieu-giongcay-quy/79/3777758.epi) Cây Ba kích là một cây dược liệu quý, có tác dụng bổ thận âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, khử phong thấp (Ning-Zhen Huang, 2007). Dịch chiết cồn từ củ cây Ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh đối với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon (Wei, 2006). Ngày nay nhu cầu sử dụng loài cây này làm dược liệu đang gia tăng nên nó bị khai thác kiệt quệ. Năm 2010, các tác giả Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh Tư đã nghiên cứu và nhân giống thành công giống cây quý này bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư, 2010). Thế giới Các nhà khoa học Ấn Độ đã xây dựng thành công quy trình tái sinh một số giống tre quý như Dendrocalamus asper (tre mạnh tông), Bambusa multiplex (cây Hóp) thông qua nuôi cấy hạt hoặc chồi bên (Nandi, 2002) Các tác giả Balaraju và cộng sự (2008) đã nhân giống và tái sinh in vitro thành công cây thuốc Vitex agnus-castus (Verbenaceae) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật từ mô phân sinh đỉnh trên môi trường 1/2 MS có bổ sung 0,1 mg/l IBA. Cây thuốc Vitex agnus-castus cũng đang bị đe dọa nghiêm trọng (Balaraju, 2008) Năm 2008, các tác giả Nishritha, Sanjay cũng đã nhân giống in vitro thành công loài Asparagus racemosus Willd, đem lại nhiều giá trị kinh tế lớn. Cùng năm đó, Mukherjee và RoyChowdhury cũng đã nhân giống in vitro loài Aloe Vera sp. (Mukherjee, 2008), (Nishritha, 2008) 19 Bên cạnh đó, tác giả Park và cộng sự (2009) cũng đã tái sinh thành công loài Rehmannia glutinosan L.Journal quý hiếm, đang bị khai thác quá mức (Park, 2009) Ngoài ra cũng còn nhiều loài cây quý khác cũng đã được nhân giống và bảo tồn nguồn gen trong ống nghiệm như: Lawsonia inermis Linn (Lythraceae), Sausurea lappa C.B.Clarke… (Arora, 1989), (Rout, 2001) 2.5. Phương pháp bảo tồn thực vật Hai phương pháp bảo tồn cơ bản được áp dụng là: bảo tồn in situ và bảo tồn ex situ Bảo tồn in situ Đây là biện pháp bảo tồn hiệu quả nhất, đặc biệt là với những loài cây bản địa có phân bố tập trung và có khả năng tái sinh tự nhiên. Bảo tồn in situ được đề xuất cho hầu hết các loại cay rừng nhiệt đới ở nước ta, bởi vì các loài cây này thường là khó tạo thành rừng trồng đơn loài hoặc khó tái sinh ngoài môi trường sống tự nhiên. Bảo tồn in situ còn bao hàm cả các quần thể tái sinh nhân tạo bằng nguồn hạt giống thu hái tại chỗ, thu hái từ nhiều cây mẹ mà không áp dụng có định hướng. Điều này có ý nghĩa to lớn đối với việc xây dựng rừng giống cho các loài cây có phân bố rải rác, như vậy quần thụ bảo tồn được dùng làm nguồn cung cấp vật liệu giống cho tái sinh nhân tạo, cho trồng rừng, làm giàu rừng và cải thiện di truyền. Hầu hết các loài cây bản địa đều cần được ưu tiên bảo vệ theo hình thức bảo tồn in situ, song có hai vấn đề được quan tâm là: - Có quy hoạch cụ thể và xác định các vùng cần bảo vệ cho mỗi loài sao cho cá thể vẫn lưu giữ được toàn bộ biến dị di truyền của loài. - Kết hợp bảo tồn với việc thu hái hạt giống phục vụ tái sinh tự nhiên, tái sinh nhân tạo, xây dựng quần tụ bảo tồn mới (in situ và ex situ), xây dựng giống và phục vụ trồng rừng (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1997) 20