Tài liệu Bao cao vi sinh dh6m in 1

Mục lục Contents Bài 1:.......................................................................................................................................................... 2 NỘI QUY, CÁC QUY TẮC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ HƢỚNG DẪN SỬ DỤNG CÁC DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VI SINH ............................................................................................................. 2 Bài 2:.......................................................................................................................................................... 6 PHƢƠNG PHÁP LÀM NÚT BÔNG ỐNG NGHIỆM, BÌNH TAM GIÁC, BAO GÓI VÀ THANH TRÙNG DỤNG CỤ VI SINH .................................................................................................................. 6 Bài 3:........................................................................................................................................................ 11 PHƢƠNG PHÁP CHUẨN BỊ MÔI TRƢỜNG LỎNG VÀ ĐẶC ĐỂ PHÂN TÍCH CHỈ TIÊU VI SINH VẬT VÀ PHƢƠNG PHÁP CẤY VI SINH VẬT TRÊN MÔI TRƢỜNG THẠCH ĐĨA VÀ ỐNG THẠCH ......................................................................................................................................... 11 Bài 4:........................................................................................................................................................ 15 PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ CHỌN GIỐNG VSV ................................................................... 15 PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VSV VÀ CẤY TRUYỀN VSV ........................................................ 15 Bài 5: ........................................................................................................................................................ 23 KIỂM TRA ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM CFU VÀ MPN ................................................ 23 ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VẬT BẰNG PHƢƠNG PHÁP CFU ......................................................... 23 Bài 6:........................................................................................................................................................ 26 QUAN SÁT TẾ BÀO VI KHUẨN (THỊT BÒ, LỢN) ......................................................................... 26 QUAN SÁT HÌNH DẠNG VI KHUẨN LACTIC( SỮA CHUA, NƢỚC DƢA) .............................. 26 NHUỘM ĐƠN ĐỐI VỚI VI KHUẨN .................................................................................................. 26 Bài 7:........................................................................................................................................................ 31 NHUỘM KÉP ĐỐI VỚI VI KHUẨN GRAM (-) VÀ GRAM (+)...................................................... 31 KẾT LUẬN ............................................................................................................................................. 36 1 Buổi 1: Bài 1: NỘI QUY, CÁC QUY TẮC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ HƢỚNG DẪN SỬ DỤNG CÁC DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VI SINH ( Ngày 21/11/2016 ) I. Các quy tắc trong phòng thí nghiệm. 1. Các quy tắc chung - Chuẩn bị bài và chuẩn bị mẫu trước mỗi buổi học. - Không chạy, không nói chuyện trong phòng thí nghiệm. - Không tự ý di chuyển các dụng cụ, thiết bị trong phòng thí nghiệm. - Không tự ý sử dụng các dụng cụ, thiết bị khi chưa được hướng dẫn. - Không được làm lẫn lộn các dụng cụ, hóa chất. - Đối với các loại hóa chất pha đủ dung, không pha thừa. - Hóa chất luôn phải ghi nhẫn rõ ràng. 2. Các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm - Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật. - Không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm. - Mang khẩu trang khi thao tác với vi sinh vật. - Mặc áo blouse trong thời gian làm thí nghiệm. - Trước khi làm thí nghiệm cần sát trùng bằng giấy lau tẩm cồn 700 . - Cần ghi chú tên, ngày, tháng làm thí nghiệm lên hộp petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy. - Mẫu vật phải được để gọn gàng, đậy kín để tránh lây nhiễm. - Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn. Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác. - Khi lỡ tay làm đổ nhiễm vi sinh vật ra nơi làm việc phải dùng khăn tẩm chất diệt khuẩn lau kỹ, sau đó khử trùng bàn làm việc. 2 - Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipet), không hút bằng miệng. - Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh phải cẩn thận mang găng tay thu gom tất cả mảnh vỡ vào một túi rác riêng. - Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng. - Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần được hấp khử trùng trước khi bỏ vào bãi rác. Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần được ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn (nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng. - Gói cẩn thận bằng giấy báo hoặc ràng bằng băng keo khi đặt chồng các đĩa petri lên nhau. - Không mở hộp petri và dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hô hấp. - Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần dặt vòng hoặc đầu que cấy vào chân ngọn lửa để tránh sự văng nhiễm vi sinh vật vào không khí. - Sát trùng và rửa tay sạch sẽ bằng xà phòng trước khi rời phòng thí nghiệm. II. Giới thiệu, hƣớng dẫn sử dụng các dụng cụ, thiết bị vi sinh: 1. Các dụng cụ thủy tinh a. Ống nghiệm: Được sử dụng để chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật, có nút bông gòn không thấm nước hay bằng nhựa chị nhiệt. b. Đĩa petri: Gồm một nắp lớn và một đáy nhỏ úp lồng vào nhau, đường kính 8cm, 10cm, 12cm,…. c. Ống hút (pipette): - Ống hút có chia độ. - Ống hút Pasteur d. Micropipettes (pipetman): Đây là pipet chính xác, cho phép ta hút một lượng chất rất chính xác. e. Các dụng cụ bằng thủy tinh khác: - Đèn cồn 3 - Bình cầu đáy bằng và đáy tròn - Bình tam giác - Cốc thủy tinh - Ống hút - các loại ống đong - ….. 2. Các dụng cụ, thiết bị khác a. Que cấy: - Que cấy thẳng: Sử dụng để cấy sâu hay ly trích vi sinh vật trên môi trường đặc. - Que cấy vòng: Dùng cấy ria vi sinh vật trên bề mặt thạch hay phân lập vi sinh vật trong môi trường lỏng hoặc môi trường đặc. Que cấy móc: Dùng để cấy các loại nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn. - Những que cấy này thường làm bằng kim loại không bị oxy hóa ở nhiệt độ cao. Tủ ấm: b. Dùng để ủ vi sinh vật hoặc theo dõi sự tang trưởng của vi sinh vật. Tủ ấm có thể đặt theo các chế độ nhiệt độ hoặc theo thời gian tùy theo tính chất nuôi cấy của vi sinh vật. c. Nồi hấp Pasteur Nồi hấp là một thiết bị bắt buộc phải có của một phòng thí nghiện vi sinh mục đích là để tiêu diệt cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử cua vi sinh vật. Nồi hấp có cấu tạo 2 lớp vỏ có khả năng giữ áp suất cao. Khoảng trống giữa 2 lớp vỏ là nơi chứa hơi nước. Phía trong nồi là buồng khử trùng, nơi đặt các vật liệu khử trùng. d. Tủ sấy: Tủ sấy được dùng để sấy khô dụng cụ thủy tinh hoặc để khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô. Nhiệt độ trong tủ sấy có thể lên tới 200oC. Khí nóng được quạt đều trong lò để tránh sự sai biệt về nhiệt độ. 4 e. Tủ cấy vô trùng: Tủ cấy vô trùng được dung để đảm bảo tính vô trùng cao khi thao tác với vi sinh vật. không khí trong tủ cấy vô trùng được bơm khử trùng qua màng lọc vô trùng. Đèn tử ngoại có tác dụng khử trùng bề mặt bàn thao tác trong tủ cấy bật đèn tử ngoại trước 3060 phút. f. Kính hiển vi: Kính hiển vi là thiết bị không thể thiếu trong phòng thí nghiệm vi sinh. Dùng để quan sát vi sinh vật. Kính hiển vi dung để quan sát vi sinh vật. Kính hiển vi cần được đặt tại nơi tránh bụi, ẩm, chấn động. Vệ sinh kính bằng giấy lau kính chuyên dụng, them xăng lau vật kính 100X g. Các thiết bị khác: - Nhiệt kế - Cân phân tích - Đèn tử ngoại UV - …. III. Kết quả: - Nắm vững nội quy và quy tắc trong phòng thí nghiệm. - Cách xử lý các sự cố trong quá trình thực tập, thực hành. - Biết cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phục vụ cho quá trình thực tập vi sinh. 5 Bài 2: PHƢƠNG PHÁP LÀM NÚT BÔNG ỐNG NGHIỆM, BÌNH TAM GIÁC, BAO GÓI VÀ THANH TRÙNG DỤNG CỤ VI SINH (Ngày 21/11/2016 ) I. Bao gói dụng cụ: 1. Nguyên tắc: - Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô. - Bao gói phải kín và cẩn thận để sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng của dụng cụ trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng. 2. Phương pháp bao gói dụng cụ: Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu: - Làm nút bông cho các ống nghiệm, bình tam giác - Bao gói cho hầu hết các dụng a. Làm nút bông: - Với các ống nghiệm: lấy một ít bông cuộn tròn lại, dùng vải xô bọc ngoài. Dùng bút hoặc que tre ấn chặt vào giữa cuộn bông, đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống nghiệm. - Với các chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: Cách làm tương tự nhưng sử dụng bông nhiều hơn. b. Cách bao dụng cụ: Dùng báo hoặc giấy để bao bọc các dụng cụ như ông nghiệm, đĩa petri,…. - Cắt các đoạn giấy báo hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói. - Quấn quanh các dụng cụ, quấn lại thật chặt. - Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín. Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dung giấy bao kín toàn bộ hoặc có thể dung hộp nhôm để đựng để khử trùng. 6 Các phƣơng pháp khử trùng dụng cụ vi sinh: II. 1. Nguyên tắc: Sau khi khử trùng cần đảm bảo: - Sự vô trùng tuyệt đối cho dụng cụ và vật phẩm - Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật - Ghi vào nhật ký ngày, tháng, năm khử trùng. - Đảm bảo an toàn tuyệt đối cho người làm thí nghiệm 2. Các phương pháp khử trùng: Khi khử trùng bằng nhiệt, các tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật bị tiêu diệt dễ dàng trong khi các bào tử vẫn còn tồn tại ở ngay nhiệt độ đó. a. Phương pháp nhiệt khô:  khử trùng bằng tủ sấy Cách tiến hành: - Đặt các dụng cụ đã được bao gói vào tủ sấy - Bật công tắc tủ hoạt động - Điều chỉnh thời gian và nhiệt độ thích hợp (160oC/30 phút) - Tắt tủ sấy, để nguội đến 60oC rồi mở tủ lấy dụng cụ ra - Các dụng cụ khi sấy xong mà giấy bao có màu hơi vàng là đạt yêu cầu. Nếu giấy bao có màu nâu thì không thể sử dụng dụng cụ này để nuối cấy vi sinh vật được  Khử trùng bằng cách đốt que lửa nóng đỏ: Phương pháp này dùng để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng bình tam giác sau khi lấy nút bông ra. Cách khử trùng: hơ dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại 3-4 lần. Với các dây mayxo ở đầu que cấy phải nung cho thật đỏ hết chiều dài dây cấy. b. Khử trùng bằng sức nóng ướt: Khử trùng bằng hơi nước bão hòa áp suất cao. c. Diệt trùng bằng bức xạ: - Tia tử ngoại: thường dùng tia UV. - Tia âm cực. 7 III. Giới thiệu và cách sử dụng kính hiển vi: 1. Các bộ phận của kính hiển vi: - Thị kính: Có thể từ một đến 2 thấu kính thủy tinh cho phép tạo ra ảnh cuối cùng của vật qua hệ quang học. Độ phóng đại của thị kính khá nhỏ, thường chỉ dưới 10x, và được lắp đặt trong một ống trụ, cho phép thay đổi dễ dàng. - Giá điều chỉnh vật kính. - Vật kính: là thấu kính quan trọng nhất của các hệ tạo ảnh nhờ thấu kính, là một (hoặc có thể là hệ nhiều thấu kính) có tiêu cự ngắn, cho phép phóng đại vật với độ phóng đại lớn. Nhờ có giá điều chỉnh, các vật kính khác nhau có thể xoay để thay đổi trị số phóng đại. Trên vật kính có thể ghi các trị số phóng đại 4x, 10x, 40x, 100x. Trong một số vật kính đặc biệt như 100x, người ta có thể sử dụng dầu nhằm tăng độ phân giải của hệ thống. - Giá vi chỉnh, cho phép điều chỉnh độ cao của mẫu vật để lấy nét trong quá trình tạo ảnh. - Giá đặt mẫu vật - Hệ thống đèn, gương... tạo ánh sáng để chiếu sáng mẫu vật. 8 - Hệ thống khẩu độ, và các thấu kính hội tụ để hội tụ và tạo ra chùm sáng song song chiếu qua mẫu vật. - Vi chỉnh cho phép dịch chuyển mẫu vật theo chiều ngang để quan sát các phần khác nhau theo ý muốn. 2. Cách sử dụng kính hiển vi: - Để kính lên mặt bàn ở vị trí an toàn, độ cao phù hợp với người sử dụng. - Cắm điện, bật công tắc. - Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu bản và mục đích quan sát để chọn vật kính thích hợp. Quan sát từ vật kính có bội giác thấp nhất. - Điều chỉnh ánh sáng. - Hạ vật kính sát vào tiêu bản (mắt nhìn tiêu bản). - Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc điều chỉnh để đưa vật kính lên cho đến khi nhìn thấy hình ảnh mờ của vật mẫu. - Điều chỉnh ốc chỉnh tinh để được hình ảnh rõ nét. *Bảo quản kính hiển vi: - Sử dụng và bảo quản kính hiển vi một cách thận trọng. - Đặt kính ở nơi khô thoáng, vào cuối ngày làm việc đặt kính hiển vi vào hộp có gói hút ẩm silicagel để trách bị mốc. - Lau hệ thống giá đỡ hàng ngày bằng khăn lau sạch, lau vật kính dầu bằng giấy mềm chuyên dụng có tẩm xylen hoặc cồn. - Định kỳ kiểm tra an toàn các dây nguồn và ổ cắm và luôn có đồ dự trữ để thay thế. Quá trình chùi rửa và tinh chỉnh nên được thực hiện chuyên nghiệp tại các gian hàng phụ kiện quang học đặc biệt là kính hiển vi. Trừ khi là một người chuyên nghiệp nếu không đừng tự ý rửa hoặc điều chỉnh các tấm kính bên trong kính hiển vi. - Khi kính hiển vi không sử dụng, nó nên được đặt vào trong hộp hoặc thùng bảo quản, che nắp và lưu trữ ở khu vực an toàn để không bị va chạm hoặc lấy mất. Nếu sử dụng 9 một nắp đậy bằng vinyl dễ bám bụi, bao phủ lần haikính hiển vi với một túi nhựa. Khi bụi bám quá nhiều lên túi, nên thay thế nó. - Bảo dưỡng, mở kính lau hệ thống chiếu sáng phía trong định kỳ. IV. Kết quả, nhận xét: - Các nút bông làm được gọn, không bị xơ, độ dài nút bông phù hợp với ống nghiệm, bình tam giác. - Bao gói các dụng cụ vi sinh bằng báo kín, gọn gàng, đẹp. - Biết cách sử dụng tủ sấy để thanh trùng dụng cụ sau khi đã bao gói. - Biết cách sử dụng và bảo quản kính hiển vi. - Làm tiêu bản tạm thời để soi kính hiển vi. 10 Buổi 2: Bài 3: PHƢƠNG PHÁP CHUẨN BỊ MÔI TRƢỜNG LỎNG VÀ ĐẶC ĐỂ PHÂN TÍCH CHỈ TIÊU VI SINH VẬT VÀ PHƢƠNG PHÁP CẤY VI SINH VẬT TRÊN MÔI TRƢỜNG THẠCH ĐĨA VÀ ỐNG THẠCH ( Ngày 23/11/2016 ) I. Mục tiêu: Nhận dạng xác định các nhóm vi sinh vật thông qua: - Đặc điểm hình thái. - Hoạt tính ( 3 chỉ tiêu: vật lý, hóa học, sinh học) Hoạt động quan trắc và phân tích giúp cho việc định lượng tế bào vi sinh vật (số lượng tế bào, số lượng cá thể trên một đơn vị) II. Các phƣơng pháp định lƣợng tế bào vi sinh vật 1. Đo độ đục: Cho ánh sáng xuyên qua môi trường từ đó ta tính được phần trăm ánh sáng đi qua môi trường là bao nhiêu. 2. Đếm trực tiếp: ta lấy mẫu ngoài tự nhiên sau đó đếm bằng buồng đếm hồng cầu. *Nhược điểm của phương pháp: - Có thể gây nhầm lẫn giữa tế bào vi sinh vật này với tế bào vi sinh vật khác. - Nhầm lẫn giữa tế bào sống và tế bào chết. - Mật độ thấp quá hay cao quá đều gây khó khăc cho việc đếm. 3. Nuôi cấy: - Phương pháp CFU là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường thạch (đĩa petri). Sau 24 giờ tế bào vi sinh vật sẽ phát triển tạo thành các khuẩn lạc. Đếm số khuẩn lạc tạo thành rồi tính kết quả. - Phương pháp MPN là phương pháp định lượng nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường lỏng (ống durhan) từ đó có kết quả định tính của 1 loại thí nghiệm được lặp lại ở 1 số độ pha loãng khác nhau. 11 III. Chuẩn bị hóa chất, thiết bị, dụng cụ: 1. Thiết bị: - Nồi hấp khử trùng. - Tủ khử trùng bằng tia UV 2. Dụng cụ: - Đĩa peptri - Ống nghiệm - Ống durhan - Pipet - Đèn cồn - Cốc thủy tinh - Bếp điện 3. Hóa chất: - Cao thịt : 2,5g - NaCl : 2,5g - Pepton :2,5g - Bột thạch: 10g - Nước cất: 500ml IV. Quy trình thực hiện: 1. Làm môi trƣờng đặc (môi trƣờng thạch ống, đĩa thạch): - Cân chính xác các nguyên liệu trên cho vào cốc chứa một ít nước. - Đun trên bếp điện cho nguyên liệu tan và chín hoàn toàn. - Thêm nước cất và định mức đến 500ml. - Phân phối và cho vào bình tam giác 250ml. - Hấp khử trùng bằng nồi hấp ở 121 0C trong 1 giờ. - Sau khi hấp phân phối vào đĩa petri và ống nghiệm. - Hơ xung quanh đĩa peptri, bình tam giác và nút bông qua ngọn lửa đèn cồn. - Mở hé đĩa peptri, nút bông ở ống nghiệm. Rót 8-10ml môi trường vừa làm được vào sau đó đạy kín lại. 12 - Khử trùng đĩa peptri, nút bông, đầu ống nghiệm và đầu bình tam giác một lần nữa. - Các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng để nghiêng trong khay để dụng cụ. Chú ý: Tất cả quy trình trên được thực hiện trong tủ vô trùng bằng tia UV. 2. Đối với môi trƣờng lỏng: - Cân 2,5g cao thịt, 2,5g NaCl, 2,5g pepton cho vào cốc chứa một ít nước. - Đun trên bếp điện cho nguyên liệu tan và chín hoàn toàn. - Thêm nước cất và định mức đến 500ml. - Phân phối vào các ống durhan. - Hấp khử trùng bằng nồi hấp ở 121 0C trong 1 giờ. V. Kết quả: - 20 môi trường trên đĩa thạch. - 10 môi trường thạch nghiêng. - 10 môi trường thạch đứng. - 30 môi trường lỏng trong ống lurhan. - Môi trường thạch làm được sau 15 phút đã đông đạt yêu cầu bài. 13 Môi trường thạch nghiêng VI. Nhận xét: - Trong quá trình làm môi trương chưa được vô trùng tuyệt đối. - Sau khi được hấp khử trùng môi trường trong các bình tam giác chưa được đậy kín. - Không phân phối môi trường vào các ống durhan trước khi hấp mà sau khi hấp xong mới phân phối. Cách khắc phục lỗi: Sau khi thực hiện xong toàn bộ quy trình hấp khử trùng them một lần nữa. tuy mất nhiều thời gian nhưng đảm bảo được các môi trường là vô trùng và không bị nhiễm bẩn. 14 Buổi 3 Bài 4: PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ CHỌN GIỐNG VSV PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VSV VÀ CẤY TRUYỀN VSV ( Ngày 24/11/2016 ) I. Mục đích: - Sinh viên nắm được ý nghĩa của việc phân lập, nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật trong công tác phân tích vi sinh - Các nguyên tắc cơ bản của quá trình phân lập, nuôi cấy, bảo quản vi sinh vật. Kỹ năng thực hành: - Kỹ năng phân lập vi sinh vật Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ ở môi trường trên đĩa peptri để cấy chuyền. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập - Kỹ năng nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí Các thao tác chuyển từ ống nghiệm sang các loại môi trường: thạch nghiêng, thạch đứng, thạch đĩa Các kiểu cấy khác nhau trên các kiểu môi trường trên - Kỹ năng bảo quản các chủng vi sinh vật cần thiết II. Chuẩn bị hóa chất, nguyên liệu, dụng cụ: 1. Hóa chất, nguyên liệu: - Môi trường thạch đứng, thạch đĩa, thạch nghiêng để nuôi cấy vi sinh vật. - Các ống giống nấm men, nấm mốc, sữa chua, đất. 2. Dụng cụ: - Que cấy đầu tròn, đầu nhọn, đầu thẳng. - Pipet 1ml, que trang 15 - Đèn cồn, bật lửa. - Ống nghiệm, đĩa peptri. III. Phân lập vi sinh vật: 1. Cách pha loãng mẫu: - Đối với mẫu chất lỏng: dung pipet hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng lầ 10-1. Tiếp tục từ ống 10-1 hút tiếp 1ml cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng -> độ pha loãng là 10-2. Tiếp tục như vậy đến nồng độ cần thiết. - Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 1g mẫu sau đó cho vào 9ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-1. Và tiếp tục pha loãng như mãu nước. 16 2.  Phân lập vi sinh vật: Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật. Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ.  - Phân lập vi sinh vật trên môi trường thạch trên đĩa peptri: Tạo các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường phân lập Nếu mẫu banđầu ở dạng rắn thì phải chuyển nó về dạng lỏng bằng cách hòa tan mẫu. Tiếp tục pha loãng mẫu ở các nồng độ cần thiết. Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng. - Đối với sinh vật hiếu khí Hút 0,1ml dung dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa peptri có môi trường thích hợp Dung que trang trải đều mẫu khắp mặt thạch Tiếp tục sử dụng que trang này trải đều khắp mặt thạch ở đĩa thứ 2, đĩa thứ 3. Ủ các đĩa ở nhiệt độ thích hợp trong một khoảng thời gian nhất định ta sẽ thu được các khuẩn lạc riêng rẽ. Chú ý: Que trang sử dụng từ nồng độ pha loãng cao đến nộng độ thấp. - Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập Kiểm tra vết cấy: quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật trên môi trường đĩa thạch. Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập tinh khiết thì giữ lại. nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ. Kiểm tra độ thuần của các khuẩn lạc: chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng. Tách các khuẩn lạc này ra, hòa tan và pha loãng ở nồng độ cần thiết trong nước cất vô trùng. Nhỏ một giọt dịch trên vào đĩa peptri có môi trường. dùng que trang trải đều dịch khắp mặt đĩa thứ nhất rồi đĩa thứ 2, thứ 3. Ủ đĩa peptri ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Sau đó quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ. Sự thần khiết của khuẩn lạc và biểu hiện sự thuần khiết của giống. 17 IV. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật: 1. Mục đích: - Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu. - Tiến hành nhân giống vi sinh vật một cách nhanh chóng. - Bảo tồn các giống thuần khiết. - Nghiên cứu các đặc tính sinh học và hệ thống sinh học của chúng. 2. - Nguyên tắc: Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh nhiễm khuẩn. - Môi trường và dụng cụ nuôi cấy phải được khử trùng. - Duy trì các điều kiện thuận lợi để vi sinh vật phát triển. Các phươn pháp nuôi cấy: 3. - Phương pháp cấy trên thạch nghiêng - Phương pháp cấy trên thạch đứng. 4. Phương pháp cấy chuyển. Phương pháp cấy trên đĩa peptri. Cách tiến hành: a. Cấy trực tiếp: - Khử trùng tủ nuôi cấy bằng tia UV trong 40 phút. - Cho các dụng cụ như bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm đã được hấp khử trùng vào tủ. - Tay phải cầm que cấy và đốt đỏ trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. - Tay trái cầm 2 ống nghiệm một ống giống và một ống môi trường. Dùng ngón áp út kẹp và rút nút bông của ống nghiệm ra. - Hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm và nút bông. - Đưa que cấy vào ống nghiệm lấy khuẩn lạc trong ống giống. - Rút que cấy ra và tiến hành cấy theo đường zíc zắc trong ống môi trường. - Khử trùng lại miệng ống nghiệm rồi đậy nút bông, xung quanh đĩa petri. - Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong. 18 Các kiểu cấy trên thạch đĩa b. Hòa tan mẫu: - Khử trùng tủ nuôi cấy bằng tia UV trong 40 phút. - Cho các dụng cụ như bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm đã được hấp khử trùng vào tủ. - Tay phải cầm que cấy và đốt đỏ trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. - Tay trái cầm ống nghiệm giống và một ống chứa nước cất. Dùng ngón áp út kẹp và rút nút bông của ống nghiệm ra. - Hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm và nút bông. - Đưa que cấy vào ống nghiệm lấy khuẩn lạc trong ống giống. - Cho sinh khối lấy được vào ống chứa nước cất rồi đánh đều. - Dùng ống hút cho 1đến 2 ml mẫu vào đĩa peptri rồi đậy nắp. - Khử trùng lại miệng ống nghiệm rồi đậy nút bông, xung quanh đĩa petri. - Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong. Cho vào tủ ủ ở nhiệt độ 350C trong vòng 24 giờ. 19 Phương pháp cấy vi sinh vật trên môi trường đĩa thạch CFU. 5. a. Chuẩn bị dụng cụ. - Các đĩa petri môi trường thạch đã chuẩn bị từ bài số 3. - Các dụng cụ, thiết bị PTN vi sinh như: pipet, đèn cồn, cốc thủy tinh, bình tam giác, bình nước cất... b. Nuôi cấy vi sinh vật.  Chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy gồm: - Môi trường đất: hòa tan mẫu vào nước sau đó lọc để loại bỏ cặn bẩn. - Môi trường nước: dùng trực tiếp để pha loãng. - Môi trường không khí: dùng hộp lồng hứng trực tiếp.  Tiến hành nuôi cấy. Bước 1: Pha loãng mẫu theo các dãy: 10-1, 10-2, 10-3… Bước 2: Lấy 0,1ml mẫu ở các dãy pha loãng của từng mẫu pha loãng cho và từng đĩa thạch. Bước 3: dùng que trang, trang đều mẫu trên mặt đĩa thạch. Bước 4: Gói hộp lồng bằng giấy báo, chuyển các đĩa thạch có mẫu đem đi nuôi trong tủ ấm trong 24-48 giờ ở nhiệt độ thích hợp. 20