Tài liệu Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang naja atra bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH Chuyên ngành: Dị ứng và miễn dịch Mã số: 62 72 01 09 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - NĂM 2017 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Đặng Dũng 2. TS. Trịnh Thanh Hùng Phản biện 1: GS. TS. Nguyễn Thị Dụ Bệnh viện Bạch Mai Phản biện 2: GS. TS. Phạm Văn Thức Trường Đại học Y Dược Hải Phòng Phản biện 3: PGS. TS. Trịnh Xuân Kiếm Bệnh viện Bạch Mai Luận án được bảo vệ trước Hội đồng luận án cấp trường vào hồi: giờ ngày Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư viện Quốc gia 2. Thư viện Học viện Quân y tháng năm 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo số liệu thống kê của Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch mai năm 2015, số bệnh nhân nhập viện do bị rắn hổ cắn chiếm 7,12% tổng số trường hợp ngộ độc nói chung, trong đó có 29% được chẩn đoán xác định do rắn hổ mang cắn [3]. Một trong những loài rắn hổ mang thường gặp và hay gây ra tai nạn rắn cắn ở Miền bắc là rắn hổ mang Naja atra, hay còn được gọi là rắn hổ mang bành. Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn có thể dẫn tới nhiễm độc nọc rắn, nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong hoặc để lại di chứng nặng nề [4]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, thuốc điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn là Huyết thanh kháng nọc rắn [124]. Thế nhưng, điều kiện tiên quyết cho sử dụng Huyết thanh kháng nọc rắn là phải xác định loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn. Tuy nhiên cho đến nay, ở nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn để lựa chọn Huyết thanh kháng nọc rắn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng, do đó thường bị hạn chế. Bên cạnh kỹ thuật ELISA đã được nhiều tác giả trong nước và trên thế giới lựa chọn để phát triển các xét nghiệm phát hiện nọc rắn [5], [29], [86], [107]. Ở Đài loan, Hung D.Z và cộng sự cũng đã áp dụng nguyên lý sắc ký miễn dịch để phát triển bộ xét nghiệm nhanh phát hiện nọc rắn hổ mang và đã có những thành công nhất định [59]. Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch” nhằm hai mục tiêu: 1. Chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra theo nguyên lý sắc ký miễn dịch. 2. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn Naja atra của bộ xét nghiệm trên thực nghiệm và lâm sàng. 2 Tóm tắt những đóng góp mới của luận án: Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên ở Việt nam phát triển thành công bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang bằng kỹ thuật sắc kỹ miễn dịch. Bộ kít có khả năng phát hiện được nọc rắn chuẩn pha trong dung dịch đệm là 5 ng/ml, trong huyết thanh và nước tiểu là 10 ng/ml. Có thể thấy, độ nhạy của bộ kít tương đương với các phương pháp xét nghiệm khác. Bộ kít không có phản ứng chéo với nọc rắn hổ chúa, lục xanh và chàm quạp. Tuy nhiên, bộ kít vẫn có phản ứng chéo với nọc rắn hổ đất ở nồng độ 20 ng/ml. Kết quả thử nghiệm trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng thu thập từ các bệnh nhân được chẩn đoán rắn hổ mang cắn: tỷ lệ xét nghiệm dương tính đối với mẫu huyết thanh là 69,9%; dịch vết cắn là 89,2% và nước tiểu là 60%. Sử dụng bộ kít này có thể giúp các bác sỹ chẩn đoán nhanh rắn hổ mang cắn, từ đó sớm đưa ra chỉ định dùng huyết thanh kháng nọc rắn đặc hiệu, một phương pháp điều trị hiệu quả nhất đối với bệnh nhân bị rắn độc cắn cho đến thời điểm này Bố cục của luận án: Luận án gồm 110 trang, bao gồm: - Đặt vấn đề và mục tiêu nghiên cứu: 2 trang - Tổng quan: 30 trang - Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 24 trang - Kết quả: 28 trang - Bàn luận: 24 trang - Kết luận và kiến nghị: 2 trang Luận án có 16 bảng, 11 biểu đồ, 2 sơ đồ, 31 hình vẽ, 125 tài liệu tham khảo (cụ thể 18 tài liệu Tiếng Việt, 107 tài liệu Tiếng Anh). 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Tai nạn rắn cắn và chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt nam 1.1.1. Tai nạn rắn cắn ở Việt nam Cho đến nay, chưa có số liệu nào thống kê chính xác nào về số ca nhiễm độc và tử vong do rắn cắn. Mặc dù vây, bằng nhiều cách tiếp cận khác nhau, các chuyên gia ước tính mỗi năm nước ta có đến 30.000 trường hợp bị rắn cắn, thủ phạm chủ yếu do hai họ rắn hổ (Elapidae) và họ rắn lục (Viperidae) gây ra [12], [13], [17], [71]. Tại Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch mai, năm 2015, chỉ tính số trường hợp bị rắn hổ cắn đã là 216 trường hợp (chiếm 7,12% so với tổng số bệnh nhân ngộ độc nói chung), trong đó có 29% được chẩn đoán xác định do rắn hổ mang cắn [3]. 1.1.2. Chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam Cho đến nay, ở nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng và nhận biết loài rắn [4], [13]. Chẩn đoán lâm sàng thường dựa vào: • Mô tả của bệnh nhân hoặc người đi cùng về tình huống bị cắn và đặc điểm con rắn gây tai nạn do họ nhìn thấy hoặc bắt được mang theo đến bệnh viện; • Dấu vết móc độc để lại tại vết thương rắn cắn; • Biểu hiện nhiễm độc tại chỗ quanh vết cắn như chảy máu, đau buốt, phù nề, hoại tử; • Biểu hiện nhiễm độc toàn thân như nhiễm độc thần kinh hay rối loạn đông cầm máu. Tuy nhiên, chẩn đoán dựa vào lâm sàng có một số hạn chế do rắn cắn là một tai nạn thường gây hoảng loạn cho bệnh nhân dẫn đến những 4 mô tả sai lệch về con rắn gây tai nạn. Rất ít trường hợp bệnh nhân có thể mang theo con rắn gây tai nạn do không phải lúc nào cũng bắt được rắn. Hơn nữa, những nghiên cứu về đặc điểm nhiễm độc của các loài rắn độc gây tai nạn cho đến nay chưa có nhiều. Một trong những nhược điểm khác nữa là phải dựa trên các biểu hiện và mức độ nhiễm độc của bệnh nhân, những biểu hiện này chỉ có khi nọc rắn đã gây hại cho cơ thể bệnh nhân một cách rõ ràng, tức là ở giai đoạn muộn của bệnh. 1.2. Rắn hổ mang Naja atra 1.2.1. Đặc điểm sinh học và nọc độc Rắn hổ mang Naja atra hay còn gọi là Taiwan cobra, Chinese cobra, là loài thuộc họ Elapidae [4], [13], [65], [116]. Rắn hổ mang N.atra được mô tả lần đầu tiên bởi một bác sỹ, nhà động vật học người Đan mạch là Theodore Edward Cantor vào năm 1842 [105]. Nọc của rắn có độc tính cao, thành phần chính là các neurotoxin, cardiotoxin, haematoxin và Phospholipase A2… [1], [2], [16], [28], [117]. Giá trị LD50 trên chuột 0,62 mg/kg khi tiêm dưới da [78]. 1.2.2. Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn Ở Việt nam, trong nghiên cứu của Nguyễn Kim Sơn (2008), có đến 163/384 bệnh nhân bị rắn hổ mang cắn nhập viện được xác định là do rắn hổ mang N.atra (chiếm 42%) [13]. Khi bị rắn hổ mang cắn ngoài dấu vết của răng độc, đau đớn thường xảy ra trong vòng 10 phút tại vị trí vết cắn. Các triệu chứng đau, đỏ da, sưng nề, chảy máu thậm chí có bọng nước dần nặng lên. Các vết thương tổ chức tại chỗ tương đối rõ ràng, nguyên nhân chính là do tác dụng của cardiotoxin và phospholipase A2 [97], [122]. Theo Nguyễn Kim Sơn, dấu hiệu phù nề + hoại tử sớm gặp ở 100% trường hợp [13]. Hội chứng nhiễm độc thần kinh do tác dụng của các độc tố thần kinh có trong nọc rắn hổ mang gây liệt các dây thần kinh sọ não, liệt cơ hô hấp [13], [28], [122]. 5 1.3. Một số kỹ thuật miễn dịch phát hiện nọc rắn và kháng thể kháng nọc rắn Do thành phần chính của nọc rắn độc đa phần là các độc tố có bản chất là protein [1], [2], [14], [16]. Trong đó đa số đều có tính kháng nguyên cao [42], [49] nên các xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc thường dùng là xét nghiệm miễn dịch [95]. Dưới đây là một số kỹ thuật miễn dịch đã và đang được ứng dụng phát hiện nọc rắn:  Điện di miễn dịch  Ngưng kết hồng cầu  Ngưng kết miễn dịch  Miễn dịch phóng xạ  Miễn dịch huỳnh quang  Miễn dịch quang  Miễn dịch gắn enzym (ELISA)  Kít phát hiện nhanh: dựa trên nguyên lý ELISA, sắc ký miễn dịch 1.4. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 1.4.1. Lịch sử hình thành và phát triển Các nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch được nghiên cứu và khẳng định vào những năm 1980 và những năm cuối của thập kỷ đó [123]. Trong 20 năm gần đây, với việc sử dụng các thế hệ KT, đặc biệt là ứng dụng công nghệ KT đơn dòng và cải tiến nguyên liệu thành phần trong đó có việc sử dụng hạt nano kim loại thay thế các hạt latex làm thành phần cộng hợp (ví dụ: hạt vàng-Au)..., kỹ thuật sắc ký miễn dịch đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực. 1.4.2. Nguyên lý hoạt động 1.4.3. Chế tạo và tối ưu que thử - Thiết kế định dạng que thử: phụ thuộc vào mục đích phát hiện kháng nguyên hay kháng thể, nguyên vật liệu sẵn có và chất lượng của 6 các nguyên vật liệu đó. Que thử có thể theo định dạng theo cơ chế sandwich hoặc cạnh tranh [92], [123]. - Lựa chọn vật liệu: + Chỉ thị màu (nhãn): có nhiều loại hạt nano như hạt nano vàng, nano bạc, hạt từ, latex, phân tử huỳnh quang, enzym… được sử dụng để làm chỉ thị màu trong nguyên lý sắc ký miễn dịch [19], [36], [70], [85], [113]. + Màng: lựa chọn màng màng mao dẫn và các loại màng khác. Các thông số lựa chọn bao gồm: kích thước lỗ, bản chất, độ dày, khả năng thấm, gắn không đặc hiệu, độ bền… [18], [84], [123]. - Xử lý các màng: việc lựa chọn hệ đệm thích hợp để xử lý các màng cũng tùy thuộc vào mục đích phát triển que thử. Mỗi hệ đệm thích hợp cho các mẫu bệnh phẩm khác nhau [18], [84]. - Tối ưu hóa phản ứng cộng hợp: cần có các bước tối ưu về pH dung dịch đệm, nồng độ kháng thể thích hợp [8], [18], [84], [123]. - Tối ưu hóa nồng độ kháng thể trên que thử: trong từng trường hợp cụ thể cần tối ưu nồng độ kháng thể để phản ứng xảy ra tốt nhất nhưng lại tiết kiệm được nguồn nguyên liệu [18], [123]. 1.5. Kháng thể kháng nọc rắn Kháng thể kháng nọc rắn (KTKNR) có trong máu của động vật miễn dịch như ngựa, thỏ và trong trứng gia cầm… được tinh chế qua nhiều công đoạn [5], [10], [29], [39], [40]. Các KTKNR này dễ dàng gắn vào các phân tử khác như các enzyme, các chất đánh dấu như biotin, các chất huỳnh quang, các hạt nano… mà hoạt tính không bị thay đổi sau khi gắn đồng thời vẫn giữ được sau thời gian dài bảo quản. Do những đặc điểm trên KTKNR được ứng dụng nhiều trong chế tạo các kít chẩn đoán và điều trị bệnh nhân rắn cắn [5], [29], [39], [60], [74], [120]. 7 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1.1. Nghiên cứu chế tạo và tách chiết kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra Thỏ đực 12 con cân nặng từ 2-2,5 kg chia làm 4 lô; gà mái chuẩn bị đẻ trứng 12 con cân nặng từ 1,5-2 kg chia làm 4 lô; chuột nhắt trắng 56 con cân nặng 20 ± 02 g/con tất cả đều khỏe mạnh. Huyết thanh ngựa trước và sau khi gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N.atra do Đài loan cung cấp theo Đề tài Nghị định thư giữa Việt nam và Đài loan. 2.1.1.2. Nghiên cứu đánh giá hiệu quả phát hiện nọc rắn hổ mang Naja atra trên lâm sàng Mẫu bệnh phẩm được thu thập ngay sau khi bệnh nhân nhập viện và sau khi được điều trị bằng HTKNR đặc hiệu. Thời gian thu thập: từ tháng 1 đến tháng 12 năm 2014 tại Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai. Trong số các mẫu bệnh phẩm thu thập được, tiến hành lựa chọn các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân được chẩn đoán do rắn hổ mang cắn. 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu - Nọc tổng số của rắn hổ mang N.atra; Nọc tổng số của 4 loài rắn độc khác (Hổ đất, Lục xanh, Chàm quạp và Hổ chúa). - Tá chất Freund hoàn chỉnh và Freund không hoàn chỉnh; kháng thể kháng IgG thỏ, kháng thể kháng IgY gà và kháng thể kháng IgG ngựa gắn enzyme peroxidase; cơ chất OPD của các hãng Sigma, Thermo. 8 - Các loại màng sử dụng trên bộ kít: Màng hút mẫu (Sample pad); Màng chứa kháng thể cộng hợp (Conjugate pad); Màng mao dẫn (Nitrocellulose membrance); Màng hút trên (Absorbent pad) của các hãng Ahlstrom, Whatman. - Bộ kít ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra do Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y nghiên cứu và chế tạo. - Các hoá chất và vật tư tiêu hao khác dùng cho gây miễn dịch, phản ứng ELISA và tối ưu hóa xét nghiệm nhanh. - Hệ thống sắc ký, điện di, đo mật độ quang, hệ thống đo quang phổ khả kiến và hệ thống sản xuất que thử nhanh. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu thập và kiểm định chất lượng nọc rắn 2.2.2. Chuẩn bị kháng nguyên và gây miễn dịch 2.2.3. Phát hiện kháng thể kháng nọc rắn trong huyết thanh 2.2.4. Tách chiết và tinh sạch kháng thể 2.2.5. Kiểm tra độ đặc hiệu của các kháng thể với các kháng nguyên nọc rắn 2.2.6. Hấp phụ miễn dịch 2.2.7. Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể 2.2.8. Tối ưu hóa phản ứng cộng hợp 2.2.9. Tối ưu hóa bộ xét nghiệm nhanh 2.2.10. Xác định thông số kỹ thuật của xét nghiệm 2.2.11. Thử nghiệm bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn trên các mẫu bệnh phẩm - Để kiểm tra giới hạn phát hiện của bộ kít trên lâm sàng chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên và định lượng nọc rắn trong huyết thanh của 35 bệnh nhân lúc nhập viện và sau khi được điều trị bằng HTKNR bằng Bộ kít ELISA định lượng. 9 - So sánh độ phù hợp chẩn đoán của bộ kít với kết quả xét nghiệm ELISA, xét nghiệm VDK của Đài loan và chỉ định sử dụng HTKNR bằng hệ số KAPPA. 2.3. Xử lý số liệu Sử dụng các thuật toán để tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, tỷ lệ phần trăm, các tứ phân vị (Q1, Q2, Q3), hệ số kappa dựa trên các phần mềm Microsoft Office Excel và SPSS 22.0. 2.4. Đạo đức nghiên cứu Đây là công trình nghiên cứu nhằm giải quyết khó khăn của các nhà lâm sàng trong điều trị nhiễm độc do rắn hổ mang N.atra cắn, góp phần nâng cao chất lượng điều trị, giảm chi phí và thời gian nằm điều trị cho bệnh nhân. Thiết kế nghiên cứu là các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm và trên động vật, không can thiệp trên người. Vì vậy không mang lại bất kỳ tác hại nào cho người bệnh. Các kết quả xét nghiệm chỉ phục vụ cho mục tiêu nghiên cứu của đề tài. 10 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra từ thỏ và gà 3.1.1. Kết quả kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra - Kết quả LD50 được tính theo phương pháp Karber-Behrens trên chuột là 512,5µg/kg. - Kết quả điện di: nọc độc của rắn hổ mang N.atra có chứa nhiều protein có trọng lượng phân tử khác nhau, dao động từ (< 6 kDa) đến (> 188 kDa). 3.1.2. Biến động hiệu giá kháng thể trong quá trình gây miễn dịch - Các lô thỏ, gà được gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N.atra đều tạo ra kháng thể kháng nọc rắn, trước khi gây miễn dịch không có cá thể thỏ và gà nào có kháng thể tự nhiên kháng nọc rắn. - Kháng thể đặc hiệu với nọc rắn hổ mang N.atra bắt đầu xuất hiện sau mũi đầu tiên và tăng dần trong quá trình gây miễn dịch, đạt cao nhất sau 4-5 lần tiêm. 3.1.3. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của các huyết thanh kháng nọc rắn - Kết quả xác định hiệu giá cho thấy, hiệu giá kháng thể đối với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N.atra có trong huyết thanh của các lô thỏ (T2, T3) và lô gà (G3) sau 5 lần gây miễn dịch đều đạt từ 128.000 đến 256.000. Trong huyết thanh ngựa của Đài loan là 256.000 đến 512.000. 11 3.1.4. Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn với kháng nguyên nọc rắn của các loài khác - Có phản ứng chéo giữa kháng thể (IgG, IgY) kháng nọc rắn với nọc rắn của các loài khác. Mức độc phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn với nọc rắn của các loài rắn cùng họ cao hơn so với các loài rắn khác họ. 3.2. Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY từ huyết thanh và trứng gà 3.2.1. Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể - Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể IgG thỏ và IgG ngựa: có 2 đỉnh protein, đỉnh 1 là các protein không bám vào cột, đỉnh 2 là IgG có trong huyết thanh thỏ và ngựa. Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể IgY: có 2 đỉnh protein, đỉnh 1 là các protein không bám vào cột, đỉnh 2 là IgY có trong trứng gà. 3.2.2. Kết quả điện di kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch - Kết quả điện di cho thấy, các kháng thể sau tách chiết và tinh sạch đều có độ tinh sạch cao. 3.2.3. Hoạt tính kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch 0,8 KT ngựa 0,7 KT thỏ KT gà OD 450 nm 0,6 KT ngựa thường 0,5 KT thỏ thường 0,4 KT gà thường 0,3 0,2 0,1 0 8 16 32 64 128 256 512 Blank Độ pha loãng KT x 1000 Biểu đồ 3.6. Hoạt tính kháng thể sau khi tinh sạch 12 - Sau khi tinh sạch hoạt tính của các kháng thể vẫn có hoạt tính khá mạnh với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N.atra. 3.3. Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể với các kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra, hổ đất và hổ chúa 3.3.1. Kiểm tra phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của các kháng thể bằng kỹ thuật Western blot kDa M N. atra N. k. O. h. (100 mg) 188 98 kDa M N. atra N. k. O. h. (100 mg) 62 N. atra N. k. O. h. (100 mg) 49 49 38 38 28 M 62 62 49 38 kDa 188 98 188 98 28 28 17 17 17 14 14 14 6 3 6 1 6 3 2 3 3 (M: thang protein chuẩn, 1: kháng thể IgG thỏ, 2: kháng thể IgG ngựa, 3: kháng thể IgY gà) Hình 3.3. Kiểm tra phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của các kháng thể bằng kỹ thuật Western blot - Kháng thể IgG thỏ phản ứng mạnh với các kháng nguyên < 6 kDa, kháng thể IgY gà phản ứng mạnh với kháng nguyên > 188 kDa và < 6 kDa. Trong khi đó, kháng thể IgG ngựa phản ứng với hầu hết các kháng nguyên nọc rắn. Có phản ứng chéo của các kháng thể với nọc rắn hổ đất và hổ chúa. 3.3.2. Hoạt tính và phản ứng đặc hiệu của các kháng thể với kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra sau hấp phụ miễn dịch - Sau khi hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn hổ đất, hoạt tính của các kháng thể bị giảm mạnh. Trong khi đó, sau khi hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn hổ chúa, hoạt tính của các kháng thể vẫn còn cao. 13 - Hầu hết các kháng thể đặc hiệu với nọc rắn hổ mang N.atra đã bị hấp phụ bởi nọc rắn hổ đất. Trong khi đó, sau khi hấp phụ với nọc rắn hổ chúa, các kháng thể còn lại vẫn phản ứng mạnh với các kháng nguyên đặc biệt là những kháng nguyên < 6 kD, > 188 kDa, 14 và 49 – 62 kDa. 3.4. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể 3.4.1. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp ELISA - Kết quả thử nghiệm trên ELISA cho thấy, sau khi được hấp phụ với nọc rắn hổ chúa, cặp kháng thể IgG thỏ – IgG ngựa vẫn có khả năng phát hiện được hầu hết các nồng độ nọc rắn hổ mang N.atra được thử nghiệm, có ngưỡng phát hiện là 1 ng/ml. Cặp kháng thể IgG ngựa – IgG thỏ và cặp kháng thể IgY gà – IgG ngựa có ngưỡng phát hiện là 3 ng/ml. 3.4.2. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp nhúng trực tiếp - Kết quả thử nghiệm bằng phương pháp nhúng trực tiếp cho thấy, khi sử dụng kháng thể IgG từ thỏ gắn hạt nano vàng và kháng thể IgG từ ngựa nhỏ lên vạch test cho tín hiệu dương tính rõ nhất. 3.5. Kết quả cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng 3.5.1. Tối ưu hóa nồng độ kháng thể và pH dung dịch hạt nano vàng - Khi thay đổi nồng độ kháng thể sử dụng cộng hợp từ 0,5 đến 4µg/250µl hạt nano vàng, nồng độ kháng thể tối ưu là 1,5 – 2µg (6 – 8µg cho 1 ml hạt nano vàng). - Ở pH = 9 phản ứng cộng hợp giữa kháng thể và hạt nano vàng ổn định nhất, ở pH thấp 7 – 8 các hạt vàng có xu hướng vón vào nhau tạo 14 thành nhiều hạt có kích thước lớn (dung dịch có màu xanh tím). Khi cho BSA vào dung dịch cộng hợp, phức hợp có độ ổn định cao hơn. 3.5.2. Kết quả cộng hợp và hoạt tính của kháng thể sau khi cộng hợp với hạt nano vàng - Biểu đồ phổ hấp phụ cho thấy, dung dịch vàng độc lập có đỉnh hấp phụ tại bước sóng 540nm. Cũng ở bước sóng này, phức hợp kháng thể hạt nano vàng có đỉnh hấp phụ thấp hơn hơn và rộng hơn so với dung dịch vàng độc lập. - Kết quả dot-blot cho thấy, kháng thể sau khi cộng hợp với hạt nano vàng vẫn còn hoạt tính đối với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N.atra. 3.6. Kết quả tối ưu xét nghiệm phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra 3.6.1. Hệ đệm - Màng được xử lý bằng đệm tris cho thời gian giải phóng nhanh nhất, màng được xử lý bằng đệm tetraborat với PVP cho thời gian giải phóng chậm nhất. (1: đệm tris, 2: đệm phosphate; 3: đệm tetraborat với PVP) Hình 3.10. Kết quả thử nghiệm lựa chọn hệ đệm - Cả 3 hệ đệm đều cho kết quả dương tính. Tuy nhiên, hệ đệm 3 cho kết quả tốt nhất, tín hiệu màu sắc tại vạch phát hiện rõ hơn khi so với hai trường hợp còn lại. 15 3.6.2. Nồng độ kháng thể ở vạch phát hiện Hình 3.11. Lựa chọn nồng độ kháng thể ở vạch phát hiện - Ở nồng độ kháng thể là 1,5 mg/ml tín hiệu màu sắc tại vạch phát hiện rõ hơn khi so với nồng độ 1 mg/ml. Khi tăng nồng độ kháng thể lên 2 mg/ml, tín hiệu màu sắc không có sự thay đổi rõ rệt. 3.6.3. Nồng độ kháng thể ở vạch chứng Hình 3.12. Lựa chọn nồng độ kháng thể ở vạch chứng - Ở nồng độ kháng thể là 1mg/ml tín hiệu màu sắc tại vạch chứng rõ hơn so với nồng độ 0,5 mg/ml. Khi tăng nồng độ kháng thể lên 1,5 mg/ml, tín hiệu màu sắc không có sự thay đổi rõ rệt. 3.6.4. Nồng độ kháng thể cộng hợp Hình 3.13. Lựa chọn nồng độ kháng thể cộng hợp vàng tối ưu - Tín hiệu màu sắc ở cả hai vạch (chứng, phát hiện) tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể cộng hợp trên quy thử. Ở độ pha loãng 5 lần dung 16 dịch cộng hợp (tương đương OD =10) tín hiệu màu sắc ở cả hai vạch là rõ nhất, trong khi đó ở độ pha loãng 20 lần tín hiệu màu sắc ở khá mờ nhạt và khó quan sát. 3.7. Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của xét nghiệm phát hiện nhanh 3.7.1. Giới hạn phát hiện Hình 3.14. Thử nghiệm khả năng phát hiện nọc rắn ở các nồng độ khác nhau của bộ kít xét nghiệm - Với các mẫu nọc rắn chuẩn pha trong dung dịch đệm bộ kít xét nghiệm có giới hạn phát hiện là 5 ng/ml. - Bộ xét nghiệm không có hiện tượng dương tính giả. Có 2 mẫu âm tính giả (nồng độ 5 ng/ml pha trong huyết thanh và nước tiểu). 3.7.2. Phản ứng chéo - Bộ xét nghiệm có phản ứng chéo với nọc rắn hổ đất ở nồng độ 20 ng/ml, không có phản ứng chéo với nọc rắn hổ chúa, lục xanh và chàm quạp ở nồng độ được thử nghiệm. 3.8. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang của bộ kít trên lâm sàng 3.8.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu - Có đến 50% số bệnh nhân có thời gian nhập viện từ 2 đến 13,75 giờ, số giờ nhập viện sau khi bị rắn cắn trung bình là 9.8 giờ. Nhập viện nhất là 1 giờ và muộn nhất là 120 giờ (5 ngày). - Trong số 113 bệnh nhân lựa chọn lấy mẫu nghiên cứu, có 40 bệnh nhân được chẩn đoán do rắn hổ mang N.atra cắn, 5 bệnh nhân được 17 chẩn đoán do rắn hổ mang N.kaouthia cắn. Còn lại 68 bệnh nhân được chẩn đoán do rắn hổ mang cắn nhưng không rõ loài. 3.8.2. Kết quả định lượng và phát hiện nọc rắn hổ mang trên lâm sàng - Kết quả định lượng nọc rắn trong huyết thanh của 35 bệnh nhân lúc nhập viện cho thấy nồng độ nọc rắn có dải nồng độ từ 2,81 – 159,12 ng/ml; trong đó 50% số trường hợp có nồng độ nọc rắn nằm trong khoảng từ 8,21 – 58,28 ng/ml. - Tỷ lệ xét nghiệm dương tính đối với mẫu huyết thanh là 69,3%; dịch vết cắn là 89,2% và nước tiểu là 60%. Trong đó, tỷ lệ xét nghiệm dương tính đối với các mẫu huyết thanh, dịch vết cắn và nước tiểu trong 3 giờ đầu lần lượt là 67,85%; 95,83% và 53,33%. - Khi so sánh với kết quả xét nghiệm của bộ kít với kết quả xét nghiệm VDK của Đài loan trên mẫu bệnh phẩm huyết thanh, hai xét nghiệm cho kết quả với độ phù hợp khá (KAPPA = 0,78). - Khi so sánh với kết quả xét nghiệm của bộ kít với kết quả xét nghiệm VDK của Đài loan trên mẫu bệnh phẩm dịch vết cắn, hai xét nghiệm cho kết quả với độ phù hợp cao (KAPPA = 0,84). - Khi so sánh với kết quả xét nghiệm của bộ kít với kết quả xét nghiệm VDK của Đài loan trên mẫu bệnh phẩm huyết thanh, hai xét nghiệm cho kết quả với độ phù hợp vừa (KAPPA = 0,41). - Số trường hợp dương tính có chỉ định sử dụng HTKNR là 75/79 (94,93%), số trường hợp âm tính có chỉ định HTKNR là 15/34 (44,12%). Kết quả xét nghiệm của bộ kít với chỉ định sử dụng HTKNR có độ phù hợp vừa (KAPPA = 0,56) - Khi so sánh với kết quả xét nghiệm ELISA trên 70 mẫu huyết thanh trước và sau khi điều trị, bộ kít có khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang khá tốt với độ phù hợp khá (KAPPA = 0,71). 18 CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 4.1. Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra từ thỏ và gà Kết quả lựa chọn liều kháng nguyên, cách thức gây miễn dịch cho thấy các lô thỏ và gà được gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn ở các liều khác nhau đều tạo ra được kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn với hiệu giá cao. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, có hiện tượng phản ứng chéo giữa huyết thanh kháng nọc rắn với nọc của các loài rắn thường gặp khác. Cụ thể là phản ứng chéo giữa kháng thể với nọc rắn hổ đất và hổ chúa mạnh hơn so với nọc rắn chàm quạp và lục xanh. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Đỗ Khắc Đại (2013) và Lê Văn Đông (2003) [5], [42]. Để tinh sạch kháng thể IgG và IgY kháng nọc rắn, chúng tôi sử dụng phối hợp nhiều kỹ thuật tinh sạch như: kỹ thuật tủa, kỹ thuật sắc ký lọc gel, kỹ thuật sắc ký ái lực, kỹ thuật sắc ký miễn dịch [5], [6], [20], [22], [61]. Kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di, kết quả cho thấy, với các phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng thể (IgG, IgY) mà chúng tôi áp dụng có hiệu suất tốt, thu được kháng thể có độ tinh sạch và hoạt tính cao với kháng nguyên nọc rắn. Với hoạt tính như vậy, các kháng thể này đủ điều kiện để thử nghiệm và chế tạo bộ kít. 4.2. Lựa chọn nguồn kháng thể cho tối ưu bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra Kết quả western blot cho thấy, độ đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N.atra có sự khác nhau giữa các kháng thể, sự khác nhau này có thể do sự khác biệt giữa các loài về khả năng tạo đáp ứng miễn dịch. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Brunda và cộng sự