Tài liệu Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang naja atra bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NĂM 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH Chuyên ngành: Dị ứng và Miễn dịch Mã số: 62.72.01.09 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN ĐẶNG DŨNG TS. TRỊNH THANH HÙNG NĂM 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là của riêng tôi và có một phần số liệu trong đề tài (Nghị định thư) có tên: “Hợp tác nghiên cứu chế tạo test chẩn đoán rắn hổ mang cắn”. Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là một thành viên chính. Tôi đã được chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng số liệu đề tài này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Tác giả luận án Nguyễn Ngọc Tuấn MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các biểu đồ Danh mục các sơ đồ Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3 1.1. Tai nạn rắn cắn và chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt nam ................................ 3 1.1.1. Tai nạn rắn cắn ở Việt nam .................................................................... 3 1.1.2. Chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam ....................................................... 5 1.2. Rắn hổ mang Naja atra ................................................................................. 6 1.2.1. Đặc điểm sinh học và nọc độc ............................................................... 6 1.2.2. Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn ................................................... 9 1.3. Một số kỹ thuật miễn dịch phát hiện nọc rắn và kháng thể kháng nọc rắn ................................................................................................................. 12 1.3.1. Điện di miễn dịch ................................................................................. 13 1.3.2. Ngưng kết hồng cầu ............................................................................. 13 1.3.3. Ngưng kết miễn dịch ............................................................................ 14 1.3.4. Miễn dịch phóng xạ.............................................................................. 15 1.3.5. Miễn dịch huỳnh quang........................................................................ 16 1.3.6. Miễn dịch quang ................................................................................... 16 1.3.7. Miễn dịch gắn enzym ........................................................................... 17 1.3.8. Kít phát hiện nhanh .............................................................................. 18 1.4. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch .......................................................................... 19 1.4.1. Lịch sử hình thành và phát triển........................................................... 19 1.4.2. Nguyên lý hoạt động ............................................................................ 21 1.4.3. Chế tạo và tối ưu que thử .................................................................... 23 1.5. Kháng thể kháng nọc rắn........................................................................... 26 1.5.1. Công nghệ chế tạo kháng thể IgG kháng nọc rắn ................................ 26 1.5.2. Công nghệ chế tạo kháng thể IgY kháng nọc rắn ................................ 30 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 33 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ............................................................... 33 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 33 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 34 2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................ 35 2.2.1. Thu thập và kiểm định chất lượng nọc rắn .......................................... 36 2.2.2. Chuẩn bị kháng nguyên và gây miễn dịch ........................................... 37 2.2.3. Phát hiện kháng thể kháng nọc rắn trong huyết thanh ......................... 39 2.2.4. Tách chiết và tinh sạch kháng thể ........................................................ 40 2.2.5. Kiểm tra độ đặc hiệu của các kháng thể với các kháng nguyên nọc rắn ................................................................................................................. 45 2.2.6. Hấp phụ miễn dịch ............................................................................... 45 2.2.7. Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể .................................................... 46 2.2.8. Tối ưu hóa phản ứng cộng hợp ............................................................ 49 2.2.9. Tối ưu hóa bộ xét nghiệm nhanh ......................................................... 50 2.2.10. Xác định thông số kỹ thuật của xét nghiệm ....................................... 55 2.2.11. Thử nghiệm bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn trên các mẫu bệnh phẩm ........................................................................................................... 55 2.3. Xử lý số liệu ............................................................................................... 56 2.4. Đạo đức nghiên cứu ................................................................................... 56 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 57 3.1. Kết quả nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra từ thỏ và gà .......................................................................................................... 57 3.1.1. Kết quả kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra .................. 57 3.1.2. Biến động hiệu giá kháng thể trong quá trình gây miễn dịch .............. 58 3.1.3. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của các huyết thanh kháng nọc rắn ................................................................................................................. 60 3.1.4. Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn với kháng nguyên nọc rắn của các loài khác ........................................................................................... 61 3.2. Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY từ huyết thanh và trứng gà................................................................................................................ 62 3.2.1. Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể .............................................................. 62 3.2.2. Kết quả điện di kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch ...... 63 3.2.3. Hoạt tính kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch................ 64 3.3. Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể với các kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra, hổ đất và hổ chúa ....................................... 65 3.3.1. Kiểm tra phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của các kháng thể bằng kỹ thuật Western blot ................................................................................. 65 3.3.2. Hoạt tính và phản ứng đặc hiệu của các kháng thể với kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra sau hấp phụ miễn dịch ............................................. 66 3.4. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể ................................................................. 68 3.4.1. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp ELISA ................ 68 3.4.2. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp nhúng trực tiếp................................................................................................................ 69 3.5. Kết quả cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng ......................................... 70 3.5.1. Tối ưu hóa nồng độ kháng thể và pH dung dịch hạt nano vàng .......... 70 3.5.2. Kết quả cộng hợp và hoạt tính của kháng thể sau khi cộng hợp với hạt nano vàng ...................................................................................................... 71 3.6. Kết quả tối ưu xét nghiệm phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra.... 72 3.6.1. Hệ đệm ................................................................................................. 72 3.6.2. Nồng độ kháng thể ở vạch phát hiện.................................................... 73 3.6.3. Nồng độ kháng thể ở vạch chứng ........................................................ 74 3.6.4. Nồng độ kháng thể cộng hợp ............................................................... 74 3.7. Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của xét nghiệm phát hiện nhanh ................................................................................................................... 75 3.7.1. Giới hạn phát hiện ................................................................................ 75 3.7.2. Phản ứng chéo ...................................................................................... 76 3.7.3. Độ ổn định của bộ kít xét nghiệm phát hiện nhanh ............................. 76 3.7.4. Bộ kít xét nghiệm phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang .......................... 77 3.8. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang của bộ kít trên lâm sàng............................................................................................................... 77 3.8.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ........................................................... 77 3.8.2. Kết quả định lượng và phát hiện nọc rắn hổ mang trên lâm sàng ....... 78 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ................................................................................. 85 4.1. Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra từ thỏ và gà .............................................................................................................. 85 4.1.1. Kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra ............................... 85 4.1.2. Lựa chọn loài gây miễn dịch ................................................................ 86 4.1.3. Tạo kháng nguyên và quy trình gây miễn dịch .................................... 87 4.1.4. Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể với các kháng nguyên nọc rắn .................................................................................................... 88 4.1.5. Tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY từ huyết thanh và trứng gà................................................................................................................ 89 4.2. Lựa chọn nguồn kháng thể cho tối ưu bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra ............................................................................................... 91 4.3. Tối ưu hóa bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra .................. 93 4.3.1. Lựa chọn nguyên liệu cho bộ kít .......................................................... 93 4.3.2. Tối ưu hóa quy trình cộng hợp ............................................................. 94 4.3.3. Tối ưu hóa hệ đệm và các hóa chất xử lý màng................................... 96 4.3.4. Tối ưu hóa nồng độ kháng thể ............................................................. 97 4.4. Thử nghiệm bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra trên in vitro ................................................................................................................. 99 4.5. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang trên lâm sàng ................. 102 4.5.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ......................................................... 102 4.5.2. Thử nghiệm khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang trên mẫu lâm sàng............................................................................................................. 103 KẾT LUẬN ...................................................................................................... 109 KIẾN NGHỊ ..................................................................................................... 110 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN ............................................................................................... 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 112 PHỤ LỤC ......................................................................................................... 126 DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT Phần viết đầy đủ TT Phần viết tắt 1 BSA Bovine Serum Albumin (Albumine huyết thanh bò) 2 CFA Completed Freund's Adjuvant (Tá chất Freund hoàn chỉnh) 3 CNBr Cyanogen Bromide 4 ECVAM European Centre for the Validation of Alternative Methods 5 EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide 6 ECL Enhanced chemiluminescence 7 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzym) 8 HRP Horseradish Peroxidase 9 HTKNR Huyết thanh kháng nọc rắn 10 ICA Immunochromatographic assay (Sắc ký miễn dịch) 11 IFA Incompleted Freund's Adjuvant (Tá chất Freund không hoàn chỉnh) 12 IgG Immunoglobulin G (Kháng thể lớp IgG) 13 IgY Yolk Immunoglobulin (Kháng thể IgY) 14 KN Kháng nguyên 15 KT Kháng thể 16 KTKNR Kháng thể kháng nọc rắn 17 LD50 Lethal dose, 50% (Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) 18 LFIA Lateral flow Immunoassay (Miễn dịch dòng chảy bên) 19 NC Nitrocellulose (Màng Nitrocellulose) 20 OIA Optical immunoassay (Miễn dịch quang) 21 OPD O – phenylene diamine (Cơ chất) 22 PBS Phosphat Buffer Salin (Dung dịch đệm phosphat) 23 PEG Polyethylene Glycol 24 PVA Polyvinyl Alcohol 25 PVDF Polyvinylidene Fluoride (Màng PVDF) 26 PVP Polyvinyl Pyrrolidone 27 RIA Radioimmunoassay (Miễn dịch phóng xạ) 28 TBS Tris-Buffered Saline 29 TBS-T Tris-Buffered Saline + Tween 20 30 TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine 31 SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Electrophoresis 32 WHO World health oganization (Tổ chức y tế thế giới) Gel DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Ưu và nhược điểm của các vật liệu sử dụng làm màng cộng hợp 25 2.1. Liều kháng nguyên sử dụng gây miễn dịch cho thỏ và gà 37 3.1. LD0 và LD100 của nọc rắn hổ mang Naja atra 57 3.2. Tỷ lệ tử vong của chuột sau 24 giờ tiêm nọc rắn hổ mang Naja atra 57 3.3. Tính kết quả LD50 theo phương pháp Karber-Behrens 57 3.4. Kết quả thử nghiệm với kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra 68 3.5. Thời gian giải phóng kháng thể cộng hợp 72 3.6. Kết quả xác định khả năng phát hiện nọc rắn của bộ kít xét nghiệm ở các nồng độ khác nhau 3.7. 75 Phản ứng chéo của bộ kít xét nghiệm với nọc của một số loài rắn độc khác 76 3.8. Kết quả thử nghiệm độ ổn định của bộ kít 76 3.9. Kết quả phát hiện nọc rắn trong các mẫu bệnh phẩm theo thời gian nhập viện 3.10. 80 Kết quả xét nghiệm của bộ kít so với xét nghiệm VDK của Đài loan trên mẫu bệnh phẩm huyết thanh 81 3.11. Kết quả xét nghiệm của bộ kít so với xét nghiệm VDK của Đài loan trên mẫu bệnh phẩm dịch vết cắn 3.12. 82 Kết quả xét nghiệm của bộ kít so với xét nghiệm VDK của Đài loan trên mẫu bệnh phẩm nước tiểu 83 3.13. Kết quả xét nghiệm của bộ kít và chỉ định sử dụng HTKNR 84 3.14. Kết quả xét nghiệm của bộ kít so với xét nghiệm ELISA 84 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ 3.1. Biến động hiệu giá kháng thể đặc hiệu của các lô thỏ trong quá trình gây miễn dịch 3.2. 59 Xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu của 3 huyết thanh kháng nọc rắn 3.4. 58 Biến động hiệu giá kháng thể đặc hiệu của các lô gà trong quá trình gây miễn dịch 3.3. Trang 60 Phản ứng chéo giữa huyết thanh kháng nọc rắn với nọc rắn của các loài khác 61 3.5. Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể IgG và IgY 62 3.6. Hoạt tính kháng thể sau khi tinh sạch 64 3.7. Hoạt tính của các kháng thể với nọc rắn hổ mang Naja atra sau khi hấp phụ miễn dịch 66 3.8. Phổ hấp phụ của phức hợp kháng thể - hạt nano vàng 71 3.9. Thời gian nhập viện của nhóm BN nghiên cứu sau khi bị rắn cắn 80 3.10. Phân bố bệnh nhân được lựa chọn lấy mẫu theo chẩn đoán 78 3.11. Nồng độ nọc rắn trong huyết thanh của bệnh nhân lúc nhập viện 79 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ Tên Sơ đồ Trang 2.1. Thiết kế nghiên cứu 35 2.2. Quy trình chế tạo bộ xét nghiệm nhanh 51 DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1. Số ca nhiễm độc nọc rắn mỗi năm theo khu vực 4 1.2. Rắn hổ mang Naja atra 7 1.3. Phân bố của rắn hổ mang Naja atra 8 1.4. Biến chứng hoại tử tổ chức do rắn hổ mang Naja atra cắn và hình ảnh mẫu vật do bệnh nhân đem đến 10 1.5. Hệ thống sản xuất que thử điển hình 20 1.6. Cấu tạo bộ kít phát hiện nhanh 21 1.7. Nguyên lý hoạt động theo cơ chế sandwich 22 1.8. Nguyên lý hoạt động theo cơ chế cạnh tranh 23 1.9. Sự khác nhau về màu sắc giữa các kích thước của hạt nano vàng 24 1.10. Mối liên quan giữa đặc tính màng mao dẫn và hiệu suất của que thử 25 2.1. Chế tạo kháng nguyên và gây miễn dịch trên thỏ và gà 38 2.2. Các bước thẩm tích loại muối 41 2.3. Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể bằng kỹ thuật ELISA 46 2.4. Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể trực tiếp trên que thử 48 2.5. Thiết kế xét nghiệm nhanh theo nguyên lý sắc ký miễn dịch 50 2.6. Hệ thống in và trải kháng thể 53 3.1. Kết quả điện di nọc rắn hổ mang Naja atra 58 3.2. Các kháng thể sau quá trình tách chiết và tinh sạch 63 3.3. Kiểm tra phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của các kháng thể bằng kỹ thuật Western blot 3.4. Kiểm tra phản ứng đặc hiệu của các kháng thể bằng kỹ thuật Western blot sau hấp phụ miễn dịch 3.5. 65 67 Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp nhúng trực tiếp 69 3.6. Kết quả tối ưu nồng độ kháng thể 70 3.7. Kết quả tối ưu pH dung dịch hạt nano vàng 70 3.8. Hoạt tính kháng thể sau khi cộng hợp hạt nano vàng bằng kỹ thuật dot-blot 71 3.9. Khả năng thấm màng cộng hợp trước và sau khi xử lý 72 3.10. Kết quả thử nghiệm lựa chọn hệ đệm 73 3.11. Lựa chọn nồng độ kháng thể ở vạch phát hiện 73 3.12. Lựa chọn nồng độ kháng thể ở vạch chứng 74 3.13. Lựa chọn nồng độ kháng thể cộng hợp vàng tối ưu 74 3.14. Thử nghiệm khả năng phát hiện nọc rắn ở các nồng độ khác nhau của bộ kít xét nghiệm 3.15. 75 Bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang 77 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Rắn độc cắn là một cấp cứu ngộ độc thường gặp. Theo các chuyên gia ước tính, ở nước ta hàng năm có khoảng 30000 trường hợp bị rắn cắn [71]. Thủ phạm gây ra các vết cắn có độc chủ yếu thuộc hai họ rắn hổ và rắn lục [12], [13]. Theo số liệu thống kê của Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch mai năm 2015, số bệnh nhân nhập viện do bị rắn hổ cắn chiếm 7,12% tổng số trường hợp ngộ độc nói chung, trong đó có 29% được chẩn đoán xác định do rắn hổ mang cắn [3]. Một trong những loài rắn hổ mang thường gặp và hay gây ra tai nạn rắn cắn ở Miền bắc là rắn hổ mang Naja atra, hay còn được gọi là rắn hổ mang bành. Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn có thể dẫn tới nhiễm độc nọc rắn, nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong hoặc để lại di chứng nặng nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của nạn nhân sau khi sống sót [4]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, thuốc điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn là Huyết thanh kháng nọc rắn, chế tạo từ huyết thanh động vật được gây miễn dịch [124]. Thế nhưng, điều kiện tiên quyết cho sử dụng Huyết thanh kháng nọc rắn là phải xác định loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn. Tuy nhiên cho đến nay, ở nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn để lựa chọn Huyết thanh kháng nọc rắn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng, do đó thường bị hạn chế và chỉ được thực hiện ở các bệnh viện tuyến cuối nơi có các chuyên gia nhiều kinh nghiệm. Hơn thế nữa, ngay cả tại các bệnh viện tuyến cuối, việc xác định loài rắn và lựa chọn Huyết thanh kháng nọc rắn thường cũng chỉ thực hiện được khi các biểu hiện lâm sàng đã rõ, điều này dẫn đến sử dụng Huyết thanh kháng nọc rắn muộn, chủ yếu để cứu tính mạng nạn nhân chứ chưa hạn chế được những di chứng tổn thương do nọc độc gây ra. Chính vì vậy, việc xác định chính xác nọc độc của của loài rắn gây tai nạn trong cơ thể nạn nhân rắn cắn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, vừa giúp sơ cấp cứu đúng cách vừa định hướng lựa 2 chọn đúng loại Huyết thanh kháng nọc rắn để sử dụng, đem lại hiệu quả điều trị cao và an toàn hơn cho nạn nhân. Do thành phần chính của nọc rắn độc đa phần là các độc tố có bản chất là protein [1], [2], [14], [16]. Trong đó đa số đều có tính kháng nguyên cao [42], [49]. Nên các xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc thường dùng là xét nghiệm miễn dịch dựa vào tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên nọc rắn với các kháng thể đặc hiệu có trong thành phần của bộ xét nghiệm. Ở Việt nam, Hà Thị Hải và cộng sự đã nghiên cứu thành công bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra [7]. Tuy nhiên, ở khía cạnh giúp phát hiện nhanh nọc rắn bộ xét nghiệm khó có thể được coi như một xét nghiệm cấp cứu do có thời gian tiến hành tương đối dài. Bên cạnh kỹ thuật ELISA đã được nhiều tác giả trong nước và trên thế giới lựa chọn để phát triển các xét nghiệm phát hiện nọc rắn [5], [29], [107]. Xét nghiệm dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch là kỹ thuật có nhiều ưu điểm như có độ nhạy cao trong khi thời gian tiến hành nhanh, kỹ thuật này cũng dễ triển khai và có thể sử dụng trên thực địa [123]. Ở Đài loan, Hung D.Z và cộng sự cũng đã áp dụng nguyên lý này để phát triển bộ xét nghiệm nhanh phát hiện nọc rắn hổ mang và đã có những thành công nhất định [59]. Qua đó có thể thấy việc nghiên cứu chế tạo bộ kít chẩn đoán nhanh rắn hổ mang Naja atra cắn với nguyên lý sắc ký miễn dịch là thích hợp với điều kiện thực tế ở Việt nam, nơi mà tai nạn rắn độc cắn thường xuyên xảy ra ở các khu vực nông thôn và miền núi, những nơi xa các trung tâm y tế. Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch” nhằm hai mục tiêu: 1. Chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra theo nguyên lý sắc ký miễn dịch. 2. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn Naja atra của bộ xét nghiệm trên thực nghiệm và lâm sàng. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Tai nạn rắn cắn và chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt nam 1.1.1. Tai nạn rắn cắn ở Việt nam Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới với địa hình và khí hậu khác nhau giữa các miền Bắc, Trung, Nam. Từ đặc điểm tự nhiên đó đã tạo nên sự đa dạng sinh học ở nước ta, trong đó có rắn độc. Theo các tác giả Trần Kiên và Nguyễn Quốc Thắng, Việt Nam có hơn một trăm loài rắn, trong đó có hàng chục loài rắn độc phân bố cả trên cạn và dưới nước [11]. Theo cách phân loại của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) [124] và dựa trên các nghiên cứu đáng tin cậy trong nước có thể phân loại rắn độc ở nước ta thành 2 nhóm [6], [10], [12], [13], [17]: - Nhóm 1: bao gồm các loài rắn có độc tính cao, thường gặp hoặc phân bố rộng rãi và gây nên tỷ lệ bị nhiễm độc, tử vong và tàn phế cao. Thuộc nhóm này có rắn hổ mang ở miền Bắc (Naja atra) và miền Nam (Naja kaouthia), rắn cạp nia ở miền Bắc (Bungarus multicinctus) và miền Nam (Bungarus candidus), rắn chàm quạp (Calloselasma rhodostoma, ở miền Nam), rắn lục tre (Cryptelytrops alborabris) trên cả nước và rắn lục mũi hếch (Deinagkistrodon acutus). - Nhóm 2: bao gồm các loài rắn có độc tính cao và có thể gây tỷ lệ ngộ độc, tử vong và tàn phế nhưng: ▪ Thiếu các số liệu lâm sàng hoặc dịch tễ và/hoặc ▪ Ít cắn người hơn (do chu kỳ hoạt động, hành vi, nơi cư trú mà rắn ưa thích hoặc chỉ ở các vùng ít dân cư. Thuộc nhóm này có rắn cạp nia đầu đỏ (ở Đồng Nai, Bungarus flaviceps), Cryptelytrops macrops, rắn hổ mèo (Naja siamensis, miền Nam), rắn khô mộc (Protobothrops mucrosquamatus, miền Bắc), rắn hổ chúa (Ophiophagus hanah, cả 4 nước), rắn lục xanh (Viridovipera stejnegeri, miền Bắc và Trung) và rắn cạp nong (Bungarus fasciatus). Cho đến nay, chưa có số liệu nào thống kê chính xác nào về số ca nhiễm độc và tử vong do rắn cắn. Mặc dù vây, bằng nhiều cách tiếp cận khác nhau, các chuyên gia ước tính mỗi năm nước ta có đến 30.000 trường hợp bị rắn cắn, thủ phạm chủ yếu do hai họ rắn hổ (Elapidae) và họ rắn lục (Viperidae) gây ra [12], [13], [17], [71]. Hình 1.1. Số ca nhiễm độc nọc rắn mỗi năm theo khu vực *Nguồn: theo Kasturiratne A. và cộng sự (2008) [71] Tại Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch mai, năm 2015, chỉ tính số trường hợp bị rắn hổ cắn đã là 216 trường hợp (chiếm 7,12% so với tổng số bệnh nhân ngộ độc nói chung) [3]. Số liệu trên đây chỉ là “phần nổi của tảng băng” vì rất nhiều trường hợp tử vong không được thống kê. Một nguyên nhân quan trọng là phần lớn người bị rắn cắn thường lựa chọn điều trị theo