Tài liệu Luận văn nghiên cứu ứng dụng enzym protease để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men

LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo – Tiến Sỹ Quản Lê Hà - Người đã trực tiếp hướng dẫn và dìu dắt em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em tiến hành thí nghiệm và hoàn thành đề tài. Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Hoá sinh đã hỗ trợ em thực hiện một số thí nghiệm trong thời gian triển khai đề tài. Em xin chân thành cảm ơn sự động viên, chia sẻ, giúp đỡ của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian vừa qua. Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2008 Sinh viên Trịnh thị Thuỳ DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae Hình 1.2. Cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces Hình 1.3. Sản phẩm Marmit Hình 1.4. Sản phẩm Vegemite Hình 1.5. Chế phẩm β – glucan Hình 1.6. Vị trí xúc tác của neutrase gồm 3 gốc Asp 102, His57 và Ser195 Hình 2.1. Đường chuẩn glutamic Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Hình 3.2. Ảnh hưỏng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme Hình 3.3. Ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Hình 3.4. Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Hình 3.7. So sánh khả năng thuỷ phân của flavourzyme, neutrase, phương pháp tự phân Hình 3.8. Sắc ký đồ Bảng 1.1. Ảnh hưởng của NaCl đến sự phân bố độ ẩm của nấm bảng 1.2. Thành phần của nấm men trích ly sản xuất bằng phương pháp thuỷ phân Bảng 3.1. Kết quả đo độ ẩm Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Bảng 3.3. Ảnh hưỏng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme Bảng 3.4. Ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Bảng 3.5. Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Bảng 3.8. So sánh khả năng thuỷ phân của flavourzyme, neutrase, phương pháp tự phân nấm men DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EDTA : Ethylen Diamin Tetra Acetic Acid HdP :Hoạt độ protease KTĐ :Khô tuyệt đối TCA :Trichloroaceticacid TGTP : Thời gian thuỷ phân MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................ 2 1.1. Nấm men Saccharomyces và ứng dụng ............................................. 2 1.1.1. Giới thiệu về Saccharomyces ...................................................... 2 1.1.1.1. Hình dạng và kích thước tế bào nấm men ............................ 2 1.1.1.2. Cấu tạo tế bào nấm men ........................................................ 3 1.1.1.3. Thành phần hoá học của tế bào nấm men ............................. 6 1.1.2. Các ứng dụng của nấm men trong ngành công nghiệp thực phẩm ................................................................................................................ 8 1.1.2.1. Ứng dụng trong sản xuất các đồ uống lên men .................... 8 1.1.2.2. Ứng dụng để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men ................. 9 1.1.2.3. Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm bánh mì ................ 10 1.1.2.4. Thu nhận enzym .................................................................. 10 1.1.2.5. Thu nhận protein ................................................................. 10 1.1.2.6. Sử dụng sinh khối nấm men làm thức ăn chăn nuôi ........... 10 1.1.2.7. Ứng dụng nấm men tạo các sản phẩm chữa bệnh .............. 11 1.1.3. Ứng dụng của dịch thuỷ phân nấm men .................................... 11 1.1.3.1. Sử dụng làm chất điều vị .................................................... 11 1.1.3.2. Sản xuất một số sản phẩm truyền thống ............................. 12 1.1.3.3. Sử dụng làm môi trường vi sinh vật ................................... 13 1.1.3.4. Bổ sung vào quá trình nấu bia ............................................ 14 1.1.3.5. Sử dụng tạo ra một số sản phẩm chữa bệnh ....................... 14 1.1.3.6. Sử dụng làm thức ăn chăn nuôi.......................................... 16 1.2. Tổng quan về protease ...................................................................... 16 1.2.1. Khái quát về protease ................................................................ 16 1.2.1.1. Phân loại protease .............................................................. 16 1.2.1.2. Nguồn gốc protease............................................................ 18 1.2.1.3. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt động của enzym ..... 21 1.2.2. Ứng dụng của protease trong thuỷ phân protein ....................... 23 1.2.2.1. Ứng dụng trong điều chế các dịch đạm thuỷ phân ............. 24 1.2.2.2. Ứng dụng trong sản xuất nước mắm................................... 24 1.2.2.3. Ứng dụng trong quá trình sản xuất bia .............................. 24 1.2.2.4. Ứng dụng trong chế biến thịt cá......................................... 25 1.2.2.5. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác .................... 25 1.2.3. Một số chế phẩm enzym protease từ vi sinh vật ....................... 25 1.2.3.1. Chế phẩm neutrase 0.8L ..................................................... 25 1.2.3.2. Chế phẩm enzym Flavourzyme .......................................... 28 1.3. Các phương pháp thủy phân nấm men ............................................. 29 1.3.1. Phương pháp hoá học ................................................................ 29 1.3.1.1. Thuỷ phân bằng axit............................................................ 29 1.3.1.2. Thuỷ phân bằng kiềm.......................................................... 30 1.3.2. Phương pháp enzym .................................................................. 30 1.3.2.1. Phương pháp tự phân nấm men .......................................... 30 1.3.2.2. Phương pháp thuỷ phân có bổ sung enzym protease .......... 30 1.3.3. Phương pháp thuỷ phân enzym kết hợp với axit: ...................... 31 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 32 2.1. Nguyên vật liệu................................................................................. 32 2.1.1. Nấm men .................................................................................... 32 2.1.2. Các chế phẩm enzym ................................................................. 32 2.1.3. Các loại hoá chất sử dụng trong đề tài....................................... 32 2.1.4. Thiết bị sử dụng ......................................................................... 33 2.2. Các phương pháp nghiên cứu ........................................................... 33 2.2.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzym protease ........................ 33 2.2.2. Phương pháp rửa nấm men ........................................................ 35 2.2.3. Phương pháp xác định độ ẩm .................................................... 35 2.2.4. Nghiên cứu thuỷ phân nấm men ................................................ 35 2.2.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzym protease ......... 35 2.2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thuỷ phân .................. 36 2.2.4.3. Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo ..... 36 2.2.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men của enzym........................... 37 2.2.5. Phương pháp ninhydrin xác định hàm lượng axit amin ............ 37 2.2.6. Phương pháp sắc ký bản mỏng .................................................. 39 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................... 40 3.1. Xác định độ ẩm của nấm men lọc chân không ................................. 40 3.2. Xác định hoạt độ enzym protease .................................................... 40 3.2.1. Xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm Flavourzyme 500MG ................................................................................................. 40 3.2.2. Xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm neutrase 0.8L .............................................................................................................. 41 3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm flavourzyme 500MG ...................................................... 41 3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme ....................................... 41 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thuỷ phân ....................... 43 3.4. Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo .................. 44 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men ..................................................................... 46 3.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L .................................................................. 48 3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ thuỷ phân............................................ 48 3.6.2. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzym neutrase và thời gian thuỷ phân.............................................................................................. 50 3.7. So sánh hiệu quả thuỷ phân bằng chế phẩm enzym neutrase, flavourzyme và phương pháp tự phân ..................................................... 51 KẾT LUẬN............................................................................................ 55 KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................... 57 MỞ ĐẦU Ngành công nghệ sản xuất bia ở Việt Nam ngày càng phát triển. Sản lượng bia ở Việt Nam đã tăng từ 1,29 tỷ lít vào năm 2003; 1,37 tỷ lít năm 2004; 1,5 tỷ lít năm 2005 và đạt 1,7 tỷ lít vào năm 2006. Nấm men bia là một tác nhân quan trọng không thể thiếu tham gia trực tiếp vào quá trình lên men bia. Sau khi lên men, một lượng lớn nấm men thải ra. Trung bình cứ sản xuất ra được 100 lít bia sẽ thải ra môi trường 2 lít men có thuỷ phần 88%. Men bia có hàm lượng protein cao trung bình khoảng 50% (tính theo chất khô), trong thành phần protein có đầy đủ các acid amin, đặc biệt là các acid amin không thay thế. Ngoài ra, nó còn chứa các chất khoáng, giàu vitamin nhóm B, nhóm D và các chất kích thích sinh trưởng. Trong 1 g chất khô của nấm men chứa 300 μg vitamin B1, 40 μg vitamin B2, 50μg vitamin B6, 600μg vitamin PP, 80μg axit pantoteic, 25μg axit folic, 1μg biotin và 500μg inozit. Trên thế giới, nấm men bia được quan tâm nghiên cứu tận dụng với nhiều mục đích khác nhau như làm thực phẩm, làm nguồn thuốc bổ giàu axit amin và vitamin. Tuy nhiên ở Việt Nam hiện nay các nhà máy sản xuất bia vẫn chưa ứng dụng men bia thải ra ngoài một cách hiệu quả, men thải ra từ các nhà máy bia được sử dụng chủ yếu làm thức ăn chăn nuôi, khả năng khai thác các thành phần có giá trị sinh học trong men bia để tạo ra các sản phẩm ứng dụng cho con người còn rất hạn chế. Hơn nữa, nếu không được sử dụng triệt để thì nguồn bã nấm men này còn là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường. Xuất phát từ những điều đó cùng với sự gợi ý của giáo viên hướng dẫn, để góp phần tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cho người bằng nguồn tận thu nấm men bia, em tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzym protease để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men”. Nội dung chính bao gồm: - Nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp để thuỷ phân nấm men bia bằng các chế phẩm enzim Neutrase và Flavourzyme (điều kiện nhiệt độ, nồng độ enzim, thời gian) và so sánh với quá trình tự phân nấm men. - Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo. - Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men của enzym. 1 - Định tính một số thành phần axit amin quan trọng trong sản phẩm thuỷ phân. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Nấm men Saccharomyces và ứng dụng 1.1.1. Giới thiệu về Saccharomyces Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, lớp Ascomycetes, ngành nấm. Là vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động, có khả năng sinh sản nhanh, sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi. Sinh khối của chúng rất giàu protein, vitamin và lipit. Tế bào nấm men thuộc loại Eucaryot (nhân thật), có khả năng hô hấp yếm khí tuỳ tiện. Chúng phân bố rất rộng rãi trong thiên nhiên nhất là trong đất, có thể nói đất là môi trường tự nhiên để giữ giống nấm men và đặc biệt là trên bề mặt của rất nhiều loại lá cây, các loại quả hay các loại cây lương thực thực phẩm khác. Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng tạo thành sinh khối tế bào. Vì thế, nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh mì, sản xuất protein sinh khối, tạo hương nước chấm, sản xuất chất béo,… [18], [23], [25], [26], [34]. 1.1.1.1. Hình dạng và kích thước tế bào nấm men Nấm men thuộc các loài khác nhau thường có hình dạng khác nhau. Ngay trong cùng một loài, hình dạng tế bào cũng thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện sống và tuổi đời. Trong môi trường đặc biệt thì nấm men có hình dạng rất ổn định. Đa số nấm men có hình ovan, hình bầu dục, hình tròn. Nấm men có hình tròn, hình trứng như Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoideus, hình quả chanh như Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hình chai như Saccharomyces ludwigii. So với các vi sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn), nấm men có kích thước tương đối lớn. Một số nấm men được sử dụng trong công nghệ thực phẩm thường có kích thước khoảng 3 ÷ 5 × 5 ÷ 10µm [34]. Kích thước này cũng thay đổi nhiều tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường sống,… 2 Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nảy chồi vẫn dính vào nhau tạo thành chuỗi. Hình 1.1. Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae Hiện nay trên Thế Giới và ở Việt Nam đang sử dụng hai loại nấm men bia, đó là nấm men nổi (Saccharomyces cerevisiae) và nấm men chìm (Saccharomyces carlbergensis), là tế bào hình cầu hay hình trứng, có kích thước 2.5-10 µm chiều rộng và 4.5-21 µm chiều dài. 1.1.1.2. Cấu tạo tế bào nấm men Nấm men là sinh vật đơn bào, hiển vi, tế bào cơ bản giống như ở động vật, thực vật. So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hoá nhảy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn. Cùng với sự tiến hoá về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ,…), ở cơ thể nhân chuẩn xuất hiện nhiều thể không thấy ở thể nhân sơ như: Ti thể, lục lạp,… [26]. 3 Hình 1.2. Cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Trong tế bào có các cấu tử tiểu thể và có thể chia thành: Các cơ quan nội bào hay cơ quan tử của tế bào và các chất chứa trong tế bào hay các thể vùi của tế bào (inclusion). Thành tế bào Thành tế bào dày khoảng 25 nm và chiếm khoảng 25-30 % khối lượng khô tế bào, là lớp vỏ bao quanh tế bào nấm men, tạo hình dáng tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp trong cùng cấu tạo từ β-glucan không tan trong kiềm, lớp giữa cấu tạo từ β-glucan hoà tan, lớp ngoài cùng là mannan photphoryl. Giữa hai lớp màng phía ngoài có chứa các enzym invertaza, photphataza axit, β-glucosidaza, proteaza,…Thành tế bào chứa khoảng 15 kitin cần thiết cho sẹo nảy chồi. Glucan (chủ yếu) và mannan chiếm tới 90% chất khô của vỏ tế bào. Glucan là một polyme phức tạp, có cấu tạo phân nhánh từ các tiểu phần là D-glucoza, phân nhánh có liên kết β-1,6 và β-1,3. Glucan là thành phần chính cấu tạo nên vỏ tế bào, nếu thành phần này bị phá hỏng thì tế bào bị phá vỡ hoàn toàn. Mannan là polyme phân nhánh của đường D-mannanoza, mỗi phân tử thường chứa từ 200-400 gốc mannanoza, có phân tử lượng là 5.9×104, không phải là thành phần quyết định của vỏ tế bào. Nếu bỏ phần mannan hình dáng tế bào không bị biến đổi. 4 Thành tế bào nấm men chứa 6-7 % protein, phần protein của nó thường liên kết vững chắc với phần hidratcacbon và tạo thành các phức chất giàu lưu huỳnh. Ngoài protein, thành tế bào nấm men còn chứa lipit, đường khử, nitơ, các axitamin, và các chất khoáng,…Thành phần hoá học của thành tế bào nấm men có thể thay đổi phụ thuộc vào chủng, điều kiện môi trường sống và tuổi đời [26], [34]. Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất là một lớp màng rất mỏng, dày không quá 0.1nm, dính chặt với tế bào chất, nằm sát vách tế bào. Màng nguyên sinh chất có cấu tạo 3 lớp: Lớp giữa là lipid và photpholipid, hai lớp còn lại là protein. Hai lớp này đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các chất hoà tan và hoạt động của các enzym. Nguyên sinh chất: Nguyên sinh chất của tế bào nấm men là một hệ thống keo cấu tạo bởi protit, lipit, lipoit, polysacarit, muối khoáng, nước. Nguyên sinh chất nằm ngay bên dưới thành tế bào, dày khoảng 80A0, có độ nhớt cao (gấp 800 lần độ nhớt của nước) và chứa tất cả các cấu trúc cơ bản của tế bào. Nhân tế bào: Khác với vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật. Mỗi tế bào nấm men có một nhân hình tròn hoặc hình bầu dục, được bao bọc bởi một màng nhân. Trong nhân là nhân con. Hình dáng và kích thước của nhân có thể thay đổi phụ thuộc vào tuổi và trạng thái sinh lý tế bào. Trong các tế bào nấm men đang hoạt động mạnh, nhân có kích thước khá lớn. Cũng như các sinh vật khác, nhân tế bào nấm men có cấu tạo bởi protein, AND, ARN và nhiều enzym. Nhân quyết định tính di truyền và tham gia điều khiển mọi hoạt động sống của tế bào. Trong nhân có chứa nhiễm sắc thể, có quá trình giảm phân khi sinh sản và đôi khi cũng có thể phân cắt theo kiểu trực phân. Không bào: Không bào có tính thẩm thấu cao, là nơi tích luỹ các sản phẩm trao đổi chất. Glycogen có thể chiếm tới 12 % chất khô của tế bào. Trehaloza là một hydratcacbon dự trữ, có thể chiếm tới 16 % lượng chất khô trong tế bào. Chính không bào là nơi chứa axit amin tự do. Ngoài ra không bào còn chứa purin, ortophotphat polyme hoá và các enzym thuỷ phân. Ty thể: Ty thể nấm men chứa AND, ARN, ARN polymeraza, các enzym hô hấp, chúng suy biến thành các tiền ty thể (promitochondries) trong quá trình lên men khi môi trường chứa hơn 5 % glucoza. Màng ty thể có chứa lipid, photpholipid, ergosterol. 5 1.1.1.3. Thành phần hoá học của tế bào nấm men Thành phần hoá học của tế bào nấm men tuỳ thuộc điều kiện môi trường nuôi, thành phần chất dinh dưỡng, tình trạng sinh lý của tế bào. Trong tế bào có chứa hầu hết các chất cần thiết như protein, glucid, lipid, các enzym, các axit nucleic, chất khoáng [26]. Cũng như các cơ thể sống khác, thành phần cơ bản và chủ yếu của tế bào nấm men là nước (khoảng 70-75 % khối lượng chung). Thành phần sinh khối khô của nấm men như sau (%): Chất vô cơ 5-10 Cacbon 25 – 50 Nitơ 4.8 – 12 Protein (N × 6.25) 30 -75 Lipid 2–5 Thành phần hoá học của tế bào nấm men nếu tính theo các nguyên tố cấu thành sẽ là (% theo trị số trung bình): C – 47, H – 65, O – 31, N – 5 ÷ 10, P – 1.6 ÷ 3.5. Hàm lượng các nguyên tố không phải đa lượng: Ca – 0.3 ÷ 0.8, K – 9.5 ÷ 2.5, Mg - 0.1 ÷ 0.4, Na - 0.06 ÷ 0.2, S – 0.2. Các nguyên tố vi lượng (mg/kg): Fe 90 ÷ 350, Cu – 20 ÷ 135, Zn – 100 ÷ 160, Mo – 15 ÷ 65 [26]. a. Nước trong tế bào nấm men Nấm men ép có chứa 70 – 75 % là nước, và 25 – 30 % còn lại là chất khô. Nước bao gồm phần nước ngoài tế bào (ngoại bào) là phần nước nằm trong khoảng trống giữa tế bào, và nước trong tế bào (nội bào) là phần nước nằm trong tế bào chất của tế bào. Lượng nước khác nhau còn tuỳ chủng nấm men, kỹ thuật nuôi và phương pháp thu tế bào. Ví dụ: khi nuôi trong môi trường có NaCl, lượng nước trong tế bào giảm, điều này thể hiện ở bảng 1.1 Bảng 1.1. Ảnh hưởng của NaCl đến sự phân bố độ ẩm của nấm men Phương pháp nuôi Phân bố trong nấm men, % 6 Phân bố độ ẩm trong men ép lượng chất khô độ ẩm ngoại bào nội bào Không thêm NaCl 27 73 22 51 Thêm NaCl vào môi trường nuôi 31 69 22 47 Thay đổi độ ẩm của nấm men sẽ kéo theo thay đổi tỉ lệ nước nội bào và nước ngoại bào. Khi loại bỏ 85 % lượng nước từ nấm men ở nhiệt độ dưới 500C hầu như không ảnh hưởng đến hoạt động của chúng [25]. b. Chất khô trong tế bào nấm men Chất khô của tế bào nấm men gồm có (tính theo % khối lượng nấm men ép): 23 – 28 là chất hữu cơ và 5 – 7 là tro. Chất hữu cơ ở đây gồm có: Protein 13-14%, glycogen 6 – 8 %, xenluloza 1.8 – 2 %, Chất béo 0.5 – 2 %. Protein Trong các chất hữu cơ của tế bào nấm men thì protein là thành phần có giá trị nhất. Thành phần protein nấm men phụ thuộc vào loài giống, thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy [26], [38]. Nấm men có hàm lượng protein nguyên liệu trung bình khoảng 50 % (tính theo chất khô), trong đó có khoảng 45 % protein hoàn chỉnh. Các dẫn xuất của axit nucleic như bazơ purin và pyrimidin, các axit amin tự do đều được coi là protein nguyên liệu. Trong thành phần protein có đầy đủ các axit amin và đặc biệt là axit amin không thay thế. Hàm lượng các axit amin trong tế bào nấm men ở giai đoạn cuối lên men như sau (mg/g men khô): Lizin – 7.5; arginin – 1.3; histidin – 11.0; axit asparaginic – 2.9; serin – 2.7; glyxin – 1.5; axit glutamic – 3.9; alanin – 8.7; prolin – 2.0; tirozin – 2.8; metionin – 2.9; lơxin – 5.4; sistein - vết,… [26]. Vitamin Nấm men có thể tổng hợp được tất cả các vitamin trong chừng mực nào đó (nhiều hoặc ít), ngoại trừ biotin (vitamin H). Thực tế cho thấy, tế bào nấm men rất giàu vitamin, nhất là vitamin nhóm B và tiền vitamin D2 là ergosterol. Hàm lượng vitamin trong tế bào nấm men như sau (μg/g chất khô): Inozit 6000 – 15000; biotin (vitamin H) 0.6 ÷ 0.7; riboflavin (vitamin B2) 7 30 ÷ 60; axit pantotenic (vitamin B3) 2.0 ÷ 19.0; thiamin (vitamin B1) 24 ÷ 50; pyridoxine (vitamin B6) 14 ÷ 39; nicotinamit (vitamin B5) 370 ÷ 750. Chất béo: Chất béo trong tế bào nấm men có các axit oleic, linoelic, palmitic. Trong chất béo có tới 30 – 40 % phosphatit. Tro: Trong tro nấm men thấy có các oxyt sau đây (%): P2O5 25 ÷ 60; CaO – 1 ÷ 8; MgO – 4 ÷ 6; Na2O – 0.5 ÷ 2; SO3 - 0.5 ÷ 6; SiO2 – 1 ÷ 2; Fe2O3 – 0.05 ÷ 0.7. Các nguyên tố vi lượng: Chúng tham gia vào thành phần của nhiều enzym, vitamin và nhiều hợp chất khác nữa trong quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm của tế bào. Các nguyên tố vi lượng (mg/kg): Fe 90 ÷ 350, Cu – 20 ÷ 135, Zn – 100 ÷ 160, Mo – 15 ÷ 65. Glycogen: Là những chất dự trữ nguồn cacbon (hydratcacbon của nấm men). Khi trong môi trường thiếu nguồn cacbon dinh dưỡng, glycogen sẽ được huy động tham gia vào quá trình tiêu hoá của nấm men và giải phóng ra nước, khí cacbonic. Trehaloza: Hợp chất thường kết hợp với hàng loạt hạt glycogen làm nguồn dự trữ cacbon rất cơ động. Ở cùng một giá trị pH, hàm lượng Trehaloza tăng thì nitơ giảm. Như vậy, protein là thành phần chủ yếu trong chất khô tế bào nấm men. Nếu ta tận dụng thuỷ phân nguồn thứ phẩm này thải ra từ các nhà máy bia sẽ thu được dịch thuỷ phân protein nấm men có giá trị dinh dưỡng rất cao, với các thành phần axit amin không thay thế như lizin, metionin,…bổ sung vào thực phẩm thiếu hụt các axit amin này (như các protein có nguồn gốc thực vật,…) và tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị khác. 1.1.2. Các ứng dụng của nấm men trong ngành công nghiệp thực phẩm 1.1.2.1. Ứng dụng trong sản xuất các đồ uống lên men Lên men là một trong những kỹ thuật lâu đời nhất trong chế biến thực phẩm và mang tầm quan trọng kinh tế to lớn. Các sản phẩm lên men phổ biến là rượu, bia, nước giải khát,…Các sản phẩm này ngày càng nhiều và dường như chưa bao giờ đáp ứng đủ nhu cầu của con người. Nấm men đóng vai trò là tác nhân lên men, nó hấp thụ các hydratcacbon thấp phân tử và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường vào tế bào, rồi thực hiện quá trình trao đổi chất trong điều kiện kỵ khí qua một chuỗi các biến 8 đổi phức tạp tạo thành sản phẩm mà chủ yếu là rượu etylic, CO2 và một số sản phẩm phụ khác. Nấm men thường được sử dụng trong quá trình lên men rượu là Saccharomyces. 1.1.2.2. Ứng dụng để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men Men được hoà với nước theo tỉ lệ thích hợp, có thể bổ sung enzym thuỷ phân hoặc không, giữ ở 50 – 550C, đây là nhiệt độ thích hợp cho enzym protease có sẵn trong tế bào nấm men và enzym protease bổ sung vào hoạt động thuỷ phân protein thành các đạm thấp phân tử, đồng thời giải phóng ra nhiều thành phần có giá trị khác. Dịch thuỷ phân chứa rất nhiều axit amin đặc biệt là các axit amin không thay thế, peptid, vitamin nhóm B, các hydratcacbon,… bảng 1.2. Thành phần của nấm men trích ly sản xuất bằng phương pháp thuỷ phân [27] Các axit amin (% so với khối lượng ban đầu) Các vitamin (mg/kg, ppm) Alanin 3.4 Isoleucin 2.0 prolin 1.9 Arginin 2.1 Leucin 2.9 Serin 1.6 Thiamin 2030 Lizin 3.2 Treonin 1.9 Riboflavin 5070 Asparagin 3.8 Cistin 0.3 Methionin 0.5 Tirozin 0.8 Piridoxin 2535 Glycin 1.6 Ornithin 0.3 Histidin 0.9 Niacinamd 600 1.6 Axit butyric 0.1 Axit pantotenic 200 Axit glutamic 7.2 Phenylalanin Nhiều thực phẩm có nguồn gốc thực vật chứa hàm lượng protein cao nhưng lại không thể dùng làm nguồn protein thức ăn cho con người và gia súc do thiếu một số axit amin không thay thế. Ví dụ: protein lúa mì nghèo lizin, protein lúa nước nghèo lizin và threonin, protein ngô nghèo lizin và tryptophan, protein đậu nghèo metionin. Do đó, trên toàn thế giới việc thiếu hụt các axit amin không thay thế như: lizin, threonin và metionin,… còn 9 trầm trọng hơn là đói protein nói chung. Vì vậy, việc tận dụng nguồn protein nấm men để tạo ra dịch thuỷ phân có giá trị dinh dưỡng và giá trị sinh học cao mà lại an toàn cho người và gia súc là rất cần thiết. 1.1.2.3. Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm bánh mì Sinh khối nấm men làm nở bột mì là sinh khối men Saccharomyces cerevisiae còn sống, còn hoạt tính lên men rượu, khi trộn với bột mì sẽ lên men rượu, giải phóng ra CO2 làm phồng gluten (protein trong bột mì), bột nhào nở làm cho bánh mì xốp. 1.1.2.4. Thu nhận enzym Thu nhận enzym superoxit dismutaza: Sử dụng công nghệ nghiền tế bào Saccharomyces cerevisiae kết hợp với xử lý kiềm [6]. Thu nhận chế phẩm invertase: Tự phân nấm men bia ở 50 0C, pH 5.5, thời gian 50 giờ. Khi đó hoạt tính invertase thu được là 120.9 U/g chất khô nấm men [23]. 1.1.2.5. Thu nhận protein Protein nấm men có ưu điểm là nguồn protein sạch, chứa đầy đủ các axit amin không thay thế, giá thành rẻ, hàm lượng cholesterol thấp [28] …Từ việc thu hồi nấm men dư thừa tại các nhà máy bia, sử dụng công nghệ enzym và công nghệ chế biến tiên tiến, đã sản xuất bột nấm men giàu protein 46.27 %- 56.67 %, có đầy đủ các axit amin thay thế và không thay thế với tỷ lệ lớn, các vitamin và các nguyên tố vi lượng như Mg, Ca, Fe, Na,…có khả năng thay thế nguồn protein động vật. Được sử dụng làm bột dinh dưỡng trẻ em, phối trộn với bột canh tạo ra 1 loại bột nêm có độ ngọt đạm cho gia vị. 1.1.2.6. Sử dụng sinh khối nấm men làm thức ăn chăn nuôi Trong hoàn cảnh nhiều nước trên thế giới (chủ yếu ở châu Phi và châu Á) còn bị đói protein trầm trọng, các nước châu Âu hằng năm vẫn phải nhập đậu tương cho chăn nuôi, thì protein vi sinh vật là một nguồn hấp dẫn. Sinh khối nấm men làm nguồn protein – vitamin bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, đây là các tế bào của các giống Saccharomyces, Candida,… đã sấy khô, đã chết, không còn hoạt tính lên men rượu. Protein vi sinh vật đặc biệt giàu lizin, đây là một lợi thế khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Men 10 bia khô có thành phần protein 44.5 %, chất béo 1.2 %, xơ 1.3 %, nước 10.9 %. Cho thức ăn tinh ngô, cám, khoai vào thùng, chum, pha nước vừa đủ sền sệt. Trộn 2 – 4 % bánh men đã bóp vụn, bổ sung thêm ure 200 g và lân 150g/100kg bột, khuấy đều, đậy lại, ủ ấm và cứ 6-8 giờ đảo 1 lần. Sau vài ngày, men sẽ mọc trắng, có mùi thơm. Thức ăn được ủ men bia làm tăng protein lên 9-14 %. Thức ăn ủ men trộn vào khẩu phần của lợn con 40 %, lợn choai 50-60 %, lợn nái chửa hai tháng cuối và lợn nái mới đẻ không trộn thức ăn ủ men này vì có thể thiếu khoáng, nhất là canxi cho cấu tạo phát triển xương của thai và lợn con. [18] 1.1.2.7. Ứng dụng nấm men tạo các sản phẩm chữa bệnh Men bia sống thường được sử dụng làm thuốc trong các trường hợp cơ thể mệt mỏi, kiệt sức, thiếu máu, kém ăn, chậm tăng trưởng, stress, rối loạn thần kinh. Khi kết hợp với selen, nó tạo thành phân tử selen hữu cơ có tác dụng ra tăng hiệu năng chống các gốc tự do, làm chậm quá trình lão hoá và là yếu tố quan trọng trong nhóm các chất chống oxy hoá cần thiết cho sức khoẻ. Men bia sống có tác dụng chống nhiễm trùng bằng cách tăng cường hệ thống miễn dịch. Các loại thuốc uống chứa men bia thường kết hợp men bia 400 g với men bia selen – 75 mg, silice 25 mg, giúp tăng cường sức khoẻ, chống nhiễm trùng (trong các trường hợp bị cảm, ho, nóng sốt). Men bia còn được sử dụng làm thực phẩm bổ sung cho phụ nữ mang thai và cho con bú. Men bia sống dùng làm thuốc thường có 20 tỷ tế bào sống Saccharomyces cerevisiae/1g, chứa trong 2 viên nang với hàm lượng 16 axit amin, 17 vitamin, 14 muối khoáng. Nó được xem là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và là vectơ dẫn đường cho sự hấp thu các loại vitamin khác vào cơ thể [14]. Chế phẩm YeaSacc 1026 bao gồm các tế bào nấm men của dòng men Saccharomyces cerevisiae 1026, là một dạng men sống dùng để trộn vào thức ăn. Có tác dụng kích thích tăng trưởng và hoạt động của các loại vi khuẩn có lợi cho đường ruột [1]. 1.1.3. Ứng dụng của dịch thuỷ phân nấm men 1.1.3.1. Sử dụng làm chất điều vị 11 Sử dụng một lượng nhỏ dịch thuỷ phân nấm men vào một số thực phẩm như súp, nước xốt, trứng, snack, bánh quy,…sẽ góp phần tích cực vào việc tăng giá trị cảm quan và giá trị dinh dưỡng cho sản phẩm. Đây là kết quả của các axit amin và các peptide phân tử lượng thấp trong dịch thuỷ phân nấm men. 1.1.3.2. Sản xuất một số sản phẩm truyền thống Dịch thuỷ phân nấm men giàu axit amin đặc biệt là các axit amin không thay thế, vitamin nhóm B, khoáng,… được sử dụng để tạo rất nhiều sản phẩm thơm ngon, bổ dưỡng như vegemite, marmite, oxo, cenovis, recipe,… 1) MARMITE: Sản phẩm này có xuất xứ từ nước Anh, thành phần chính của Marmite là YE. Sản phẩm dính, có dạng sệt, màu nâu, vị mạnh, cực kỳ mặn, có vị thịt. Mùi vị của nó được so sánh với nước tương (xì dầu). Ngoài ra, marmite còn có một sản phẩm tương tự ở New Zealand, Úc. Marmite là món ăn truyền thống ở Anh, được ăn với bánh mỳ, bánh bích quy. Các nhà hàng Trung Quốc, Singapore sử dụng marmite trong các món xào thịt lợn để làm tăng vị ngọt cho thức ăn. Nó cũng được cho vào cháo yến để bổ sung hương thơm cho cháo. Hình 1.3. Sản phẩm Marmit Thông tin dinh dưỡng của Marmite loại 100g được sản xuất ở Anh: - Năng lượng: 219 kcal - Protein: 38.4 g - Cacbonhydrat: 19.2 g - Đường: 0.5 g 12 - Chất béo: 0.1 g - Natri: 4.3g - Thiamin: 5.8 mg - Riboflavin: 7 mg - Niacin: 160 mg - Axit folic: 2500µg - Vitamin B12: 15 μg 2) VEGEMITE: Là sản phẩm được làm từ YE, trông rất mịn, dính. Sử dụng để phết lên bánh sandwich, bánh mì nướng, bánh bích quy,…Sản phẩm có vị mặn, hơi đắng, có vị mạch nha, gần giống vị canh thang thịt bò. Vegemite được coi là món ăn truyền thống ở Úc, New Zealand. Vegemite rất giàu vitamin nhóm B. Hình 1.4. Sản phẩm Vegemite Thông tin dinh dưỡng của vegemite loại 5g: - Năng lượng 9.76 kcal - Protein: 1.3g - Cacbonhydrat tổng số 1g - Chất béo < 1g - Niacin: 2500 μg - Thiamine: 550 µg - Riboflavin: 430 μg - Folate: 100 μg - Natri: 169 mg Tuy nhiên, việc sử dụng đạm vi sinh cho con người bị hạn chế bởi hàm lượng axit nucleic của nó. Tổ chức WHO khuyến cáo mức độ tối đa của axit nucleic là 2 % trong thực phẩm. Trong khi đạm nấm men chứa khoảng 6-13 %. 1.1.3.3. Sử dụng làm môi trường vi sinh vật 13