Tài liệu Xây dựng hệ thống mã vạch dna (dna barcode) để nhận diện phân tử một số loài đăng lan (dendrobium spp.) khu vực tp. hồ chí minh báo cáo tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp cơ sở

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ XÂY DỰNG HỆ THỐNG MÃ VẠCH DNA (DNA BARCODE) ĐỂ NHẬN DIỆN PHÂN TỬ MỘT SỐ LOÀI ĐĂNG LAN (Dendrobium spp.) KHU VỰC TP. HỒ CHÍ MINH Mã số: CS.2015.19.38 Chủ nhiệm: ThS. Nguyễn Như Hoa ---Tp.HCM, 2017--- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ XÂY DỰNG HỆ THỐNG MÃ VẠCH DNA (DNA BARCODE) ĐỂ NHẬN DIỆN PHÂN TỬ MỘT SỐ LOÀI ĐĂNG LAN (Dendrobium spp.) KHU VỰC TP. HỒ CHÍ MINH Mã số: CS.2015.19.38 Cơ quan chủ trì Chủ trì đề tài Trưởng Khoa Sinh học TS. Phạm Văn Ngọt | ThS. Nguyễn Như Hoa Danh sách những người tham gia thực hiện đề tài và đơn vị phối hợp chính 1. Chủ nhiệm: ThS. Nguyễn Như Hoa, giảng viên Khoa Sinh học Trường ĐH. Sư phạm Tp.HCM. 2. Cơ quan chủ trì: Khoa Sinh học, Trường ĐH. Sư phạm Tp.HCM. 3. Đơn vị phối hợp chính:. Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM. MỤC LỤC Chương 1. TỔNG QUAN................................................................................................5 1.1. Giới thiệu về lan Dendrobium ..............................................................................5 1.1.1. Vị trí phân loại ...............................................................................................5 1.1.2. Sự phân bố .....................................................................................................5 1.1.3. Sự đa dạng và phong phú của lan Dendrobium.............................................6 1.1.4. Đặc điểm hình thái lan Dendrobium .............................................................9 1.2. Các loài Đăng lan trong nghiên cứu ...................................................................12 1.2.1. Hoàng phi hạc (Dendrobium signatum Rchb. f. 1884) ...............................12 1.2.2. Đại Ý Thảo (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) ..................................12 1.2.3. Hoàng thảo Thái Bình (Dendrobium pulchellum Roxb. ex Lindl.) ............12 1.2.4. Long tu (Dendrobium primulinum Lindl.) ..................................................13 1.2.5. Giả hạc xuân di linh tím (Dendrobium anosmum var alba) ........................13 1.2.6. Xương cá (Dendrobium aloifolium (Bl.) Rchb. f.) ......................................13 1.2.7. Thập nhất hoa (Dendrobium aduncum Wall. Ex Lindl.).............................13 1.2.8. Kim điệp vàng (Dendrobium capillipes Rchb.f.) ........................................14 1.2.9. Hoàng thảo Ngọc Thạch (Dendrobium crystallinum Rchb. f.) ...................14 1.2.10. Hoàng thảo vôi (Dendrobium cretaceum Lindl.(D. polyanthum Lindl.)) .14 1.3. Mã vạch DNA và ứng dụng trong nhận diện loài ..............................................14 1.3.1. Các gen được sử dụng để xây dựng mã vạch DNA ....................................15 1.3.2. Các công trình xây dựng mã vạch DNA cho họ Lan ..................................19 Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................................................24 2.1. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................24 2.2. Phương pháp .......................................................................................................24 2.2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu lan................................................24 2.2.2. Phương pháp giải phẫu hình thái .................................................................25 2.2.3. Tách chiết DNA tổng số ..............................................................................28 2.2.4. Kỹ thuật PCR ...............................................................................................28 2.2.5. Phương pháp điện di trên gel agarose .........................................................29 2.2.6. Giải trình tự PCR .........................................................................................30 2.2.7. Hiệu chỉnh trình tự.......................................................................................30 2.2.8. Xây dựng cây phát sinh chủng loài .............................................................33 i Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................................................................35 3.1. Kết quả thu mẫu..................................................................................................35 3.2. Kết quả giải phẫu và mô tả hình thái ..................................................................35 3.3. Kết quả tách chiết DNA tổng số .........................................................................40 3.4. Kết quả xác định nhiệt độ bắt cặp mồi đặc hiệu của phản ứng PCR..................41 3.5. Khuếch đại vùng matK, ITS bằng kỹ thuật PCR ...............................................43 3.6. Kết quả và hiệu chỉnh trình tự trên phần mềm FinchTV và SeaView ...............45 3.7. Kết quả so sánh trình tự của mẫu với cơ sở dữ liệu Genbank nhằm kiểm tra độ tin cậy của trình tự .....................................................................................................47 3.8. Xây dựng cây phát sinh chủng loài đối với trình tự matK và ITS .....................51 ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ bp Base pair CBOL Consortium for the Barcode of Life CO1 Cytochrome c oxidase 1 cpDNA Chloroplast DNA DNA Deoxyribonucleic acid ITS Internal transcribed spacer kb Kilo-base pair matK Maturase K PCR Polymerase Chain Reaction rbcL Ribulose - 1,5 – Biphosphate Carboxylase L rDNA Ribosomal DNA RNA Ribonucleic acid rpoB RNA polymerase - β rRNA Ribosomal RNA OD Optical density BLAST Basic Local Alignment Search Tool CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Tm Melting Temperature UV Ultraviolet C. Cymbidium D. Dendrobium Tp. HCM Thành phố Hồ Chí Minh NCBI National Center for Biotechnology Information iii DANH MỤC HÌNH ẢNH và BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Ký hiệu, tên loài và tên khoa học của 10 loài Dendrobium trong nghiên cứu .......................................................................................................................................24 Bảng 2.2. Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng khuếch đại trình tự mục tiêu và kích thước trình tự được khuếch đại .....................................................................................29 Bảng 3.1. Kết quả ghi nhận đặc điểm hình thái của 10 loài Dendrobium nghiên cứu .35 Bảng 3.2. Kết quả định lượng DNA tổng số của các mẫu Dendrobium trong nghiên cứu bằng Nano Drop .....................................................................................................40 Bảng 3.3. Nhiệt độ bắt cặp của mồi và kích thước trình tự khuếch đại của các cặp mồi nghiên cứu .....................................................................................................................41 Bảng 3.4. Tóm tắt kết quả giải trình tự vùng matK (390F- 1326R) và ITS (1F – 4R) sau hiệu chỉnh của các mẫu Dendrobium trong nghiên cứu ...............................................45 Bảng 3.5. Kết quả BLAST trình tự vùng matK của 27/30 mẫu Dendrobium trong nghiên cứu với cơ sở dữ liệu Genbank ..........................................................................47 Bảng 3.6. Kết quả BLAST trình tự vùng ITS của 27/30 mẫu Dendrobium trong nghiên cứu với cơ sở dữ liệu Genbank ......................................................................................49 Hình 1.1. Hình minh họa các dạng chính của Dendrobium ............................................7 Hình 1.2. Các nhóm Dendrobium....................................................................................8 Hình 1.3. Đặc điểm rễ, thân, giả hành, lá, hoa, quả và hạt ở chi lan Dendrobium........11 Hình 1.4. Cấu trúc vùng ITS của Dendrobium..............................................................19 Hình 2.1. Hình minh họa quá trình hiệu chỉnh trình tự giải bằng mồi xuôi trên SeaView .........................................................................................................................31 Hình 2.2. Hình minh họa quá trình hiệu chỉnh trình tự giải bằng mồi ngược trên SeaView .........................................................................................................................31 Hình 2.3. Hình minh họa quá trình thống nhất 2 trình tự trên SeaView .......................32 Hình 2.4. Giao diện trang chủ NCBI .............................................................................32 Hình 2.5. Giao diện BLAST .........................................................................................33 Hình 2.6. Hình minh họa kết quả BLAST .....................................................................33 Hình 2.7. Giao diện phần mềm MEGA6.06 ..................................................................34 Hình 3.1. Hình chụp 10 loài Dendrobium trong nghiên cứu ........................................39 Hình 3.2. Kết quả điện di DNA tổng số của 10 mẫu Dendrobium ...............................41 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại vùng matK của mẫu 2TT ở các ngưỡng nhiệt độ từ 49oC tới 58oC...............................................................................................42 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại vùng ITS của mẫu 2TT ở các ngưỡng nhiệt độ từ 49oC tới 58oC...............................................................................................42 iv Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng matK của 30 mẫu lan Dendrobium ...44 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng ITS của 30 mẫu lan Dendrobium .....44 Hình 3.7. Vùng chọn lựa để phân tích cây phát sinh chủng loài của bộ dữ liệu gồm 27 trình tự nghiên cứu đối với vùng matK của Dendrobium .............................................51 Hình 3.8. Mô hình cây phát sinh loài vùng matK của nhóm Dendrobium nghiên cứu 52 Hình 3.9. Vùng chọn lựa để phân tích cây phát sinh chủng loài của bộ dữ liệu gồm 27 trình tự nghiên cứu đối với vùng ITS của Dendrobium ................................................52 Hình 3.10. Mô hình cây phát sinh loài vùng ITS của nhóm Dendrobium nghiên cứu .53 Hình 3.11. Mô hình cây phát sinh loài từ trình tự vùng matK và ITS của nhóm Dendrobium nghiên cứu ................................................................................................54 v TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BẰNG TIẾNG VIỆT Tên đề tài: Xây dựng hệ thống mã vạch DNA (DNA barcode) để nhận diện phân tử một số loài Đăng lan (Dendrobium spp.) khu vực Tp. Hồ Chí Minh Mã số: CS.2015.19.38 Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Như Hoa Tel: 0902 683 249 E-mail: [email protected] Cơ quan chủ trì đề tài: Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện : Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM. Thời gian thực hiện: 11/2015 – 11/2016 1. Mục tiêu: Hệ thống hóa các loài lan nhằm mục đích bảo tồn và để làm nguyên liệu ban đầu cho các nghiên cứu về sau. Xác định trình tự DNA của các marker để tạo nên hệ thống mã vạch DNA giúp nhận diện phân tử các mẫu lan ở bộ phận bất kỳ và giai đoạn phát triển bất kỳ mà không cần có hoa. 2. Nội dung chính: - Thu thập, hệ thống 10 loài Đăng lan khu vực tp. HCM. - Tách DNA tổng số cho 30 mẫu Đăng lan khu vực tp. HCM. - Khuếch đại vùng marker mục tiêu bằng phản ứng PCR. - Giải và hiệu chỉnh trình tự 2 chiều cho mỗi marker. - Phân tích, xây dựng mã vạch DNA cho từng loài. 3. Kết quả chính đạt được: - Hệ thống mã vạch DNA cho các loài lan đã thu thập dựa trên trình tự DNA của 2 marker. - Các bài báo cáo tại hội nghị và đăng kỉ yếu: + Nguyễn Như Hoa, Trần Hoàng Dũng, Dương Hoa Xô, Huỳnh Hữu Đức (2016), Phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loài của một số giống lan Dendrobium dựa trên trình tự vùng ITS, Hội nghị CNSH toàn quốc khu vực phía Nam – lần thứ IV – năm 2016. SUMMARY Project Title: Construction DNA barcode to identify molecular some Dendrobium species (Dendrobium spp.) in Ho Chi Minh city. Code number: CS.2015.19.38 Coordinator: MS. Nguyễn Như Hoa Implementing Institution: Department of Biology, HCM City University of Pedagogy Cooperating Institution(s): Biotechnology Center HCM City Duration: from September -2015 to September -2016 1. Objectives: - Some orchids codified to preserve and provide materials for future research. -Two markers sequenced to create barcode system helps identify molecular DNA samples spread in any department and any stage of development without flowers. 2. Main contents: - Systems 10 Dendrobium species in HCM city. - Separation DNA total for 30 Dendrobium samples in HCM city. - Amplifying the target marker by PCR. - Sequencing and correction sequence for each marker. - Analysis and construction of DNA barcodes for each species. 3. Results obtained: - DNA barcode system for the orchids were collected based on the DNA sequence of the 2 markers. - Publish academic reports using data collected from the research: + Nguyen Nhu Hoa, Tran Hoang Dung, Duong Hoa Xo, Huynh Huu Đuc (2016), Analysis phylogenetic relationship of Dendrobium based ITS region, The 4th national conference on biotechnology of Sothern Vietnam 2016 “Application of biotechnology”. MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Lan Việt Nam với các loài có hoa đẹp, hương thơm quý phái là đối tượng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Hằng năm, Việt Nam thường xuyên phát hiện các loài mới bổ sung vào danh sách các loài lan phân bố ở Việt Nam. Lan Việt Nam là một họ phong phú và đặc sắc của hệ thực vật ở nước ta, có giá trị tài nguyên về nhiều mặt đối với nền kinh tế, đời sống con người. Nhiều loài lan rừng Việt Nam, đặc biệt là các loài thuộc chi Dendrobium cho hoa đẹp, kết hợp nhiều màu sắc phong phú, hài hòa; hoa có hương thơm, lâu tàn, nở kéo dài từ 1 – 2 tháng. Tình trạng thu hái, buôn bán lan rừng trái phép phổ biến như hiện nay có thể dẫn đến nguy cơ làm mất nguồn gen lan rừng. Bên cạnh đó, việc du nhập và lai tạo ngày càng nhiều giống lan mới cũng làm rất nhiều giống dần dần bị lãng quên. Từ thực tế đó, rất nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành nhằm bảo tồn đa dạng các loài lan, trong đó có lan Dendrobium. Cho đến nay, việc nghiên cứu về lan chủ yếu về hệ thống phân loại, nuôi cấy mô một số loài. Việc nghiên cứu, sưu tập, lai tạo các giống lan đã được thực hiện khá nhiều ở các trường, viện nghiên cứu, các nghệ nhân... Tuy nhiên, quá trình nhận diện các giống lan vẫn dựa trên hình thái bên ngoài, đặc biệt là phải có hoa và quá trình lai tạo vẫn mang tính ngẫu nhiên không dựa trên nền tảng di truyền. Do vậy, rất cần một hệ thống nhận diện nhanh và chính xác các mẫu lan thu thập. Trong các công cụ sinh học phân tử, mã vạch DNA (DNA barcode) được biết là công cụ hữu hiệu nhất hiện nay giúp định danh mẫu vật và phân tích tiến hóa sinh học của loài vật đó trong tự nhiên, giúp các nhà chọn giống và di truyền học cập nhật nhanh chóng các thông tin như tên, thuộc tính sinh học… nhằm đánh giá mối quan hệ giữa các loài, đồng thời bảo tồn nguồn gen; từ đó có thể quản lý và khai thác tốt hơn nguồn gen mình đang có. [16,18,19] Hơn nữa, việc sử dụng trình tự mã vạch DNA để xây dựng cây phát sinh chủng loài sẽ giúp chỉ ra mối quan hệ di truyền giữa các loài thu thập được. Từ đó chỉ ra các loài có quan hệ xa, quan hệ gần trong cùng chi cùng loài. Cây phát sinh chủng loài sẽ là cơ sở khoa học quan trọng để xây dựng các tổ hợp lai giữa các mẫu lan (lai cùng chi, giữa 1 hai chi, giữa bốn chi). Các tổ hợp lai sẽ giúp cho công tác lai tạo các loài lan rút ngắn thời gian, công sức nhưng vẫn cho ra các dòng con lai đạt giá trị khoa học và kinh tế phục vụ nhu cầu nội địa và xuất khẩu, đây là một nhiệm vụ có tầm chiến lược lâu dài. Hiện nay, những nghiên cứu trong việc xây dựng mã vạch DNA nói chung và cụ thể với đối tượng phong lan bằng cách sử dụng các mồi đặc hiệu ở Việt Nam mới có một số nhóm nghiên cứu bắt đầu thực hiện. Có rất nhiều marker tham gia trong phân tích phân loại như: ITS, rbcL, atpβ, ndhF, intron trnL và matK, …trải rộng từ bộ cho đến mức dưới loài. Mỗi đoạn mã vạch DNA có những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau. Ví dụ, các đoạn DNA như: 18S, 16S, 5,6S có khả năng phân biệt sinh vật ở mức họ và chi; các đoạn DNA, như: 26S, rbcL, ndnF, atpβ có khả năng phân biệt ở mức chi và loài; các đoạn DNA, như: ITS, matK, cytb, 5S spacer có khả năng phân biệt ở mức loài và dưới loài (subspecies, variety, strain). Tuy nhiên, các nhà khoa học cũng đã khuyến cáo, chưa có đoạn DNA nào được sử dụng làm mã vạch chung cho tất cả các loài sinh vật. Vì vậy, việc lựa chọn những đoạn DNA (gen) đặc trưng để làm mã vạch và việc phối hợp giữa các đoạn mã vạch DNA là rất cần thiết và đem lại hiệu quả cao. [36, 27, 30] Trên đối tượng lan Dendrobium, cho đến thời điểm hiện tại, những nghiên cứu trong việc xây dựng mã vạch DNA cho bằng cách sử dụng mồi đặc hiệu vẫn chưa hoàn chỉnh. Để góp phần vào việc định hướng cho công tác thu thập, bảo tồn, khai thác và sử dụng nguồn gen Dendrobium một cách có hiệu quả, chúng tôi đề xuất “Xây dựng hệ thống mã vạch DNA (DNA barcode) để nhận diện phân tử một số loài Đăng lan (Dendrobium spp.) ở khu vực Tp Hồ Chí Minh”. 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Hệ thống hóa các loài lan nhằm mục đích bảo tồn và để làm nguyên liệu ban đầu cho các nghiên cứu về sau. Xác định trình tự DNA của các marker để tạo nên hệ thống mã vạch DNA giúp nhận diện phân tử các mẫu lan ở bộ phận bất kỳ và giai đoạn phát triển bất kỳ mà không cần có hoa. 3. CÁCH TIẾP CẬN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, PHẠM VI NGHIÊN CỨU, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1 Cách tiếp cận 2 - Tổng hợp các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước, chú trọng đến nguồn tài liệu ở những quốc gia có nền khoa học kỹ thuật và đã có những thành tựu quan trọng trong lĩnh vực bảo tồn nguồn gen để phân tích trên cơ sở lý luận thực tiễn nhằm định hướng nhanh nhất cho các phương pháp và nội dung nghiên cứu trong đề tài. Điều tra, đánh giá một số đặc điểm hình thái lan Dendrobium khu vực tp. HCM; từ đó, xây dựng báo cáo mô tả một số đặc điểm hình thái của lan Dendrobium khu vực tp. HCM. Kế thừa các kết quả nghiên cứu về lan Dendrobium ở Việt Nam hoặc một số tài liệu, bài viết có tính tham khảo, chuyên khảo. Lan Dendrobium thu thập được định danh phân tử bằng cách xây dựng hệ thống DNA barcode. Hệ thống này sẽ giúp các nhà khoa học, nghệ nhân địa phương dễ dàng tiến hành xác định nguồn gốc loài và bảo vệ các loài đang có nguy cơ tuyệt chủng. 3.2 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp thu mẫu – Giải phẫu hoa. - Phương pháp tách DNA tổng số, khuếch đại các marker bằng kỹ thuật PCR. - Phương pháp hiệu chỉnh trình tự 3.3 Phạm vi nghiên cứu - 30 mẫu lan Dendrobium (10 loài) thu thập tại tp. HCM. Mỗi mẫu sẽ được giải trình tự 2 marker là ITS và matK để xây dựng DNA barcode. 3.4 Nội dung nghiên cứu - Thu thập, hệ thống các mẫu Đăng lan khu vực tp. HCM. - Xây dựng hệ thống mã vạch DNA cho mẫu vật nghiên cứu. + Tách DNA tổng số cho 30 mẫu Đăng lan khu vực tp. HCM. + Khuếch đại vùng marker mục tiêu bằng phản ứng PCR. + Giải trình tự 2 chiều cho mỗi marker. + Hiệu chỉnh trình tự đã giải bằng phần mềm FinchTV, Seaview. + Kiểm tra tương đồng trên ngân hàng gen GenBank. 3 + Phân tích, xây dựng mã vạch DNA cho từng loài. 4 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về lan Dendrobium 1.1.1. Vị trí phân loại Họ Phong lan (Orchidaceae) có 750 chi và hơn 25.000 loài (Takhtajan, 1987). Orchidaceae là họ lớn thứ hai sau họ Cúc (Asteraceae), thuộc ngành Thực vật hạt kín (Angiospermae) và cũng là họ lớn nhất trong lớp Một lá mầm. Dendrobium với số lượng loài lớn, đa dạng về hình dáng, màu sắc, kích thước, là chi lớn thứ hai trong họ Phong lan, chỉ sau chi lan Lọng (Bulbophyllum).[11] Giới Plantae Ngành Angiospermae (Magnoliophyta) Lớp Monocotylendones (Liliopsida) Bộ Asparagales Họ Orchidaceae Họ phụ Epidendroideae Tông Epidendreae Chi Dendrobium Theo Dương Đức Huyến, 1992, Dendrobium có những đặc điểm khác biệt với những chi lân cận như luôn mọc cụm và có phân đốt, số lượng khối phấn luôn là 4, không có lông mềm trên lá hay các bộ phận của hoa. Nhóm tác giả này đã dựa trên hệ thống của Seidenfeden (1985) và Holttum (1964) để sắp xếp 97 loài Dendrobium ở Việt Nam thành 15 nhóm (section). [3] Theo Phong lan Việt Nam của Trần Hợp (1998), ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông, được phân biệt bằng thân (giả hành), lá và hoa [11]. 1.1.2. Sự phân bố Chi Dendrobium có khoảng 1.600 loài và hiện đã được lai tạo thêm nhiều loại mới. Tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp, trong đó “Dendro”- có nghĩa là gỗ, “bio”- có nghĩa là sống. Dendrobium hầu hết là thực vật biểu sinh, sống bám trên vỏ cây. Ở Việt Nam, người ta còn gọi là Hoàng lan hay Đăng lan. Dendrobium chỉ được tìm thấy ở Đông bán cầu, trải dài từ Australia, xuyên suốt 5 Nam Thái Bình Dương, Philippine, Ấn Độ, một số xuất hiện ở Nhật Bản và xuất hiện nhiều nhất ở Đông Nam Á. Trong khi các nước Nam Mỹ tự hào về các loài thuộc chi Cattleya tuyệt đẹp, các nước Đông Nam Á cũng hãnh diện vì có chi Dendrobium vô cùng phong phú. Theo nghiên cứu của Dressler (1981), châu Á có khoảng 1.400 loài thuộc chi Dendrobium. [11] Điều kiện sinh thái của Dendrobium cũng rất đa dạng, có nhiều loài chỉ mọc và ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài trung gian, cũng có loài thích nghi với bất cứ điều kiện khí hậu nào. Ở Việt Nam, năm 1932, các nhà thực vật người Pháp (Gagnepsin và Guillaumin) đã công bố 53 loài Hoàng thảo ở Việt Nam, và sau đó đã công bố bổ sung thêm một số loài (1932 – 1964). 1992, Dương Đức Huyến và cộng sự cũng đã phân loại và định danh 97 loài Dendrobium ở Việt Nam, trong đó có 48 loài có giá trị làm cảnh và 21 loài đặc hữu của Việt Nam [3]. 1998, Trần Hợp mô tả 93 loài Dendrobium trong cuốn Phong lan Việt Nam [11]. Ở miền Nam Việt Nam, tác giả Phạm Hoàng Hộ cũng đã mô tả 56 loài Hoàng thảo trong Cây cỏ miền Nam Việt Nam 2. [7] Theo công bố “Trích yếu được cập nhật hóa về các loài lan ở Việt Nam, ở Việt Nam hiện đã biết được 897 loài lan thuộc 152 chi, chúng chiếm khoảng 75-80% trong tổng số 1.000 - 1.100 loài ước tính có ở đây. Trong đó, chi Dendrobium có số lượng loài cao nhất (107 loài), tiếp đến là Bulbophyllum, Eria, Liparis… Công bố này cung cấp các thông tin về tên khoa học, khu phân bố, cách sống, độ thường gặp của loài và tình trạng bị đe dọa tiêu diệt của từng loài.[1] 1.1.3. Sự đa dạng và phong phú của lan Dendrobium Dendrobium là chi lan (genus) đông đảo với hơn 1.000 loài (species) nguyên thủy được chia thành 40 nhóm (sections) thuộc dòng Dendrobiinae như Phalaenanthe, Eleutheroglossum, Callista, Ceratobium, Stachyobium… Do quá đa đạng nên Dendrobium tập trung thành hai dạng chính [5]: - Dạng đứng (Dendrobium loại phalaenopsis): thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm, có nhiều hoa. Thành phố Hồ Chí Minh trồng rất nhiều loại này như: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên, Sonia,…. - Dạng thòng (Dendrobium loại nobile): chịu khí hậu mát mẻ ở vùng đồi núi cao như Đà Lạt, Lâm Đồng, …; lá nhạt màu hơn so với dạng thân đứng, lá rụng khi thời 6 tiết lạnh. Có nhiều loài Dendrobium dạng thòng như Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng, … A B Hình 1.1. Hình minh họa các dạng chính của Dendrobium A. Dendrobium anosmum - Dạng thòng [38] B. Dendrobium cariniferum - Dạng đứng [37] Theo một cách phân loại khác, lan Dendrobium được chia ra thành 5 nhóm: - Nhóm thứ nhất có đặc điểm là lá xanh quanh năm và hoa thì thường mọc ở gần ngọn như Dendrobium antennatum, Dendrobium phalaenopsis… - Nhóm thứ hai, lá thường rụng vào mùa đông và hoa thường mọc ở gần đốt trên thân cây như Dendrobium anosmum, Dendrobium wardianum… - Nhóm thứ ba hay còn gọi là nhóm Callista, khi ra hoa thì hoa rủ xuống phía dưới như Dendrobium chrysotoxum, Dendrobium farmeri… - Nhóm thứ tư là nhóm Latoura với chùm hoa mọc thẳng đứng như Dendrobium atroviolaceum, Dendrobium spectabile… - Nhóm thứ năm là nhóm Formosae có đặc điểm là trên thân và lá cây có lông màu đen và hoa thường là màu trắng như Dendrobium draconis, Dendrobium formosum… 7 Nhóm 1 Nhóm 2 D. antennatum – D. phalaenopsis D. anosmum – D. wardianum Nhóm 3 Nhóm 4 D. chrysotoxum – D. farmeri D. atroviolaceum – D. spectabile Nhóm 5 D. draconis – D. formosum Hình 1.2. Các nhóm Dendrobium Phạm Hoàng Hộ (2003) phân loại giống lan Dendrobium gồm 13 nhóm: Bolbidium, Callista, Apoum, Strongyle, Gastridium, Conostalix, Rhopalanthe, Formosae, Pedilonum, Dendrobium, Breviflores, Dischophyllum, Stachyobium. 8 - Nhóm Callista gồm có: D. chrysotosum (Kim điệp), D. densiflorum Wall (Thủy Tiên), D. farmari Paxt (Thủy tiên trắng vàng), D. lindleyi Steudel (Vẩy rồng), D. thrysiflorum Reichb (Thủy tiên vàng)… - Nhóm Dendrobium gồm có: D. anosmum Lindl (Giả hạc), D. fimbriatum Hook.f. (Long nhãn), D. heterocarpumi Lindl (Nhất điểm hoàng), D. primulinum Lindl (Long tu), D. moschatum (Buch-Ham) (Thái bình) …[8] Chính vì sự đa dạng về chủng loại mà nhóm lan này có điều kiện sinh thái rất đa dạng, có loài hoa chỉ mọc ở vùng lạnh, có loài lại chỉ sống ở vùng có không khí nóng, cũng có loài chỉ chịu được nhiệt độ vừa phải, nhưng có một số loài lại rất dễ chịu là điều kiện khí hậu nào cũng sống được. Dendrobium có thể nhân nhanh giống bằng phương pháp chiết nhánh thông thường. Vì nó là loại lan đa thân với nhiều giả hành, các giả hành thường mang một thân với nhiều lá mọc xen kẽ, trên thân có rất nhiều mắt ngủ. Tại những mắt ngủ này sẽ đâm chồi và cho ra một cây con mới. Hoa của Dendrobium có thể mọc từ thân thành từng chùm hay chỉ mọc một hoa duy nhất. Có một số loài Dendrobium trước khi ra hoa sẽ rụng hết lá. Đặc biệt hơn các giống lan khác, các chồi hoa của lan Dendrobium không những mọc trên các giả hành mới, tại các giả hành cũ cũng có thể mọc hoa, vì thế một cây Dendrobium có thể cho ra nhiều cành hoa. Mặt khác, hoa Dendrobium thường rất lâu tàn, thường là từ 2 đến hơn 3 tháng, có loài hoa có thể nở suốt quanh năm như Dendrobium caesar Alba, Dendrobium caesar latin... Tuy nhiên, có loài cũng sớm nở tối tàn như Thạch hộc (Dendrobium crulllenatum). Dendrobium cũng là giống rất đa dạng về màu sắc và kiểu dáng. Chính vì thế, người Việt Nam dùng những hình tượng khác nhau để tượng trưng cho một số loài Dendrobium nào đó: một con chim bồ câu trắng (lan Bạch câu), một loài hạc lẻ loi (lan Giả hạc), hay một đàn bướm vàng bay trong gió (lan Kim điệp) …[11] 1.1.4. Đặc điểm hình thái lan Dendrobium Dendrobium không có một hình dạng chung nhất về hoa và dạng cây do số lượng quá lớn và phân bố rộng rãi. Các loài thuộc chi Dendrobium đều có bộ phận sinh dưỡng như rễ, thân, giả hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, quả. [5] 9 1.1.4.1. Rễ - Cây có hệ rễ khí sinh, rễ thuộc loại rễ bán gió. Nhóm này thường có rễ nhỏ nhưng rất nhiều rễ, chủ yếu bám vào giá thể, vào thân cây để hút chất dinh dưỡng. - Rễ có lớp hút ẩm dày bao quanh gồm những tế bào chết chứa đầy không khí nên rễ ánh lên màu xanh bạc. - Một số loài có thân lá kém phát triển, thậm chí tiêu giảm hoàn toàn, có hệ rễ chứa diệp lục tố giúp cây hấp thụ ánh sáng cần thiết cho sự ra hoa và quang hợp. [5] - Rễ lan Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát, cây sẽ chết. [2] 1.1.4.2. Thân - Dendrobium thuộc nhóm đa thân (nhóm hợp trục) có hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ. - Ở một số loài Dendrobium, lá chỉ có ở các mầm non, có giả hành là đoạn thân phình to giống như củ không có lá, là nơi dự trữ năng lượng. - Gỉả hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, dự trữ nước và chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới. Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao. Đa số củ giả hành có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp. [5] - Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ. [2] - Một số loài ở xứ lạnh, giả hành chỉ có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên không có màu xanh nhưng phía trên có mang lá. [2] 1.1.4.3. Lá - Dendrobium là cây tự dưỡng, nó phát triển đầy đủ hệ thống lá. - Lá mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân do lá có tận cùng là 1 cuống hay thuôn dài xuống thành bẹ ôm thân, hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng. [5] - Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại mọng nước nạc, dai có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây. Phiến lá 10