Tài liệu Xác định hàm lượng vitamin c trong nước cam ép và nước mrdink đóng hộp bằng phương pháp vôn ampe

Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 3 NỘI DUNG........................................................................................................ 5 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 5 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VITAMIN C .................................................................. 5 1.1.1. Công thức và nhận định ........................................................................... 5 1.1.2. Tính chất hóa học ..................................................................................... 6 1.1.3. Tính chất sinh hóa .................................................................................... 9 1.1.4. Các nguồn cung cấp Vit.C ..................................................................... 10 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN C ................................... 11 1.2.1. Phƣơng pháp hóa học ............................................................................. 11 1.2.2. Các phƣơng pháp phân tích công cụ ...................................................... 13 1.2.2.1. Các phƣơng pháp phân tích quang học ............................................... 13 1.2.2.2. Nhóm các phƣơng pháp phân tích điện hóa ........................................ 15 Chƣơng 2: THỰC NGHIỆM ........................................................................ 23 2.1. DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT .................................................................... 23 2.1.1. Dụng cụ .................................................................................................. 23 2.1.2. Thiết bị, máy móc .................................................................................. 23 2.1.3. Hóa chất.................................................................................................. 23 2.2. CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................................................ 24 2.2.1.Nghiên cứu cơ bản .................................................................................. 24 2.2.1.1. Khảo sát tính chất cực phổ của Vit.C trong một số nền ..................... 25 2.2.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của oxi hòa tan ................................................... 27 2.2.1.3. Khảo sát pH của nền axetat ................................................................. 27 2.2.1.4. Khảo sát nồng độ nền axetat ............................................................... 27 2.2.1.5. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính ................................................... 28 2.2.1.6. Khảo sát các chất ảnh hƣởng............................................................... 31 Nguyễn Thu Trang 1 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 2.2.1.7. Khảo sát độ bền của Vit.C theo thời gian ........................................... 32 2.2.2. Ứng dụng xác định Vit.C trong mẫu thực tế .......................................... 33 2.2.2.1. Xử lý mẫu ............................................................................................ 33 2.2.2.2. Phƣơng pháp xử lý kết quả ................................................................. 33 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 35 3.1. ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU XÁC ĐỊNH VIT.C BẰNG PHƢƠNG PHÁP CỰC PHỔ (VÔN-AMPE)................................................................................ 35 3.1.1. Chọn nền ................................................................................................ 35 3.1.2. Ảnh hƣởng của oxi hòa tan .................................................................... 37 3.1.3. pH của nền axetat ................................................................................... 38 3.1.4. Nồng độ dung dịch đệm axetat .............................................................. 41 3.1.5. Khoảng nồng độ tối ƣu ........................................................................... 42 3.1.5.1. Xây dựng đƣờng chuẩn ....................................................................... 42 3.1.5.2. Kiểm tra đƣờng chuẩn ......................................................................... 44 3.1.5.3. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp .................................................. 46 3.1.6. Khảo sát các chất ảnh hƣởng.................................................................. 46 3.1.6.1. Khảo sát ảnh hƣởng của các axit hữu cơ ............................................ 47 3.1.6.2. Khảo sát ảnh hƣởng của ion clorua ..................................................... 48 3.1.7. Độ bền của Vit.C trong các môi trƣờng khác nhau ............................... 50 3.2. XÁC ĐỊNH VIT.C TRONG MẪU THỰC TẾ ......................................... 53 3.2.1. Mẫu nƣớc trái cây tƣơi: Nƣớc cam ép ................................................... 53 3.2.2. Mẫu nƣớc đóng hộp: Nƣớc cam ép Mrdink .......................................... 54 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 60 Nguyễn Thu Trang 2 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 MỞ ĐẦU VitaminC (Vit.C) hay còn đƣợc gọi là axit L-ascobic là một trong những loại hợp chất phổ biến và có vai trò quan trọng đối với sự sống của con ngƣời. Vit.C đóng vai trò thiết yếu trong các quá trình sinh hóa xảy ra trong cơ thể ngƣời, nó tham gia vào quá trình trao đổi chất, điều tiết quá trình sinh tổng hợp hoormon, là chất đề kháng cho cơ thể sinh vật, chất chống lão hóa các tế bào... Nếu thiếu Vit.C có thể gây bệnh Scrobut, biểu hiện ban đầu: mệt mỏi, đau cơ, xƣơng khớp, chán ăn, da khô ráp, chảy máu chân răng, xuất huyết dƣới da, vết thƣơng chậm liền sẹo, thiếu máu… Nếu không điều trị kịp thời sẽ bị phù tiểu cầu, thần kinh bị kích thích, xuất huyết não và chết. Vit.C sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm với vai trò là chất chống oxi hóa. Nó giúp cho các sản phẩm giữ đƣợc sự tƣơi ngon trong quá trình bảo quản. Nhiều loại hàng hóa trên thị trƣờng nhƣ nƣớc giải khát, nƣớc ép trái cây đóng hộp, bột dinh dƣỡng trẻ em... chứa Vit.C nhằm duy trì chất lƣợng sản phẩm. Các loại hoa quả tƣơi nhƣ nƣớc Cam ép là nguồn cung cấp Vit.C tự nhiên, rất tốt cho sức khỏe con ngƣời. Ngoài ra Vit.C còn đƣợc tổng hợp theo con đƣờng nhân tạo nhƣ nƣớc uống đóng hộp. Hàm lƣợng Vit.C trong nƣớc Nguyễn Thu Trang 3 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 uống đóng hộp, đặc biệt là trong nƣớc cam ép Mrdink của công ty YNG SHIN Việt Nam là loại nƣớc uống đáp ứng nhu cầu cao về vitamin của cơ thể ngƣời cũng nhƣ của các ngành công nghiệp có liên quan. Tuy nhiên Vit.C là 1 chất rất dễ bị phân hủy trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng bình thƣờng. Do đó, việc xác định nó trong các đối tƣợng trên một cách chính xác, nhanh chóng là một yêu cầu hàng đầu đƣợc đặt ra. Ở Việt Nam, phƣơng pháp xác định hàm lƣợng Vit.C trong các phòng thí nghiệm chủ yếu là phƣơng pháp chuẩn độ thể tích, có độ chính xác và độ nhạy không cao. Theo nghiên cứu Vit.C là một hợp chất có tính khử, có thể phân tích bằng các phƣơng pháp điện hóa, đặc biệt là phƣơng pháp cực phổ (Vôn-ampe). Đây là một trong những phƣơng pháp phân tích hợp chất hữu cơ nhanh và đạt đƣợc độ chính xác cao, hơn nữa chi phí cho máy móc và hóa chất rất phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm ở Việt Nam. Vì vậy em đã chọn đề tài nghiên cứu: ʽʽXÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN C TRONG NƯỚC CAM ÉP VÀ NƯỚC MRDINK ĐÓNG HỘP BẰNG PHƯƠNG PHÁP VÔN-AMPE’’ Nhiệm vụ chính đặt ra: - Nghiên cứu quy trình xác định Vit.C bằng phƣơng pháp cực phổ (Vôn-ampe) một cách nhanh chóng, độ chính xác cao, chi phí thấp, dễ thực thi trong các phòng thí nghiệm ở Việt Nam. - Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích. - Ứng dụng xác định Vit.C trong một số đối tƣợng trên thị trƣờng: nƣớc trái cây tƣơi, các sản phẩm nƣớc đóng hộp… Nguyễn Thu Trang 4 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 NỘI DUNG Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VITAMIN C 1.1.1. Công thức và nhận định Vitamin C là tên thƣờng gọi của axit L-ascobic, có tên quốc tế là: 2-oxo-L-threo-hexono-1,4-lactone-2,3-enediol hoặc: (R)-3,4-dyhydroxy-5-((S)-1,2-dyhydroxylethyl)furan-2-(5H)-one. Công thức phân tử: C6H8O6 Khối lƣợng phân tử: 176,1 Nhiệt độ nóng chảy: 193°C Công thức cấu tạo: 6CH2OH 5 OH O 4 HO 3 1 2 O OH ( *) pK1 (C3-OH): 4,2 pK2 (C2-OH): 11,6 Trong công thức cấu tạo của axit ascobic, C4*,C5* là Cacbon bất đối, vì vậy tồn tại 4 đồng phân quang học: axit L-ascobic, axit izo L-ascobic, axit D- Nguyễn Thu Trang 5 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 ascobic, axit izo D-ascobic. Trong các đồng phân này chỉ có axit L-ascobic và axit izo L-ascobic là có tác dụng chữa bệnh, còn các đồng phân D và izo D là các antivitamin, tức là chất ức chế tác dụng của vitamin. Trong thiên nhiên chỉ tồn tại dạng axit L-ascobic, còn các đồng phân khác chỉ thu đƣợc bằng con đƣờng tổng hợp. Axit ascobic rắn là những tinh thể đơn tà, không màu, không mùi, có vị chua, nóng chảy ở 193°C. Axit ascobic dễ tan trong nƣớc, ít tan hơn trong rƣợu và không tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực. Axit ascobic rất dễ bị phân hủy dƣới tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ. Vì vậy cần bảo quản axit ascobic trong bóng tối và nhiệt độ thấp. 1.1.2. Tính chất hóa học a. Tính khử Axit ascobic là chất khử mạnh, có bán phản ứng nhƣ sau: CH2OH OH O HO CH2OH OH O O OH Ax it L- ascobic O O + 2H + + 2e- O Ax it L- dehidr oascobic Thế khử của nó phụ thuộc nhiều vào pH của môi trƣờng. Axit ascobic ở dạng khan, khá bền vững, nhƣng do trong phân tử có 2 nhóm OH đính vào C chƣa no (C2,C3) nên khi bị ẩm ƣớt hoặc ở trong dung dịch nó rất dễ bị oxi hóa, ngay cả bởi oxi không khí, nhất là khi có mặt các ion kim loại: đồng, sắt, magiê,… theo phản ứng sau: Nguyễn Thu Trang 6 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 CH 2OH CH2OH OH OH O HO O O O 1/2 O2 OH H 2O O O Sản phẩm tạo ra là axit L-đehiđroascobic, chất này cũng có hoạt tính sinh học tƣơng tự nhƣ axit L-ascobic, nhƣng không bền, nó dễ bị thủy phân phá vòng tạo axit 2,3-đixetogulonic CH2OH-(CHOH)2-CO-CO-COOH, là chất không có tác dụng sinh hóa. Cơ chế sự phân hủy của axit ascobic bởi chất oxi hóa có thể đƣợc biểu diễn theo sơ đồ sau: CH 2OH CH 2OH OH OH O O - 2e- O 2H + O +2e +2H + HO OH HO C HO OH [ O] H 2O HO O Ax it L- ascobic COOH C O O HO CH 2OH CH 2OH C HO HO HO C O CH 2OH [ O] HO C O OH [ O] HO C OOH [ O] HO [ O] CH 2OH C O C O CH 2OH CH 2OH C HO OH CH 2OH C HO CH 2OH CH 2OH CH 2OH COOH H 2O Ax it 2,3- dix etogulonic [ O] CH 2OH COOH CH 2OH Ax it L- dehidr oascobic COOH OH [ O] COOH [ O] COOH COOH [ O] COOH [ O] C O CH 2OH Có thể thấy, axit L-ascobic đầu tiên bị oxi hóa thành axit Lđehiđroascobic. Dƣới tác dụng của nƣớc, axit L-đehiđroascobic bị thủy phân mở vòng tạo thành axit 2,3-đixetogulonic không còn hoạt tính vitamin nữa. Phản ứng này không thuận nghịch, tăng nhanh theo pH và nhiệt độ của dung Nguyễn Thu Trang 7 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 dịch. Tiếp theo, axit 2,3-đixetogulonic bị phân hủy thành một loạt các sản phẩm trung gian khác, cuối cùng tạo axit oxalic. Ngoài sự phân hủy theo kiểu oxi hóa, axit ascobic còn có xu hƣớng phân hủy theo kiểu thủy phân trong môi trƣờng kiềm hoặc axit mạnh thành fufurol và các sản phẩm khác qua phản ứng decacboxyl hóa và dehydrat hóa Tƣơng tự nhƣ vậy,axit ascobic dễ dàng nhƣờng hiđro cho các peoxit, vì vậy ngăn không cho các peoxit oxi hóa các hợp chất khác. Do đó, ngƣời ta sử dụng axit ascobic làm chất chống oxi hóa trong công nghiệp chế biến. b. Tính axit Trong dung dịch nƣớc axit ascobic là một axit yếu ở nấc 1, pK a,1=4,2 tƣơng ứng với quá trình phân ly H+ của nhóm OH đính vào C3(*) và rất yếu ở nấc 2, pKa,2=11,6 tƣơng ứng với sự phân ly H+ của nhóm OH đính vào C2(*). Axit ascobic dễ dàng phản ứng với dung dịch bazơ mạnh nhƣ NaOH, KOH, Ca(OH)2 tạo muối. CH 2OH CH2OH OH OH O O HO O + O NaOH OH NaO + H 2O OH Các muối này dễ tan trong nƣớc hơn axit ascobic nên trong công nghiệp ngƣời ta sử dụng dạng muối của axit ascobic làm chất bảo quản các dung dịch nƣớc quả. Trong dung dịch kiềm đặc, vòng  -lacton bị phá vỡ tạo muối gluconat: CH 2OH OH O HO O + NaOH CH 2OH ( CHOH) 3 C COONa + H 2 O OH Nguyễn Thu Trang O 8 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 Tuy nhiên, khi axit hóa và đun nhẹ thì vòng lacton lại lặp lại. c. Tác dụng với axit hữu cơ tạo este Trong CTCT của axit ascobic có nhiều nhóm OH nhƣ nhóm chức rƣợu, có khả năng tạo este với các axit hữu cơ, đặc biệt là các axit béo nhƣ axit panmitic, axit stearic. Sản phẩm tạo este dạng 6-O-axyl L-ascobic (ascobyl panmitat, ascobyl stearat), có mạch cacbon dài, dễ tan trong dầu. Những este này đƣợc tổng hợp dùng làm chất bảo quản chất béo trong công nghiệp chế biến. Một số dẫn xuất khác của axit ascobic cũng đƣợc sử dụng là: CH2OH CH2OH OH O HO OR 2- O- ankyl ax it ascobic CH 2OCOR OH O HO OH O O RO CH 2OH 6- O- ankanoyl ascobat HO OH 5,6- O- ankyliden ax it ascobic CH 2OH OH OH O HO OH O O O O 3- O- ankyl ax it ascobic O O R OH O O OCOR 2- O- ankanoyl ascobat ROCO O OH 3- O- ankanoyl ascobat Trong đó, R là các gốc hiđrocacbon mạch dài, có thể no hoặc không no, giúp cho các dẫn xuất của axit ascobic dễ tan trong dầu béo hơn. 1.1.3. Hoạt tính sinh hóa Vit.C có tác dụng tăng cƣờng sức đề kháng cho cơ thể, chống lại các hiện tƣợng choáng hoặc ngộ độc hóa chất, độc tính của vi trùng do tính chất khử mạnh của Vit.C. Nguyễn Thu Trang 9 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 Vit.C tham gia vào quá trình oxi hóa khử khác nhau của cơ thể nhƣ: Chuyển hóa hợp chất thơm thành phenol; quá trình hyđroxyl hóa triptophan thành hyđroxyltritophan; điều hòa sự tạo AND từ ARN; chuyển procolagen thành colagen, nhờ có quá trình hyđroxyl hóa prolin thành oxyprolin cần thiết cho việc tổng hợp colagen, vì vậy Vit.C làm cho vết thƣơng mau lành. Vit.C có vị trí quan trọng trong quá trình hình thành các hoormon của tuyến giáp trạng và tuyến trên thận. Khi cơ thể thiếu Vit.C sẽ xuất hiện các triệu chứng bệnh lí nhƣ: chảy máu ở lợi, răng, lỗ chân lông hoặc các cơ quan nội tạng, đó là do thành các mạch máu bị mỏng. Cơ thể bình thƣờng có nhu cầu Vit.C trong 24h là: 60÷80 mg 1.1.4. Các nguồn cung cấp Vit.C Trong tự nhiên, thực vật tổng hợp đƣợc Vit.C, không thấy xuất hiện Vit.C trong các sản phẩm từ động vật nhƣ: thịt, trứng, sữa… Một số cơ thể sống có khả năng tổng hợp Vit.C từ D-glucozo nhờ tác dụng của enzim theo sơ đồ sau: HOHC H OH HO H H OH O H CH 2OH HOHC H OH HO H H OH O H COOH [ O] enzim [ H] enzim CH 2OH H OH HO H H OH H OH COOH D- glucozo CH 2OH OH O enzim OH H HO O [ O] enzim CH 2OH OH O HO H O OH Ax it L- ascobic Nguyễn Thu Trang 10 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 Ngoài ra con ngƣời tổng hợp Vit.C nhằm các mục đích khác nhau. Các chế phẩm dƣợc chỉ chứa Vit.C, hay các viên vitamin tổng hợp trong đó có Vit.C dùng mục đích chữa bệnh, tăng cƣờng sức đề kháng cho ngƣời ốm. Các loại nƣớc hoa quả, giải khát, bột dinh dƣỡng trẻ em, sữa,… chứa một lƣợng nhỏ Vit.C, là một tiêu trí quảng cáo cho sản phẩm. Một lƣợng lớn Vit.C làm chất bảo quản thực phẩm. Trong công nghiệp dƣợc phẩm, Vit.C đƣợc tổng hợp qua các giai đoạn sau: CH O CH 2OH CH 2OH CH 2OH OH H OH C O H 3C O C H 2/Ni HO H H C oxi hóa HO H + 2CH 3COCH 3 O H OH H OH Acetobacter xylinum H OH H 3C H+ H O O H HO H HO H H C CH 2OH CH 2OH CH 2OH CH 2 O D- Sobozo D- glucozo D- Sobitol H HO H HO CH 3 CH 3 [ O] HO C O HO C H HO H COOH CO CO H+ T automehóa CH 2OH C O O HO H H HO H + 2H 2O, H + - 2CH 3COCH 3 CH 2OH H 3C O C C O H H 3C H O O H CH 3 C CH 2 O Vitamin C CH 3 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VIT.C Có thể chia các phƣơng pháp xác định Vit.C thành 2 nhóm lớn: - Nhóm các phƣơng pháp phân tích hóa học - Nhóm các phƣơng pháp phân tích công cụ 1.2.1. Phƣơng pháp phân tích hóa học Trong các phƣơng pháp phân tích hóa học, phƣơng pháp chuẩn độ oxi hóa khử đƣợc sử dụng nhiều nhất, dựa vào tính chất dễ bị oxi hóa thành axit đehiđroascobic của axit ascobic. Để oxi hóa ngƣời ta sử dụng các thuốc thử khác nhau nhƣ: 2,6-điclophenoindophenol, brom, iot, thuốc thử Feling… Nguyễn Thu Trang 11 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 2,6-điclohenoindophenol đƣợc coi nhƣ là thuốc thử chuẩn dùng để chuẩn độ chính xác Vit.C một cách trực tiếp. Nó là một chất oxi hóa có màu xanh đậm, có công thức phân tử là: C12H6Cl2NO2,  max trong dung dịch nƣớc bằng 602nm. Khi phản ứng với axit ascobic nó bị khử thành một hợp chất không màu. C6H8O6 - 2H+ - 2e-  C6H6O6 C12H7Cl2NO2 + 2H+ + 2e-  C12H9Cl2NO2 Ngƣời ta có thể theo dõi quá trình chuẩn độ bằng mắt, đo quang hay đo điện thế. Việc chuẩn độ axit ascobic thông thƣờng đƣợc tiến hành bằng cách nhỏ từ từ dung dịch thuốc thử từ buret vào dung dịch nghiên cứu chứa axit ascobic trong môi trƣờng có pH thích hợp. Điểm cuối chuẩn độ đƣợc nhận ra khi có sự xuất hiện màu của giọt thuốc thử dƣ đầu tiên. Phƣơng pháp này có thể đƣợc áp dụng trực tiếp để xác định Vit.C trong dƣợc phẩm. Tuy nhiên trong các đối tƣợng khác nhƣ rau quả, lƣơng thực, thực phẩm thƣờng chứa các chất khử khác nữa và dung dịch nghiên cứu thƣờng có màu và đục, gây khó khăn cho việc xác định điểm cuối chuẩn độ. Ngƣời ta cũng có thể chuẩn độ axit ascobic bằng dung dịch iot, với chất chỉ thị hồ tinh bột để xác định Vit.C trong bắp cải, hoặc chuẩn độ gián tiếp, xác định Vit.C trong mật ong, bằng cách thêm lƣợng dƣ dung dịch KBr vào dung dịch mẫu đã đƣợc axit hóa bằng dung dịch H2SO4 1:1. Hỗn hợp này đƣợc chuẩn độ bằng dung dịch KBrO3 cho đến khi xuất hiện màu vàng của Br2 dƣ. Thực chất đã xảy ra phản ứng: 5Br   BrO3  6H   3Br2  3H 2O C6 H8O6  Br2  C6 H 6O6  2Br   2H  Nguyễn Thu Trang 12 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khi hết axit ascobic lƣợng BrO3- cho vào sẽ sinh ra Br2 không đƣợc phản ứng tiếp. Sau đó xác định lƣợng Br2 dƣ đó bằng phƣơng pháp chuẩn độ iot bằng dung dịch natri thiosunfat chuẩn. Tuy nhiên các phƣơng pháp chuẩn độ tiến hành khá phức tạp, đồng thời có độ chọn lọc, độ nhạy và độ chính xác không cao. Vì vậy từ khi các phƣơng pháp phân tích công cụ ra đời, ngƣời ta khắc phục đƣợc rất nhiều nhƣợc điểm của các phƣơng pháp phân tích hóa học. 1.2.2. Nhóm các phƣơng pháp phân tích công cụ Thời gian gần đây, cùng với sự phát triển nhƣ vũ bão trong tất cả các lĩnh vực của xã hội, những yêu cầu đặt ra cho ngành phân tích là phải nhanh, chính xác, quy trình đơn giản, lƣợng mẫu tiêu thụ nhỏ, không những tiết kiệm tiền của, công sức mà cả thời gian cho xã hội. Với sự hỗ trợ của các phƣơng pháp phân tích công cụ và những thiết bị hiện đại, việc xác định Vit.C cũng đã đạt đƣợc những yêu cầu đó. Đặc biệt, quy trình phân tích nhanh và đa số trƣờng hợp không phải xử lý mẫu trƣớc khi giảm thiểu đƣợc sự mất mát Vit.C trong quá trình định lƣợng. Các phƣơng pháp phân tích công cụ có thể xác định Vit.C gồm nhóm các phƣơng pháp phân tích quang học và nhóm các phƣơng pháp phân tích điện hóa. Trong đó hầu hết các phƣơng pháp đều xác định Vit.C một cách gián tiếp. Nhƣ đã trình bày, dung dịch Vit.C là không màu, do đó không thể cho tín hiệu đo quang ở vùng khả kiến, vì vậy ngƣời ta thƣờng dùng một tính chất nào đó của Vit.C mà sự biến đổi nồng độ Vit.C sẽ gây ra tín hiệu quang biến đổi tƣơng ứng, cùng tăng hoặc cùng giảm theo hàm lƣợng Vit.C. Hay khi dùng phƣơng pháp hấp thụ nguyên tử, do Vit.C rất dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao nên không thể cho tín hiệu trực tiếp trên máy AAS. Nguyễn Thu Trang 13 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 Để hỗ trợ thêm cho các phƣơng pháp phát hiện Vit.C, các kỹ thuật tách cũng đƣợc kết hợp để tăng độ chính xác, độ nhạy và độ chọn lọc của phƣơng pháp phân tích. Có thể kể đến các kỹ thuật sắc ký, gồm sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng cao áp (HPLC), kỹ thuật tiêm mẫu phân tích vào dòng chảy (FIA). 1.2.2.1. Phƣơng pháp phân tích quang học Vit.C là chất rắn dạng tinh thể không màu, dung dịch Vit.C cũng trong suốt nhƣng nó dễ bị oxi hóa và có tác dụng ức chế hay xúc tác cho các phản ứng phát quang, thông qua đó ngƣời ta có thể định lƣợng Vit.C Các tác giả sử dụng chất oxi hóa khác nhau và thông qua nó gián tiếp xác định hàm lƣợng Vit.C. Kali cromat đƣợc sử dụng làm chất ôxi hóa axit ascobic, kali cromat còn dƣ sẽ phản ứng với điphenyl cacbazit (DPC) có mặt axit nitric tạo phức màu có λmax = 548nm. Mật độ quang A đo ở λmax= 548nm sẽ tỷ lệ thuận với lƣợng kali cromat dƣ và tỷ lệ nghịch với lƣợng Vit.C trong mẫu. 2CrO42  3C6 H8O6  10H   Cr 3  3C6 H 6O6  8H 2O CrO42  Sym  DPC  Cr  DPC phúc (max  548nm) Cr (III) tạo ra trong phản ứng thứ nhất là rất nhỏ nên không đóng góp đáng kể vào mật độ quang A đo ở λmax = 548nm. Ƣu điểm của phƣơng pháp là sử dụng hóa chất đơn giản, dễ kiếm, máy đo quang không đắt tiền, phổ biến trong các phòng thí nghiệm. Trong điều kiện thí nghiệm đó, tác giả và cộng sự đã xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn tuyến tính hàm lƣợng Vit.C đến 5µg/ml (tƣơng ứng 5ppm, khoảng 3.10-5 mol/l) và giới hạn phát hiện tới 0,02µg/ml (20ppb, khoảng 10-7 mol/l). Ứng dụng xác định Vit.C trong thuốc viên và thuốc nƣớc chứa Vit.C, nƣớc ép hoa quả, các loại rƣợu hoa quả cho kết quả tốt. Chen, Xu-wei và các cộng sự đã nghiên cứu quy trình xác định Vit.C bằng phƣơng pháp tiêm mẫu vào dòng chảy kết nối với detectơ đo quang. Nguyễn Thu Trang 14 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 Trên cơ sở sử dụng Fe(III) làm chất ôxi hóa axit ascobic, sản phẩm Fe(II) sinh ra tạo phức màu với 2,2’- đipiriđin trong môi trƣờng axit yếu (pH=5), kết quả đo A ở λmax= 523nm sẽ tỷ lệ thuận với lƣợng axit ascobic trong mẫu. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là khả năng tự động hóa, cho phép xác định 60 mẫu thuốc/giờ. Trong khi đó, Yebra-Biurrun và cộng sự lại sử dụng pemanganat làm chất oxi hóa axit ascobic, dùng kỹ thuật FIA và đầu ghi AAS để xác định hàm lƣợng Mn(VII) còn dƣ, Mn(II) tạo ra sẽ đƣợc giữ trên lớp nhựa poli (axit amino photphoric) sẽ không gây ảnh hƣởng đến kết quả xác định Mn(VII) dƣ. Việc tăng độ nhạy xác định Vit.C đạt đƣợc khi sử dụng các phản ứng quang hóa mà axit ascobic có tác dụng xúc tác cho quá trình chuyển mức năng lƣợng. Dựa trên phản ứng quang hóa của Rodamin B và Ceri(IV) trong môi trƣờng axit sunfuric, quy trình cho phép xác định Vit.C tới 10-13 mol/l, đƣờng chuẩn tuyến tính trong khoảng 3,8.10-13 ÷ 10-10 mol/l. Vit.C có khả năng phản ứng với nhiều chất oxi hóa khác nhau, do vậy các tài liệu nghiên cứu xác định hàm lƣợng Vit.C bằng phƣơng pháp phân tích quang học rất phong phú và đa dạng. Tuy nhiên không tránh khỏi một phần Vit.C có thể phản ứng với oxi không khí hay các chất khử khác cũng có thể phản ứng với các chất oxi hóa đó. 1.2.2.2. Nhóm các phƣơng pháp phân tích điện hóa 1.2.2.2.1. Sơ lƣợc về các phƣơng pháp cực phổ (Vôn-ampe)  Nguyên tắc của phƣơng pháp Nhóm các phƣơng pháp phân tích cực phổ (Vôn-ampe) là phƣơng pháp quan trọng nhất trong số các phƣơng pháp phân tích điện hóa. Các phƣơng pháp này đều dựa trên lý thuyết về quá trình điện cực, phụ thuộc chủ yếu vào việc đƣa chất điện hoạt từ trong lòng dung dịch đến bề mặt điện cực làm việc Nguyễn Thu Trang 15 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 và ghi đƣờng Vôn-ampe (đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc cƣờng độ dòng Faraday vào giá trị thế của điện cực làm việc so với điện cực so sánh). Hình 1.1: Sơ đồ thiết bị phân tích Vôn-ampe  Điện cực làm việc Trong các phƣơng pháp phân tích Vôn-ampe, điện cực làm việc thƣờng dùng là: điện cực giọt Hg, điện cực rắn làm từ Platin, vàng, bạc, hoặc cacbon kính. Phƣơng pháp phân tích cực phổ sử dụng điện giọt Hg, hay dùng là điện cực giọt treo (HMDE), điện cực giọt rơi (DME) và điện cực giọt tĩnh (SMDE). Điện cực là giọt Hg lỏng hình cầu có đƣờng kính khá nhỏ (≤ 1 mm), đƣợc rơi ra từ một mao quản có chiều dài khoảng 10÷15 cm, với đƣờng kính trong khoảng 30÷50 µm, mao quản đƣợc nối với bình chứa Hg bằng một ống dẫn nhỏ polietilen. Trong điện cực giọt rơi, giọt Hg liên tục đƣợc hình thành ở đầu ống mao quản và rơi ra do lực hấp dẫn, kích thƣớc và chu kỳ (hay tốc độ chảy) của giọt Hg đƣợc điều khiển bởi kích thƣớc mao quản và chiều cao của bình chứa Hg. Tốc độ đó đƣợc quy ƣớc tính bằng khối lƣợng Hg rơi ra khỏi mao quản trong một đơn vị thời gian (theo mg/s). Thông thƣờng ngƣời ta chọn Nguyễn Thu Trang 16 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 kích thƣớc mao quản và chiều cao bình chứa sao cho tốc độ chảy khoảng 1,5÷4,0 mg/s, chu kỳ mỗi giọt khoảng 2÷6s. Trong điện cực giọt treo (thƣờng dùng trong phân tích Vôn-ampe vòng), giọt Hg có kích thƣớc nhỏ, có thể thay đổi đƣợc tùy theo yêu cầu thực nghiệm. Giọt đƣợc hình thành rất nhanh và đƣợc giữ ở đầu mao quản trong quá trình đo. Ƣu điểm của điện cực giọt Hg: - Khoảng thế phân tích rộng, quá thế H2 trên điện cực giọt Hg lớn, vì vậy mở rộng khoảng thế phân tích đến -1V (so với điện cực calomen bão hòa) trong môi trƣờng axit và đến -2V trong môi trƣờng bazơ. Tuy nhiên do có quá trình oxi hóa của Hg lỏng nên điện cực chỉ đƣợc sử dụng đến -0,3V hoặc 0,4V (so với điện cực calomen bão hòa) tùy môi trƣờng. - Bề mặt giọt luôn đƣợc đổi mới và không bị làm bẩn bởi sản phẩm của phản ứng điện cực. - Với các điện cực hiện đại, giọt Hg đƣợc điều khiển bởi hệ thống van khí, do vậy độ lặp lại của giọt cao, tăng độ lặp, độ đúng và độ chính xác khi phân tích. - Kích thƣớc giọt nhỏ nên lƣợng chất tiêu tốn khi phân tích là không đáng kể, do đó sự giảm nồng độ trong quá trình phân tích do sự oxi hóa khử trên điện cực thực tế là không xảy ra.  Điện cực so sánh Thƣờng hay sử dụng điện cực Ag/AgCl hay điện cực calomen bão hòa. Điện cực so sánh phải có thế ổn định.  Sóng cực phổ khuếch tán - Sóng cực phổ cổ điển có dạng bậc thang, dòng cực đại id tỷ lệ tuyến tính với nồng độ chất phân tích trong dung dịch id=f(C), ngƣời ta lợi dụng tính chất này để phân tích định lƣợng. Tuy nhiên sóng cực phổ cổ điển có độ phân Nguyễn Thu Trang 17 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 giải không cao cũng nhƣ có dòng dƣ lớn. Do đó hạn chế độ nhạy của phƣơng pháp chỉ xác định đƣợc 10-5M và khả năng xác định nhiều chất cùng trong một hỗn hợp là khó khăn, độ chọn lọc kém. (Hình 1.2) - Với kỹ thuật quét thế, kỹ thuật ghi dòng hiện đại đã khắc phục đƣợc nhƣợc điểm đó, đồng nghĩa với tăng độ nhạy lên rất nhiều. Có thể kể đến + Cực phổ sóng vuông (SqW) + Cực phổ dòng xoay chiều hình sin (AC) + Cực phổ xung thƣờng và xung vi phân (NP và DP) + Các phƣơng pháp Vôn-ampe trên điện cực đĩa quay + Phân tích điện hóa hòa tan Với độ nhạy đối với + Cực phổ cổ điển (DC) 10-4 ÷ 10-6M + Cực phổ sóng vuông và xung vi phân 10-6 ÷ 10-8M + Vôn-ampe hòa tan anot điện cực giọt Hg treo 10-6 ÷ 10-9M + Vôn-ampe hòa tan anot dùng cực màng Hg 10-8 ÷ 10-10M trên cực rắn đĩa Có thể thấy các phƣơng pháp phân tích điện hóa rất phong phú và đa dạng. Phạm vi đối tƣợng nghiên cứu rộng, cả hợp chất vô cơ và hàng nghìn hợp chất hữu cơ các loại. Trong đó Vit.C là một trong những hợp chất hữu cơ đƣợc nghiên cứu ứng dụng theo nhiều cách khác nhau dƣới lý thuyết của các phƣơng pháp phân tích điện hóa. 1.2.2.2.2. Ứng dụng các phƣơng pháp phân tích điện hóa xác định Vit.C Phƣơng pháp phân tích điện hóa đƣợc dùng chủ yếu là các phƣơng pháp phân tích cực phổ (Vôn-ampe). Trong đó việc sử dụng điện cực Hg, đặc biệt là có sự hỗ trợ của thiết bị điện tử, kết nối với máy vi tính tăng độ nhạy và độ chính xác của phép phân tích lên rất nhiều đồng thời quy trình cho phép Nguyễn Thu Trang 18 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 phân tích nhanh, không cần xử lý mẫu phức tạp, tránh đƣợc sự mất mát Vit.C do sự oxi hóa không khí. Trƣớc năm 1950, phƣơng pháp cực phổ cổ điển đã đƣợc áp dụng xác định hàm lƣợng Vit.C trong nhiều mẫu thuốc, rau, quả... Nhiều công trình nghiên cứu đã tìm đƣợc điều kiện thích hợp cho phép xác định Vit.C. Tuy nhiên do giới hạn của phƣơng pháp cực phổ cổ điển mà việc định lƣợng Vit.C vẫn bị gây cản trở bởi một số chất có thế khử gần với thế khử của axit ascobic. Các hợp chất sunfuhydryl thƣờng có mặt trong các mô thực vật là một trong số đó, vì vậy đối tƣợng phân tích còn hạn chế. Gần đây, các kỹ thật quét thế và ghi dòng đƣợc hỗ trợ bởi các thiết bị điện tử hiện đại, những máy điện hóa đa chức năng ra đời và rất phổ biến ở các phòng thí nghiệm. Những nhƣợc điểm đó đƣợc khắc phục, nhƣng không nhiều công trình nghiên cứu xác định xác định Vit.C trực tiếp trên điện cực giọt Hg mà một số nghiên cứu đi theo hƣớng chế tạo điện cực biến tính, điện cực sinh học, chủ yếu là tạo màng sinh học hay màng polyme, các loại màng đƣợc chế tạo đều có khả năng hoạt động điện hóa với axit ascobic. Khả năng tự động hóa tăng lên, cho phép xác định 120 mẫu/giờ. Tuy nhiên, tuổi thọ của các điện cực này ngắn do trong quá trình phân tích axit ascobic đã khử các ion kim loại trên bề mặt điện cực. Để duy trì điện cực ngƣời ta thƣờng cho thêm vào hỗn hợp phản ứng một chất oxi hóa để tái tạo các ion trên bề mặt, Julio Cesar đã dùng H2O2 là chất oxi hóa giúp tái tạo ion Cu2+ từ ion Cu+, là sản phẩm của phản ứng điện cực với axit ascobic. Quay trở lại điện cực giọt Hg, ngoài nhƣợc điểm duy nhất là tính độc của Hg thì nó vẫn là điện cực tối ƣu trong phƣơng pháp cực phổ xác định các chất hữu cơ. Tuy nhiên các hãng sản xuất cũng đã khắc phục tối đa nhƣợc điểm này, kích thƣớc hạt nhỏ (đƣờng kính < 1mm), nếu sử dụng giọt treo thì khối lƣợng Hg cho phép đo là không đáng kể, có thể thu hồi đƣợc, ví dụ: một Nguyễn Thu Trang 19 Lớp K32C - Hóa học Khóa luận tốt nghiệp Đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 giọt Hg ở thiết bị phân tích điện hóa đa năng VA757 của Metrohm có diện tích bề mặt từ 0,15÷0,60 mm2. Quy trình nhanh, chính xác, khả năng phân tích hàng loạt là có thể đạt đƣợc. Vì vậy em chọn sử dụng điện cực giọt Hg treo trong phân tích Vit.C. 1.2.2.2.3. Phƣơng pháp cực phổ xung vi phân Phƣơng pháp cực phổ xung vi phân là phƣơng pháp phân tích điện hóa hiện đại, đƣợc cải tiến cả về kỹ thuật quét thế và kỹ thuật ghi dòng, khắc phục đƣợc đa số nhƣợc điểm của phƣơng pháp cực phổ cổ điển và phƣơng pháp xung thƣờng. Trong phƣơng pháp xung vi phân, điện cực đƣợc phân cực bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với tốc độ chậm. Ghi dòng tại hai thời điểm trƣớc khi nạp xung và trƣớc khi ngắt xung. Đƣờng biểu diễn sự khác nhau giữa hai dòng này vào thế điện cực có dạng pic, rất dễ xác định, có độ phân giải cao. Do vậy mà phƣơng pháp xung vi phân giảm tối đa dòng dƣ, một hạn chế của cực phổ cổ điển (hình 1.2). Sự phụ thuộc dòng cực đại trong cực phổ xung vi phân vào các thông số của quá trình đo cực phổ đƣợc tính toán lý thuyết cho hệ thức sau: 1/ 2  D  i  nFSC     tx  P( 2  1)   P  1  P   (1.1) Trong đó: n: số e- trao đổi trong phản ứng điện cực F: hằng số Faraday S: diện tích bề mặt điện cực C: nồng độ chất điện hoạt D: hệ số khuếch tán tx: thời gian một xung σ = exp(nF∆E/(2RT)) Nguyễn Thu Trang (1.2) 20 Lớp K32C - Hóa học