Tài liệu Xác định đồng thời paracetamol và ibuprofen trong các dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI PARACETAMOL VÀ IBUPROFEN TRONG CÁC DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLC Giáo viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Ngọc Hưng Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thành Lộc Lớp: Hóa 4C Thành phố Hồ Chí Minh – tháng 5 năm 2013 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 2 Chương 1. TỔNG QUAN.................................................................................................... 3 1.1. Paracetamol ................................................................................................................. 3 1.1.1. Cấu tạo .............................................................................................................. 3 1.1.2. Tính chất vật lý và hóa học........................................................................................ 3 1.1.3. Dược tính .............................................................................................................. 3 1.2. Ibuprofen .................................................................................................................. 3 1.2.1. Cấu tạo .............................................................................................................. 3 1.2.2. Tính chất vật lý và hóa học........................................................................................ 4 1.2.3. Dược tính .............................................................................................................. 4 1.3. Các loại dược phẩm chứa Paracetamol và Ibuprofen ................................................... 4 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................................. 4 1.4.1. Phân tích Paracetamol ............................................................................................... 4 1.4.2. Phân tích Ibuprofen ................................................................................................... 5 1.4.3. Phân tích đồng thời Paracetamol và Ibuprofen. ........................................................ 6 1.5. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................ 7 1.5.1. Khái niệm .............................................................................................................. 7 1.5.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký ......................................................................... 7 1.5.3. Phân loại sắc ký hấp phụ ........................................................................................... 8 1.5.4. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ ...................................................................... 9 1.5.5. Hệ thống HPLC ....................................................................................................... 13 1.5.6. Phương pháp chọn điều kiện sắc ký ........................................................................ 16 1.5.7. Các bước tiến hành sắc ký ....................................................................................... 19 Chương 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................................. 21 2.1. Hóa chất và dụng cụ ................................................................................................... 21 2.1.1. Hóa chất ............................................................................................................ 21 2.1.2. Dụng cụ - Thiết bị.................................................................................................... 22 2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................................. 23 2.2.1. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc ký HPLC ............................................. 23 2.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng hỗn hợp Paracetamol và Ibuprofen. ............... 26 2.2.3. Ứng dụng quy trình phân tích các mẫu dược phẩm ................................................ 27 2.2.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả .................................................................. 29 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 31 3.1. Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký ........................................................................... 31 3.1.1. Chọn cột và thể tích vòng mẫu ................................................................................ 31 3.1.2. Đặt bước sóng cho detector ..................................................................................... 31 3.1.3.Khảo sát nồng độ acid phosphoric............................................................................ 33 3.1.4. Khảo sát thành phần pha động................................................................................. 35 3.1.5. Khảo sát tốc độ dòng ............................................................................................... 37 3.2. Xây dựng phương pháp định lượng ............................................................................ 39 3.2.1. Xác định LOD và LOQ của thiết bị......................................................................... 39 3.2.2. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính ....................................................................... 39 3.2.3. Khảo sát độ lặp lại của phép đo ............................................................................... 42 3.3. Ứng dụng quy trình phân tích mẫu thật ...................................................................... 43 3.3.1. Quy trình chiết mẫu ................................................................................................. 43 3.3.2. Xác định hệ số thu hồi của phương pháp ................................................................ 44 3.3.3. Định lượng Paracetamol và Ibuprofen trong một số mẫu dược phẩm .................... 44 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................................ 48 4.1. Kết luận ................................................................................................................ 48 4.2. Đề xuất ................................................................................................................ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 50 Trang 1 MỞ ĐẦU Ngày nay với tốc độ phát triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, công nghệ bào chế thuốc cũng không ngừng có những bước đột phá mới cả về số lượng cũng như chất lượng. Cùng với xu thế hội nhập thế giới, ở Việt Nam các chế phẩm thuốc cơ bản chuyên giảm đau, hạ sốt, kháng viêm… cũng được sản xuất rất đa dạng, thành phần không chỉ chứa các dược chất có hoạt tính mà còn chứa nhiều loại tá dược nhằm tăng hiệu quả điều trị. Dược phẩm là một loại hàng hóa đặc biệt nên khâu kiểm nghiệm chất lượng thuốc trở nên hết sức quan trọng; điều này đem lại cho người bệnh hiệu quả và an toàn. Trên thị trường hiện nay, các chế phẩm trong và ngoài nước có tác dụng điều trị các bệnh thông thường như cảm cúm, nhức đầu, giảm đau, kháng viêm, hạ sốt… thường có thành phần chính là Paracetamol, Ibuprofen và Caffein…. Vì thế nhu cầu phân tích định tính cũng như định lượng các dược chất này rất được quan tâm. Ở Việt Nam, các nhà phân tích đã nghiên cứu ứng dụng nhiều phương pháp phân tích hiện đại như trắc quang, điện di mao quản, sắc ký lỏng, sắc ký khí… để xây dựng quy trình phân tích cho mỗi loại dược phẩm khác nhau. Trên xu hướng đó, nhiều công trình nghiên cứu định tính và định lượng Paracetamol, Ibuprofen và Caffein trong các loại dược phẩm đã được thực hiện. Trong dược điển Mỹ USP30 (United State Pharmacy), phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (viết tắt là HPLC) là phương pháp được quy định cho phép định lượng đồng thời Paracetamol và Ibuprofen trong các chế phẩm hai thành phần có chứa đồng thời hai dược chất này cũng như các chế phẩm một thành phần chỉ chứa Paracetamol hoặc Ibuprofen. Tuy nhiên những nghiên cứu ứng dụng phương pháp HPLC để phân tích các dược phẩm có chứa hai thành phần này còn hạn chế, chưa được nghiên cứu sâu. Cùng với những trang thiết bị hiện đại và cơ sở vật chất vốn có của phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Phân Tích – Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Xác định đồng thời Paracetamol và Ibuprofen trong các dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” để nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các mẫu dược phẩm có chứa Paracetamol hoặc Ibuprofen hoặc chứa cả hai thành phần. Trang 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Paracetamol [1] Paracetamol (còn gọi là Acetaminophen) là một trong những dược chất phổ biến nhất ở nước ta có tác dụng giảm đau, hạ sốt nhanh… . 1.1.1. Cấu tạo Công thức phân tử: C 8 H 9 NO 2 . Khối lượng phân tử: 151,17 g/mol. Danh pháp IUPAC: N-(4-hydroxyphenyl)acetamide 1.1.2. Tính chất vật lý và hóa học Tỷ trọng: 1,263 g/cm3. Nhiệt độ nóng chảy: 1690C (3360F). Độ hòa tan trong nước: 0,1 – 0,5 g/100 ml ở 200C. Paracetamol là một chất không mùi, có vị hơi đắng, tinh thể dạng bột màu trắng. Nó hòa tan trong các dung môi hữu cơ như methanol và ethanol nhưng ít tan trong nước và ether. Dung dịch bão hòa có pH = 5,5 – 6,5. 1.1.3. Dược tính Paracetamol là thuốc giảm đau, hạ sốt nhưng có tác dụng chống viêm như aspirin. So với các loại thuốc khác, Paracetamol ít có tác dụng phụ theo liều điều trị và được phép bán không cần kê đơn. Điều trị nhanh chóng hiệu quả các cơn đau đầu, hạ sốt, các triệu chứng cảm cúm, đau sau khi tiêm vaccin, đau răng và khi mọc răng nhưng không trị viêm. 1.2. Ibuprofen [1] Ibuprofen là một loại dược chất cơ bản trong danh mục thuốc thiết yếu của tổ chức Y tế Thế giới, được biết đến như một loại thuốc chống viêm dùng ở liều thấp nhưng có hiệu quả cao trong điều trị. 1.2.1. Cấu tạo Công thức phân tử: C 13 H 18 O 2 . Khối lượng phân tử: 206,28 g/mol. Danh pháp IUPAC: 2-[4-(2-methylpropyl)phenyl]propanoic acid. Trang 3 1.2.2. Tính chất vật lý và hóa học Ibuprofen tồn tại ở dạng bột kết tinh không màu, có mùi đặc biệt. Thực tế không tan trong nước, tan trong ethanol, cloroform, ether và acetone. Tan được trong dung dịch kiềm loãng của hydroxide và carbonate. Về mặt hóa học Ibuprofen là một acid hữu cơ yếu. Nhiệt độ nóng chảy là 760C. Ibuprofen ổn định trong môi trường không có O 2 , ngay cả ở nhiệt độ 105 – 1100C, Ibuprofen cũng bền vững ít nhất 4 ngày. 1.2.3. Dược tính Ibuprofen là thuốc chống viêm không steroid, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm, dạng bào chế phổ biến nhất là viên nén. Điều trị đau từ nhẹ đến vừa và các tình trạng viêm, như đau bụng kinh, nhức nửa đầu, đau hậu phẫu, đau răng, bệnh cơ xương khớp, viêm khớp, viêm đa khớp dạng thấp, thấp khớp thanh niên, bệnh quanh khớp, viêm bao gân, mô mềm, bong gân, căng cơ. 1.3. Các loại dược phẩm chứa Paracetamol và Ibuprofen Danh mục thuốc có chứa Ibuprofen: Alaxan, Amfadol plus, Apo – Ibuprofen, Doaxan – S, Do – Parafen F, Hagifen, Hapacol đau nhức, Ibuprovon, I – Pan, Mofen 400, Parofen, Protamol, Sotstop, Tatanol Extra, Vell, Ibufene Choay… . Danh mục thuốc có chứa Paracetamol: Aceralgin, Alaxan, Andol S, Decolgen Forte, Panadol 500, Hapacol Extra, Efferalgan 500, Tiffy, Tatanol plus… . Các loại thuốc trên được bán rộng rãi trên cả nước, trong các đại lý thuốc tây, bệnh viện và nhà thuốc tư nhân. 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 1.4.1. Phân tích Paracetamol Nghiên cứu “Định lượng đồng thời Paracetamol và Cafein trong chế phẩm bằng phương pháp đo quang” năm 2008 của tác giả Đặng Thanh Thủy đã xây dựng phép định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần Paracetamol và Cafeine bằng các phương pháp quang phổ tử ngoại như đạo hàm và đạo hàm tỷ đối. Đồng thời áp dụng các phương pháp này để định lượng Paracetamol và Cafeine trong một số biệt dược thông dụng trên thị trường hiện nay [2]. Cũng trong năm 2008, tác giả Đặng Quỳnh Chi đã nghiên cứu đề tài: “Định lượng đồng thời Paracetamol và Codein Phosphat bằng phương pháp điện di mao quản”. Với Trang 4 nghiên cứu này, tác giả đã xây dựng phương pháp có thể định lượng đồng thời Paracetamol và Codein phosphat. Trong điều kiện điện di, thời gian di chuyển của Codein Phosphat là 2,5 phút và của Paracetamol là 2,9 phút, khoảng nồng độ tuyến tính 0,06 – 0,40 mg/ml của Codein Phosphat và 0,19 – 0,120 mg/ml của Paracetamol. Phương pháp này nhằm khảo sát về sự phù hợp độ lặp lại và độ đúng. Những chế phẩm có hàm lượng hai thành phần chênh lệch nhau quá 20 lần thì phân tích mẫu thử phải tiến hành ở độ pha loãng khác nhau. Phương pháp đã được áp dụng để định lượng hàm lượng các hoạt chất trong viên nén Para Codein của công ty dược phẩm 3/2 [3]. Năm 2009, tác giả Deodhar MN và cộng sự đã áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao dùng cột pha đảo (RP - HPLC) để phân tích định lượng Paracetamol và Aceclofenac với điều kiện cột pha đảo C 18 ( 250x4,6 mm, 10 µm), pha động là hỗn hợp methanol : nước có tỷ lệ 70 : 30 về thể tích (v/v), tốc độ dòng là 1 ml/phút với đầu dò (detector) đặt ở bước sóng 275 nm. Thời gian lưu của Aceclofenac và Paracetamol là 1,8 và 2,7 phút. Khoảng tuyến tính là 2 – 50 ppm cho Aceclofenac và 5 – 50 ppm cho Paracetamol. Độ thu hồi cho Aceclofenac và Paracetamol là 100,6 % và 100,7 %. Phương pháp này được đánh giá có độ chính xác, độ chọn lọc cao và nhanh chóng định lượng đồng thời Aceclofenac và Paracetamol [4]. 1.4.2. Phân tích Ibuprofen Một phương pháp thường gặp trong nghiên cứu định lượng Ibuprofen là phương pháp phổ huỳnh quang. Năm 2001, tác giả Patricia C. Damiani cùng cộng sự đã áp dụng phương pháp này để phân tích Ibuprofen trong các mẫu dược phẩm, kem và si rô. Bước sóng kích thích ở 263 nm và phát xạ tại 288 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính 2 – 73 mg/l. Phương pháp này có độ chọn lọc rất cao nên sự có mặt của các chất khác cũng như tá dược không ảnh hưởng đến kết quả phân tích, ngoại trừ Chlorzoxazone trong viên nén do Chlorzoxazone hấp thụ mạnh mẽ trong phạm vi quang phổ này. Ngoài ra còn rất nhiều phương pháp khác và được biết đến nhiều nhất là phương pháp HPLC [5]. Năm 2003, S.A. Kulichenko và S.O. Fessenko đã nghiên cứu độ hòa tan và tính acid – base của Ibuprofen trong hệ có chất hoạt động bề mặt, sau đó đề xuất một phương pháp mới có thể chuẩn độ Ibuprofen ở dạng tinh khiết. Giá trị pK a nhỏ nhất (4,43) và độ hòa tan lớn nhất (8,1 mg/ml) của Ibuprofen đạt được khi sử dụng chất hoạt động bề mặt là dung dịch tridecylpyridinium bromide 0,1 M. Phép chuẩn độ được thực hiện với dung dịch chuẩn là KOH 0,05 M, chỉ thị là xanh xylenol. Qua đó, nghiên cứu và đề xuất điều kiện xác định Ibuprofen và Novocaine hydrocloride [6]. Trang 5 Năm 2007, Nguyễn Hữu Mỹ và cộng sự nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng Ibuprofen trong huyết tương chó. Với các điều kiện sắc ký như sau: cột pha đảo C 18 (RP-18) kích thước cột 150 x 4,6 mm, kích thước hạt là 5 µm; đầu dò (detector) đặt ở bước sóng 223 nm, pha động là hỗn hợp acetonitril (ACN) và dung dịch đệm phosphat 0,02 M có pH = 6,5 (tỷ lệ 30 : 70 v/v) với tốc độ dòng 1,2 ml/phút. Khoảng nồng độ tuyến tính của Ibuprofen từ 1 - 20 μg/ml, giới hạn định lượng là 1 μg/ml. Phương pháp này có độ lặp lại cao, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) < 3%, độ chính xác, hệ số thu hồi (R%) > 96%, hiệu suất chiết cao > 80%, quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản, phù hợp cho nghiên cứu dược động học [7]. Sau đó, năm 2008, tác giả Phạm Thanh Huyền cũng dùng phương pháp HPLC để định lượng Ibuprofen trong huyết tương. Nhưng đối tượng là các bệnh nhân nhi nhằm phục vụ công tác theo dõi và điều trị bệnh. Điều kiện tách sắc ký là sử dụng cột RP 18 (150 x 4,6 mm; 5 mm), đầu dò (detector) đặt ở bước sóng 223 nm, pha động là hỗn hợp ACN và dung dịch đệm phosphat 0,01M có pH = 6,5 (tỷ lệ 60 : 40 v/v) với tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Khoảng nồng độ tuyến tính của Ibuprofen từ 5 - 50 μg/ml, giới hạn định lượng là 5 μg/ml. Phương pháp có độ lặp lại khá cao (RSD < 5%), độ chính xác (R% > 95%), hiệu suất chiết cao (83%) [8]. 1.4.3. Phân tích đồng thời Paracetamol và Ibuprofen. Năm 2010, tác giả Phạm Thu Quế đã xây dựng phép định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần Paracetamol và Ibuprofen bằng các phương pháp quang phổ đạo hàm, lấy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) làm phương pháp đối chiếu. Ứng dụng các phương pháp này để định lượng Paracetamol và Ibuprofen trong một số lô của các chế phẩm: Alaxan, Dibulaxan và Febro [9]. Sau đó, tác giả M.R. Khoshayand và cộng sự đã ứng dụng phương pháp quang phổ định lượng ba thành phầnParacetamol, Ibuprofen và Caffein trong các loại thuốc, tiến hành quét phổ hấp thụ trong khoảng 200 nm đến 400 nm trong dung môi là hỗn hợp methanol : HCl 0,1 M (3 : 1) [10]. Năm 2005, bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), tác giả Thái Duy Thìn và cộng sự đã nghiên cứu định lượng Paracetamol, Ibuprofen và nhiều dược chất khác trong các mẫu chế phẩm dược nội và ngoại. Với điều kiện: cột pha đảo C 18 (5μm, 150mm x 4,6mm), pha động là hỗn hợp ACN và dung dịch axit phosphoric 0,1% (60: 40 v/v), tốc độ dòng là 1,0 ml/phút với bước sóng đầu dò (detector) đặt ở miền tử ngoại là 224 nm. Thời gian lưu của Ibuprofen và Paracetamol là 2,04 và 8,22 phút. Với Trang 6 điều kiện này, tiến hành khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) [11]. Tác giả Prasanna Reddy Battu và MS Reddy trong năm 2009 đã định lượng thành công Paracetamol và Ibuprofen bằng phương pháp HPLC dùng cột pha đảo C 18 (5 µm, 150 mm x 4,6 mm), pha động là hỗn hợp dung môi ACN và dung dịch đệm phosphat (pH = 7,04) tỷ lệ 60: 40 v/v, tốc độ dòng là 0,8 ml/phút với đầu đò UV ở 260 nm. Thời gian lưu của Ibuprofen, Paracetamol là 2,48 và 4,45 phút. Nghiên cứu trên đã khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính, LOD, LOQ… và định lượng Paracetamol, Ibuprofen trong các loại dược phẩm bán trên thị trường [12]. 1.5. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp này ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Hiện nay, đây là phương pháp được ứng dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm nhất là kiểm nghiệm thuốc. Và hiện tại, đây là công cụ đắt lực nhất trong phép phân tích định tính và định lượng các loại dược phẩm đa thành phần. 1.5.1. Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử). 1.5.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết. Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử. Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một pha động. Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C… vào cột phân tích, kết quả là Trang 7 các chất A, B, C… sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác. Chất phân tích A +B+C F1 Pha tĩnh F2 F3 Pha động Hình 1.1 Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F 1 ) và ngược lại. Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được quy định bởi ba lực F 1 , F 2 , F 3 . Trong đó F 1 và F 2 giữ vai trò quyết định, còn F 3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. Ở đây F 1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F 2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác nhau thì F 1 và F 2 là khác nhau. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột như hình 1.2. Hình 1.2 Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B. 1.5.3. Phân loại sắc ký hấp phụ Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột. Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ. Trong loại này có hai kiểu hấp phụ: + Sắc ký hấp phụ pha thường (NP): pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực. + Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP): pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực. Trang 8 Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi, thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình như các vitamin, các thuốc hạ nhiệt, giảm đau … Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP). Trong dược điển Mỹ USP (United State Pharmacy) khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau: L 1 : RP 18 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m. L7: RP 8 Kích thước hạt tương ứng từ 5 – 10 m. L3: Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m. Và còn một số loại cột khác như cột Diol –Si-(CH 2 ) 2 -O-CH 2 -CH(OH)-CH 2 OH, cột aminopropyl –Si-(CH 2 ) 3 - NH 2 , cột cyanopropyl –Si(CH 3 ) 2 -(CH 2 ) 3 - CN… 1.5.4. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ mV trB trA t’rA t’rB to Chất A Chất B thời gian t 0 : thời gian lưu chết. t rA : thời gian lưu chất A. t rB : thời gian lưu chất B. t’ rA : thời gian lưu thực chất A. t’ rB : thời gian lưu thực chất B. Hình 1.3 Sắc ký đồ của chất A và chất B. 1.5.4.1. Thời gian lưu thực t’R Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất Trang 9 khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn. Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất. Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố: + Bản chất sắc ký của pha tĩnh. + Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động. + Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan. + Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động Trong một phép phân tích nếu t R ’ nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu t R ’ quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố đã trình bày ở trên. 1.5.4.2. Hệ số dung lượng K’ Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng. K'= t R − t0 t0 (1.1) Nếu K’ nhỏ thì t R cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì peak bị doãng. Trong thực tế K’ từ 1 - 5 là tối ưu. 1.5.4.3. Độ chọn lọc α Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A và B có K’ A và K’ B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc . α= với K B' K A' (với K’ B > K’ A ) càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng. (1.2) Hình 1.4 Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B Trang 10 1.5.4.4. Số đĩa lý thuyết Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động. Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố: + Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh + Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động + Hệ số khuếch tán của các chất trong cột. Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định. Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức sau:  t N = 5,54 R  Wo , 5 Trong đó,     2 (1.3) t R là thời gian lưu của chất phân tích. W 0,5 là độ rộng tại ½ của peak. Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ. 1.5.4.5. Độ phân giải Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của hai peak cạnh nhau phải được tính theo công thức sau: ' ' t rB − t rA R=2 WB + W A (1.4) Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak tách nhau là R = 1,0. Trong phép định lượng R = 1,5 là phù hợp. + Nếu R nhỏ thì các peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích peak sẽ không chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo ba cách sau: * Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động (thay đổi độ phân cực nếu là RP - HPLC, thay đổi cường độ ion nếu là IE – HPLC …) * Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột có kích thước nhỏ hơn. Trang 11 * Làm tăng độ chọn lọc bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá trình tách hoặc thay đổi thành phần pha động . + Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình gradient dung môi. Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký nếu dùng chương trình dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các peak ta phân tích. Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình gradient dung môi mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu cầu trong quá trình phân tích. 1.5.4.6. Hệ số không đối xứng Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của peak trên sắc ký đồ thu được. T được tính bằng tỷ số độ rộng của hai nửa peak tại điểm 1/10 chiều cao peak: T= a b (1.5) a b Hình 1.5 Cách tích hệ số không đối xứng của peak. Peak dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan tâm đến hệ số không đối xứng T. * Khi T 2,5 thì phép định lượng được chấp nhận. * Khi T > 2,5 thì điểm cuối của peak rất khó xác định, vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho peak cân đối hơn theo các cách sau: + Làm giảm thể tích chết tức là đoạn nối từ cột đến detector. + Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên. + Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm thể tích tiêm mẫu. Trang 12 1.5.5. Hệ thống HPLC (5) (3) (2) (4) (1) injector (8) (7) (6) Hình 1.6 Các thiết bị trong hệ thống HPLC Trong đó: 1 - Bình chứa dung môi pha động. 2 - Bộ phận khử khí. 3 - Bơm cao áp. 4 - Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler). 5 - Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt. 6 - Đầu dò detector (nhận tín hiệu). 7 - Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống. 8 – Thiết bị in dữ liệu. 1.5.5.1. Bình đựng dung môi Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp, cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100%. Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa là 3 hoặc 2 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định . Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải gradient dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn. Trang 13 Lưu ý: Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích. Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích và phải lọc qua hệ thống lọc 0,2 – 0,45 µm nhằm mục đích tránh làm hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các peak tạp trong quá trình phân tích. 1.5.5.2. Bộ phận khử khí Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra: - Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đổi. - Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi (bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động. Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai. 1.5.5.3. Bơm cao áp Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 3000 - 6000 PSI hoặc 250 - 500 atm (1atm = 0,98 bar) và bơm phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 ml/phút. Hiện nay đã có nhiều loại pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar. Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar. Tốc độ dòng 0,1- 9,999 ml/phút. Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt. Hiện tại bơm có 2 pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục. 1.5.5.4. Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với dung tích của loop là 5 – 100 l. Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng syringe) và tiêm mẫu tự động (auto sampler). Trang 14 1.5.5.5. Cột sắc ký Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 – 30 cm, đường kính trong 1- 10 mm, hạt chất nhồi cỡ = 5 - 10 m. Ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt … Với chất nhồi cột cỡ = 1,8 - 5 m có thể dùng cột ngắn 3 - 10 cm và nhỏ (đường kính trong 1 - 4,6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao. Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký (trong các dược điển USP 23, 24 có tiêu chuẩn hóa các lọai cột). Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường) hoặc là silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion. * Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong thiết bị điều nhiệt. Lưu ý: tuyệt đối không đánh siêu âm vì sẽ làm hư cột. 1.5.5.6. Đầu dò Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích. A = k.C Trong đó: (1.6) A là tín hiệu đo được C Nồng độ chất phân tích k là hằng số thực nghiệm của detector đã chọn Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang; cường độ phát xạ; cường độ điện thế; độ dẫn điện; độ dẫn nhiệt; chiết suất … Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai detector sau: + Detector quang phổ tử ngoại từ 200 đến 380 nm. + Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV/Vis): từ 190 đến 900 nm. + Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang. Đây là loại detector có độ chọn lọc cao nhất. Trang 15 + Loại hiện đại hơn có detector Diod Array, ELSD (detector tán xạ bay hơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất . Ngoài ra còn có một số loại detector khác là: + Detector điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng…. + Detector chiết suất vi sai: detector khúc xạ. + Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt. 1.5.5.7. Bộ phận ghi tín hiệu Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. + Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của peak, chiều cao…. + Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, hệ số phân giải... trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD…. 1.5.5.8. Thiết bị in dữ liệu Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ. 1.5.6. Phương pháp chọn điều kiện sắc ký Muốn có một kết quả tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu, các điều kiện đó bao gồm: Pha tĩnh: - Loại pha tĩnh. - Kích thước cột. Pha động: - Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ… nếu là chương trình rửa giải isocratic. -Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình dung môi… nếu là chương trình rửa giải gradient. 1.5.6.1. Lựa chọn pha tĩnh Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích; ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thường, cột pha đảo hay các loại cột khác nhau…. Trang 16 Thông thường ngành ta dùng 2 loại cột pha thường (NP) và cột pha đảo (RP). Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khác như cột cyanopropyl, cột aminopropyl, cột diol.... Cột pha thường (NP): silicagel trung tính Pha tĩnh: loại cột này dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực. Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm – OH phân cực ưa nước. Pha động : dùng cho loại này là các dung môi không phân cực hay ít phân cực như: methanol, benzen, acetonitril, chlorofom … Cột pha đảo (RP): silicagel đã alkyl hóa Pha tĩnh: loại cột này dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo cặp ion. Trên bề mặt hoạt động các nhóm – OH đã bị alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch carbon thẳng (C 8 hay C 18 tương đương RP-8 hay RP-18) hay các mạch carbon vòng (phenyl- tương đương cột phenyl). Vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít. Pha động : Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực như: methanol, acetonitril, nước hay các loại dung dịch đệm, hỗn hợp của các dung môi - đệm. Sự tách của chất nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và nó được ứng dụng chủ yếu trong phân tích dược phẩm. Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu. Hiện nay pha tĩnh trên nền silicagel đã có hàng trăm chất khác nhau tùy thuộc vào nhóm thế của nguyên tử H, ngoài ra còn có các lọai pha tĩnh trên nền oxid nhôm, trên nền chất hữu cơ cao phân tử, trên nền mạch carbon …. 1.5.6.2. Lựa chọn pha động Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích; ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi, hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị. Pha động có thể làm thay đổi: + Độ chọn lọc α. + Thời gian lưu. + Hiệu năng tách của cột. + Độ phân giải. + Tính đối xứng của peak. Trang 17 Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích. Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau: + Pha động phải trơ với pha tĩnh. Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học ( ví dụ giá trị pH: 2,5 < pH < 8,5). + Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột. Ví dụ: đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên cột. + Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu. + Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích. + Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký. + Phải phù hợp với loại detector: detector UV/Vis thì dung môi không được hấp thụ quang (ví dụ: acid acetic hấp thụ ở bước sóng thấp < 220 nm). Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang. + Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt. Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC), pha động là dung môi phân cực: nước, ACN, MeOH, acid hay base hữu cơ và một vài amin hay aminoacid … + Ngoài các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều trường hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm để ổn định pH. Chất tạo phức, tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất. + Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa giải E của dung môi theo bảng sau: Bảng 1.1 Lực rửa giải của một số dung môi Dung môi Lực rửa giải E n-Hexan 0,1 Tetra chloro carbon 1,6 Toluen 2,4 Methanol 5,11 Acetonitril 5,8 Nước cất H 2 O 10,20 Trang 18