Tài liệu Xác định các gen alen đặc thù liên quan đến sự phát triển bộ rễ của các giống lúa việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÙNG THỊ PHƯƠNG NHUNG XÁC ĐỊNH CÁC GEN - ALEN ĐẶC THÙ LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG LÚA VIỆT NAM LU N ỄN TI N Sƾ NHÀ XU T B N H C VI N NỌNG NGHI P - 2019 H C VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÙNG TH PH NG NHUNG XÁC ĐỊNH CÁC GEN - ALEN ĐẶC THÙ LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG LÚA VIỆT NAM Chuyên ngành: Mã số: Di truyền và Chọn giống cây trồng 9 62 01 11 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Đỗ Năng Vịnh GS.TS. Pascal Gantet NHÀ XU T B N H C VI N NỌNG NGHI P - 2019 L I CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đơy lƠ công trình nghiên c u c a tôi, các kết qu nghiên c u đ ợc trình bƠy trong luận án lƠ trung thực, khách quan vƠ ch a từng đ ợc sử dụng để b o v b t kỳ h c v nƠo. Tôi xin cam đoan rằng m i sự giúp đỡ cho vi c thực hi n luận án đƣ đ ợc cám n, các thông tin trích dẫn trong luận án nƠy đều đ ợc ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày... tháng ... năm 2019 Tác gi lu n án Phùng Th Ph i ng Nhung L IC M N Tác gi luận án xin trơn tr ng c m n: H c Vi n Nông nghi p Vi t Nam, Ban Qu n lý đƠo t o, Khoa Nông h c, Bộ môn Di truyền vƠ Ch n giống cơy trồng, Phòng thí nghi m tr ng điểm Công ngh tế bƠo thực vật, Phòng thí nghi m liên kết Vi t – Pháp (LMI – Rice) – Vi n Di truyền Nông nghi p, Trung tơm TƠi nguyên di truyền thực vật (PRC- Vi t Nam), Trung tơm Hợp tác quốc tế nghiên c u vƠ Phát triển nông nghi p bền vững (CIRAD - Pháp), đƣ t o điều ki n thuận lợi cho tôi hoƠn thƠnh luận án nƠy. Tôi xin c m n Ch ng trình h c bổng GRiSP – IRRI, Trung tơm Hợp tác quốc tế nghiên c u vƠ Phát triển nông nghi p bền vững (CIRAD - Pháp),Vi n Nghiên c u vì sự Phát triển (IRD – Pháp), đề tƠi "Nghiên c u ch c năng gen quy đ nh phát triển bộ r lúa, phục vụ ch n t o giống lúa ch u h n bằng công ngh gen” thuộc "Ch ng trình tr ng điểm phát triển vƠ ng dụng công ngh sinh h c trong lĩnh vực Nông nghi p vƠ PTNT đến năm 2020” - Bộ Nông nghi p vƠ Phát triển nông thôn Vi t Nam, đƣ tƠi trợ kinh phí cho các phần nghiên c u c a tôi. Đặc bi t tôi xin bƠy tỏ lòng biết n sơu sắc tới GS.TS. Đỗ Năng V nh, GS.TS. Pascal Gantet, TS. Brigitte Courtois đƣ trực tiếp h ớng dẫn vƠ giúp đỡ tận tình trong quá trình h c tập, nghiên c u để tôi hoƠn thƠnh luận án nƠy. Tôi xin chơn thƠnh c m n: Các thầy cô, đồng nghi p đƣ quan tơm, giúp đỡ, động viên vƠ đóng góp nhiều ý kiến cho vi c hoƠn thƠnh luận án nƠy; Các cộng tác viên, kỹ thuật viên, t i Phòng thí nghi m tr ng điểm Công ngh tế bƠo thực vật, Phòng thí nghi m liên kết Vi t- Pháp, Vi n Di truyền Nông nghi p; Bộ môn Qu n lý Ngơn hƠng gen- Trung tơm TƠi nguyên di truyền thực vật; Phòng Nghiên c u Di truyền – CIRAD – Pháp, đƣ giúp đỡ tôi trong quá trình lƠm thí nghi m vƠ hoƠn thƠnh luận án nƠy; Các thƠnh viên trong gia đình, b n bè đƣ t o điều ki n vƠ động viên tôi trong suốt quá trình thực hi n luận án nƠy. Xin trơn tr ng c m n! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác gi lu n án Phùng Th Ph ii ng Nhung M CL C L i cam đoan .................................................................................................................... i L i c m n ....................................................................................................................... ii Mục lục ........................................................................................................................... iii Danh mục chữ viết tắt ..................................................................................................... vi Danh mục b ng ............................................................................................................... ix Danh mục hình ..................................................................................................................x Trích yếu luận án ........................................................................................................... xii Thesis abstract............................................................................................................... xiv Ph n 1. M đ u ...............................................................................................................1 1.1. Tính c p thiết c a đề tƠi ........................................................................................1 1.2. Mục tiêu nghiên c u c a đề tƠi .............................................................................3 1.3. Ph m vi nghiên c u ..............................................................................................3 1.4. Những đóng góp mới c a đề tƠi ............................................................................4 1.5. Ý nghĩa khoa h c vƠ thực ti n c a đề tƠi ..............................................................5 Ph n 2. T ng quan tƠi li u .............................................................................................6 2.1. Vai trò vƠ đặc điểm bộ r 2.1.1. Vai trò c a bộ r lúa .............................................................................6 cơy lúa ....................................................................................6 2.1.2. Đặc điểm c u trúc c a bộ r lúa ............................................................................7 2.1.3. Đặc điểm phát triển c a bộ r lúa .......................................................................10 2.2. QTLs vƠ Gen liên quan đến sự phát triển bộ r lúa ............................................12 2.2.1. Các QTLs liên quan đến sự phát triển bộ r lúa .................................................12 2.2.2. Các gen liên quan đến sự hình thƠnh vƠ phát triển bộ r lúa ..............................16 2.3. Nguyên lý vƠ ng dụng c a GBS .......................................................................24 2.3.1. Ph ng pháp gi i trình tự NGS – nền t ng c a GBS .........................................24 2.3.2. Nguyên lý c a ph ng pháp GBS ......................................................................28 2.3.3. Các ng dụng c a GBS trong ch n giống cơy trồng ..........................................33 2.4. Nguyên lý vƠ ng dụng c a GWAS ...................................................................35 2.4.1. Nguyên lý ............................................................................................................35 2.4.2. GWAS lƠ một công cụ mới hữu hi u..................................................................36 2.4.3. Các b ớc xơy dựng một nghiên c u GWAS ......................................................38 2.4.4. Ý nghĩa vƠ tiềm năng c a GWAS trong ch n t o giống lúa...............................42 iii 2.5. Nguồn gen lúa vƠ tình hình nghiên c u r lúa Vi t Nam ................................44 2.5.1. Nguồn gen lúa Vi t Nam ....................................................................................44 2.5.2. Tình hình nghiên c u đặc điểm bộ r lúa Ph n 3. V t li u vƠ ph Vi t Nam........................................45 ng pháp nghiên c u ............................................................48 3.1. Đ a điểm nghiên c u ...........................................................................................48 3.2. Th i gian nghiên c u ..........................................................................................48 3.3. Vật li u nghiên c u .............................................................................................49 3.4. Nội dung nghiên c u ...........................................................................................49 3.5. Ph ng pháp nghiên c u ....................................................................................51 3.5.1. Chiết tách ADN tổng số ......................................................................................51 3.5.2. Phơn tích đa d ng di truyền bằng ch th DArT ..................................................51 3.5.3. Phơn tích kiểu gen thông qua gi i trình tự (GBS) ...............................................54 3.5.4. Phơn tích c u trúc di truyền c a tập đoƠn mẫu giống nghiên c u ......................54 3.5.5. Xác đ nh m c độ phơn rƣ c a LD (Linkage Disequilibrium) .............................55 3.5.6. Đánh giá đặc điểm nông sinh h c .......................................................................56 3.5.7. Ph ng pháp đánh giá kiểu hình bộ r ...............................................................57 3.5.8. Lập b n đồ liên kết (GWAS) ..............................................................................60 3.5.9. Ph ng pháp xác đ nh các gen ng viên ............................................................61 Ph n 4. K t qu vƠ th o lu n .......................................................................................62 4.1. Đặc điểm c a bộ s u tập giống lúa .....................................................................62 4.1.1. Đặc điểm thu đ ợc qua thông tin hồ s mẫu giống ............................................62 4.1.2. Đặc điểm nông sinh h c c b n ..........................................................................63 4.2. Kết qu phơn tích đa d ng di truyền với ch th DArT .......................................68 4.2.1. Kết qu phơn tích đa hình vƠ c u trúc di truyền ......................................................68 4.2.2. Xơy dựng cơy phơn lo i cho các giống lúa nghiên c u ......................................69 4.3. Kết qu phơn tích kiểu gen thông qua gi i trình tự (GBS –Genotyping by sequencing) .........................................................................................................72 4.3.1. Kết qu phơn tích đa hình vƠ c u trúc di truyền với SNPs marker .....................72 4.3.2. Đặc điểm c a các mẫu giống lúa trong các phơn nhóm khác nhau ....................75 4.3.3. Kết qu phơn tích Linkage Disequilibrium (LD) ................................................82 4.4. Kết qu đánh giá kiểu hình các tính tr ng liên quan đến sự phát triển bộ r các mẫu giống nghiên c u ...............................................................................86 iv 4.4.1. Kết qu phơn tích ph ng sai vƠ các thống kê c b n ........................................86 4.4.2. Kết qu phơn tích thƠnh phần chính....................................................................98 4.5. Kết qu phơn tích liên kết toƠn h Gen (GWAS) .............................................101 4.5.1. Các QTLs liên kết với tính tr ng liên quan đến sự phát triển bộ r ..................101 4.5.2. Các gen ng viên liên quan đến đặc điểm phát triển bộ r ...............................114 4.5.3. Điểm đặc bi t c a vùng QTLs liên kết với NCR trên NST số 11 ....................120 Ph n 5. K t lu n vƠ ki n ngh ....................................................................................131 5.1. Kết luận .............................................................................................................131 5.2. Kiến ngh ...........................................................................................................132 Danh sách các công trình liên quan đến luận án ...........................................................133 TƠi li u tham kh o ........................................................................................................134 Phụ lục ..........................................................................................................................158 v DANH M C CH VI T T T Ch vi t t t ADN Ch vi t đ y đ Deoxyribonucleic acid Ti ng Vi t Axit deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Đa hình độ dƠi các đo n nhơn Polymorphism b n ch n l c ANOVA Analysis of Variance Phơn tích ph bp Base pair 1bp = 1cặp nucleotide CH Central Highlands Vùng Tơy Nguyên Chr Chromosome Nhi m sắc thể cM Centimorgan Xen-ti-mooc-gan CRL1 Crown Root Less 1 Đột biến gơy m t r b t đ nh ng sai lúa Discriminant Analysis of Principal Phơn tích phơn bi t thƠnh phần Components chính DArT Driversity Array Technology Công ngh đa d ng m ng DEPTH Deepest point reached by root Độ ăn sơu c a r DRP Deep Root Propotion Phần trăm khối l ợng khô c a DAPC phần r ăn sơu DRW Deep Root Weight Khối l ợng khô phần r ăn sơu DW0020 Dry Weight of root part in the 00- Khối l ợng khô c a phần r từ 20 cm 0 đến 20 cm Dry Weight of root part in the 20- Khối l ợng khô c a phần r từ 40 cm 20 đến 40 cm Dry Weight of root part in the 40- Khối l ợng khô c a phần r từ 60 cm 40 đến 60 cm Dry Weight of root part Below 60 Khối l ợng khô c a phần r dƠi cm h n 60 cm DW2040 DW4060 DWB60 FYPP Phytochrome associated serine/threonine proteinphosphates GA20oX Gibberelic acid 20 oxidase GBS Genotyping By Sequencing vi Phơn tích kiểu gen thông qua gi i trình tự GLM General Linear Model Mô hình hồi quy tuyến tính GWAS Genome-wide Association Studies Nghiên c u lập b n đồ liên kết toƠn h gen IAA Auxin/ indole -3- acetic acid Auxin IR Irrigated Canh tác ch động t ới tiêu kb Kilo base pair 1kb =1000 bp LBD Lateral organ boundary domain LD Linkage Disequilibrium Sự m t cơn bằng liên kết LLGTH Longest Leaf Length Chiều dƠi thơn MAF Minor Allele Frequence Alen có tần số nhỏ h n Mb Megabase pair 1Mb = 1000 kb MIF Mini Zinc Finger MLM Mix Linear Model Mô hình hồi quy tuyến tính hỗn hợp Đồng bằng sông Cửu Long MRD Mekong River Delta MRH Morphogenesis of Root Hair MRL Maximum of Root Length Chiều dƠi r tối đa NCC North Central Coast Duyên h i Bắc Trung Bộ NCR Number of Crown Root Số l ợng r b t đ nh NE Northeast Vùng Đông Bắc Bộ NGS Next Generation Sequencing Công ngh gi i trình tự thế h tiếp theo NILs Near Isogenic Lines Dòng đẳng gen NR_T Number of crown roor per Tiller Số r b t đ nh trung bình/nhánh NW Northwest Vùng Tơy Bắc Bộ PCA Principal Component Analysis Phơn tích thƠnh phần chính PCR Polymerase Chain Reaction Kỹ thuật nhơn b n ADN PDW Plant Dry Weight Khối l ợng khô c a cơy PHP Hypertext Preprocesser PIC Polymorphism Information Content vii HƠm l ợng thông tin đa hình PIN Pin- formed PIP Plasma membrane Intrinsic Protein PLAT Polycystin-1, Lipoxygenase, Alpha-toxin and Triacylglycerol QHB Quiescent Center homobox QTLs Quantitative Trait Loci Locus tính tr ng số l ợng R_S Root – Shoot ratio Tỷ l khối l ợng khô giữa phần r vƠ phần thơn cơy Radnom Amplified Polymophism Đa hình các đo n ADN đ ợc DNA nhơn b n ngẫu nhiên RDW Root Dry Weight Khối l ợng khô c a phần r RFLP Restriction Fragment Length Đa hình độ dƠi các đo n cắt giới Polymorphism h n RAPD RID Root Initiation Defective RILs Recombinant Inbred Lines Dòng tái tổ hợp RL Rainfed Lowland Canh tác n ớc tr i RR Response Regulator Yếu tố điểu ch nh ph n ng RRD Red River Delta Đồng bằng chơu thổ sông Hồng SCC South Central Coast Duyên h i Nam Trung Bộ SCR Scarecrow SDW Shoot Dry Weight Khối l ợng khô phần thơn cơy SE Southeast Vùng Đông Nam Bộ SHR Short Root SNP Single Nucleotide Polymorphism SNX Sorting nexin SRP Shallow Root Propotion vùng th p Đa hình nucleotide đ n Phần trăm khối l ợng khô c a phần r ăn nông SSR Simple Sequence Repeats Đa hình các đo n lặp đ n gi n THK Root Thickness Độ dƠy c a r TIL Number of Tiller Số nhánh UP Upland Canh tác n WOX WUCHEL-related viii ng rẫy DANH M C B NG Tên b ng TT Trang 3.1. Các giống lúa đ ợc dùng để xơy dựng th vi n DArT markers .........................53 4.1. Phơn nhóm mẫu giống theo th i gian sinh tr 4.2. Phơn nhóm mẫu giống theo số nhánh hữu hi u ..................................................65 4.3. Đặc điểm hình d ng h t c a các mẫu giống lúa Vi t Nam trong bộ s u tập ng ..............................................64 giống nghiên c u ................................................................................................67 4.4. Ch số FST giữa các nhóm phụ vƠ m c ý nghĩa P-value ......................................75 4.5. Đặc điểm c a các phơn nhóm trong hai nhóm giống thuộc loƠi phụ indica vƠ japonica ..........................................................................................................81 4.6. Sự phơn rƣ c a LD trên 12 nhi m sắc thể trong nhóm giống indica vƠ japonica ..............................................................................................................83 4.7. Kết qu phơn tích ANOVA vƠ h số di truyền theo nghĩa rộng c a các tính tr ng nghiên c u .................................................................................................87 4.8. Các giá tr thống kê c b n c a các tính tr ng liên quan đến đặc điểm phát triển bộ r 4.9. các mẫu giống nghiên c u ..............................................................88 Giá tr thống kê c b n c a các tính tr ng nghiên c u theo 2 nhóm giống indica (ind) vƠ japonica (jap) .............................................................................91 4.10. So sánh giá tr trung bình c a các tính tr ng giữa các phơn nhóm thuộc nhóm giống indica vƠ japonica ..........................................................................94 4.11. H số t ng quan giữa các tính tr ng theo dõi c tập đoƠn vƠ riêng cho từng nhóm giống indica vƠ japonica ..................................................................95 4.12. Danh sách các QTLs đƣ xác đ nh đ ợc với P-value < 1E-04 c tập đoƠn vƠ hai nhóm giống indica vƠ japonica ..............................................................103 4.13. Các QTLs liên kết với nhiều h n một tính tr ng nghiên c u c tập đoƠn vƠ hai nhóm mẫu giống thuộc loƠi phụ indica vƠ japonica ..............................112 4.14. Danh sách các gen ng viên đƣ đ ợc khẳng đ nh về vai trò vƠ ch c năng đối với sự phát triển bộ r .................................................................................116 4.15. Các giống lúa có kiểu hình t ng ph n vƠ haplotype khác bi t t i vùng QTLs liên kết chặt với tính tr ng NCR trên NST số 11 ...................................123 4.16. Danh sách các gen nằm trong vùng QTLs liên kết chặt với tính tr ng NCR trên NST số 11 ..................................................................................................127 ix DANH M C HỊNH Tên hình TT Trang 2.1. ThƠnh phần r c u trúc nên bộ r lúa ....................................................................8 2.2. C u trúc xuyên tơm c a r lúa ..............................................................................9 2.3. Tổ ch c mô theo chiều d c vƠ mô hình phơn chia tế bƠo 2.4. Số l ợng QTLs liên kết với đặc điểm bộ r r lúa ......................10 lúa trên các vùng nhi m sắc thể .................................................................................................................14 2.5. Các b ớc gi i trình tự theo ph ng pháp Sanger (a) vƠ NGS (b) ......................27 2.6. Các b ớc chính trong quá trình thực hi n GBS ..................................................29 2.7. So sánh ph 3.1. S đồ tổng quát quá trình thực hi n các nội dung nghiên c u............................50 3.2. S đồ các b ớc thực hi n phơn tích đa d ng di truyền với DArT ......................52 3.3. Các ch tiêu vƠ v trí thu thập số li u các tính tr ng liên quan đến sự phát ng pháp xác đ nh QTLs truyền thống vƠ GWAS ..........................35 triển bộ r c a các giống nghiên c u ..................................................................59 4.1. Đặc điểm phơn bố c a 214 mẫu giống lúa Vi t Nam sử dụng lƠm vật li u nghiên c u...........................................................................................................63 4.2. Biểu đồ tần số phơn bố mẫu giống lúa theo chiều cao cơy .................................66 4.3. Tỷ l vƠ số l ợng các mẫu giống chia theo tính ch t nội nhũ ............................67 4.4. ThƠnh phần genome c a các mẫu giống nghiên c u ..........................................69 4.5. Cơy phơn lo i di truyền c a 270 mẫu giống với 241 DArT marker ...................70 4.6. Phơn bố c a GBS marker trên 12 nhi m sắc thể vƠ ch số đa hình (PIC) c a chúng trong ma trận haplotype chuẩn b cho GWAS...................................73 4.7. Các phơn nhóm trong nhóm mẫu giống thuộc loƠi phụ indica ...........................77 4.8. Các phơn nhóm trong nhóm mẫu giống thuộc loƠi phụ japonica .......................80 4.9. Sự phơn rƣ LD theo kho ng cách vật lý giữa các cặp marker trên 12 NST nhóm giống indica ..............................................................................................84 4.10. Sự phơn rƣ LD theo kho ng cách vật lý giữa các cặp marker trên 12 NST nhóm giống japonica ..........................................................................................85 4.11. Hình nh biểu di n mối t ng quan giữa thơn vƠ r c a các mẫu giống trong tập đoƠn sử dụng phần mềm RASTA ........................................................89 4.12. Tần số phơn bố c a một số tính tr ng nghiên c u trong hai nhóm loƠi phụ indica vƠ japonica ...............................................................................................93 x 4.13. Vòng tròn t ng quan xơy dựng bằng phơn tích thƠnh phần chính (PCA) cho các tính tr ng nghiên c u .............................................................................99 4.14. Phơn bố c a các giống lúa trong tập đoƠn nghiên c u trên mặt phẳng PCA dựa trên dữ li u kiểu hình c a các tính tr ng nghiên c u .................................100 4.15. Hình biểu di n QQ-Plot cho c tập đoƠn vƠ hai nhóm giống thuộc loƠi phụ indica vƠ japonica .............................................................................................102 4.16. Manhattan Plot c a tính tr ng số l ợng r (NCR) c tập đoƠn vƠ hai nhóm mẫu giống thuộc loƠi phụ indica vƠ japonica .........................................108 4.17. Manhattan Plot c a tính tr ng độ dƠy r (THK) c tập đoƠn vƠ hai nhóm mẫu giống thuộc loƠi phụ indica vƠ japonica ...................................................109 4.18. Tỷ l các d ng alen các v trí đánh d u xung quanh q45 ...............................122 xi TRệCH Y U LU N ỄN Tên Tác gi : Phùng Th Ph ng Nhung Tên Lu n án: “Xác đ nh các gen-alen đặc thù liên quan đến sự phát triển bộ r c a các giống lúa Vi t Nam” Chuyên ngƠnh: Di truyền vƠ Ch n giống cơy trồng Mƣ s : 9 62 01 11 Tên c s đƠo t o: H c vi n Nông nghi p Vi t Nam M c đích vƠ đ i t ng nghiên c u c a lu n án Mục đích nghiên cứu - Lựa ch n các mẫu giống phù hợp để phát triển bộ dữ li u kiểu gen vƠ dữ li u kiểu hình phục vụ cho các nghiên c u GWAS thông qua hh o sát sự đa d ng về đặc điểm nông sinh h c c b n vƠ di truyền c a một tập đoƠn các mẫu giống lúa Vi t Nam,. - Xơy dựng bộ dữ li u kiểu gen (haplotype) vƠ kiểu hình c a các tính tr ng chính liên quan đến sự phát triển bộ r c a các mẫu giống đ ợc ch n, lƠm c s cho nghiên c u GWAS. - Sử dụng ph ng pháp GWAS để lập b n đồ liên kết toƠn h gen, từ đó xác đ nh các QTLs vƠ các gen ng viên liên quan đến sự phát triển bộ r c a một tập đoƠn giống lúa Vi t Nam. Đối t ợng nghiên cứu Đề tƠi đƣ khai thác sự đa d ng di truyền c a lúa Vi t Nam từ đó xác đ nh các QTLs/ gen ng viên liên quan đến sự phát triển bộ r bằng ph ng pháp lập b n đồ liên kết toƠn h gen (GWAS – Genome wide Association Studies). Ph ng pháp nghiên c u - Các nội dung c a đề tƠi đƣ sử dụng nhiều ph ng pháp nghiên c u mới trong phơn tích đa d ng di truyền vƠ phơn tích h gen nh : ph ng pháp phơn tích đa d ng với ch th DArT, ph ng pháp phơn tích kiểu gen thông qua gi i trình tự (GBS), ph ng pháp lập b n đồ liên kết toƠn h gen (GWAS). Các thí nghi m đánh giá đặc điểm nông sinh h c c b n sử dụng ph ng pháp chuẩn c a IRRI (2002). Thí nghi m đánh giá kiểu hình bộ r sử dụng ph ng pháp ống r c i tiến, cơy lúa 6 tuần tuổi. - Các phần mềm đ ợc sử dụng trong nghiên c u gồm: DArTsoft 7.4, DArWin 5, STRUCTURE; BEAGLE; TASSEL; R; RASTA; vƠ các phần mền hỗ trợ phơn tích thống kê SAS 9.2; R; XLstat, Excel. K t qu chính vƠ k t lu n Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Đề tƠi đƣ khám phá ra các QTLs/ gen ng viên liên kết với các tính tr ng chính đóng vai trò quan tr ng trong sự phát triển bộ r một tập đoƠn nguồn gen lúa Vi t Nam. Kết qu nƠy lƠ c s thúc đẩy các nghiên c u tiếp theo nhằm lƠm rõ m ng l ới xii các gen liên quan đến quá trình điều khiển sự phát sinh, phát triển bộ r lúa. H n nữa, sự thƠnh công c a nghiên c u nƠy cho th y kh năng kết hợp hi u qu các kỹ thuật phơn tích h gen hi n đ i trong phơn tích h gen cơy trồng, góp phần thúc đẩy sự hiểu biết các yếu tố di truyền liên quan đến các tính tr ng quan tơm, đặc bi t có ý nghĩa cho c i tiến giống cơy trồng, nh t lƠ trong bối c nh nh h ng sơu sắc vƠ ph c t p c a BĐKH. - Các kết qu trung gian c a đề tƠi nh : thông tin về đặc điểm nông sinh h c c b n, đặc điểm đa d ng di truyền vƠ c u trúc quần thể, đặc điểm phát triển bộ r r t đa d ng c a các mẫu giống nghiên c u, lƠ các c s dữ li u có tính tham kh o cao trong các ch ng trình ch n t o giống lúa Vi t Nam, đặc bi t lƠ các ch ng trình ch n t o c i tiến bộ r lúa. Mặt khác bộ dữ li u đa hình kiểu gen với 25971 SNPs phơn bố trong toƠn h gen đƣ đ ợc công bố có thể đ ợc tiếp tục sử dụng để phát triển các nghiên c u GWAS liên quan đến các tính tr ng nông sinh h c quan tr ng khác. Kết luận 1) Đề tƠi đƣ đánh giá đ ợc sự đa d ng về đặc điểm hình thái vƠ đặc điểm nông sinh h c c b n c a 270 mẫu giống lúa, trong đó có 214 mẫu giống lúa Vi t Nam. Đồng th i đánh giá đ ợc sự đa d ng di truyền c a các mẫu giống lúa trên thông qua sử dụng 241 ch th DArT. Từ kết qu đó xơy dựng đ ợc cơy phơn lo i di truyền có c u trúc l ỡng cực, phơn các mẫu giống nghiên c u thƠnh các nhóm loƠi phụ khác nhau. 2) Kết qu về phơn tích kiểu gen thông qua gi i trình tự (GBS) đƣ xơy dựng đ ợc bộ dữ li u haplotype với 25971 ch th cho đa hình cao, hƠm l ợng thông tin đa hình (PIC) trung bình đ t 32,0%. Sử dụng số l ợng lớn các ch th SNPs trong bộ dữ li u nƠy để phơn tích c u trúc vƠ đa d ng di truyền c a nhóm giống indica, japonica Vi t Nam cho th y 114 mẫu giống lúa indica Vi t Nam đ ợc phơn thƠnh 6 phơn nhóm từ I1 đến I6, 62 mẫu giống japonica Vi t Nam đ ợc phơn thƠnh 4 phơn nhóm từ J1 đến J4 với những đặc điểm đặc tr ng riêng. 3) Kết qu đánh giá kiểu hình bộ r đƣ xơy dựng đ ợc bộ dữ li u kiểu hình r gồm 18 tính tr ng c a 194 mẫu giống lúa. Các mẫu giống đa d ng về đặc điểm hình thái vƠ c u trúc bộ r , đặc bi t lƠ các tính tr ng số l ợng r , độ dƠy r , khối l ợng khô c a r các tầng đ t khác nhau, độ dƠi r . Đặc bi t đƣ xác đ nh đ ợc một số giống lúa có bộ r dƠi vƠ dƠy thuộc phơn nhóm I3 có ý nghĩa trong ch n giống nh : Blề Blậu Chớ (G205), Tẻ n ng (G153), Khẩu Năm Rinh (G189), Khẩu Pe L nh (G155). 4) Sử dụng ph ng pháp GWAS để lập b n đồ liên kết toƠn h gen, nghiên c u đƣ cung c p một danh sách gồm 88 QTLs liên kết với 18 tính tr ng nghiên c u, trong đó có 28 QTLs đồng th i liên kết với nhiều h n một tính tr ng, 33 QTLs nằm trong vùng trình tự c a gen ch c năng, 1 vùng QTLs liên kết chặt với tính tr ng số l ợng r (NCR) trên NST số 11, vƠ 1 vùng QTLs liên kết chặt với độ dƠy r (THK) trên NST số 2. Căn c v trí c a QTLs, xác đ nh đ ợc 889 gen ng viên, trong đó có 407 gen đƣ đ ợc xác đ nh vƠ phơn nhóm ch c năng gi đ nh, 24 gen trong số nƠy đƣ có các công bố ch ng minh ch c năng hóa sinh vƠ sinh h c liên quan đến sự phát triển bộ r . xiii THESIS ABSTRACT PhD. Candidate: Phung Thi Phuong Nhung Thesis title: Identification of new genes and alleles associated with root development in a core collection of rice varieties in Vietnam Major: Genetic and Plant breeding Code: 9.62.01.11 Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives The development of Genome-wide Association studies (GWAS) in crops has made it possible to mine interesting alleles hidden in gene bank resources. However, only a small fraction of the rice genetic diversity of any given country have been exploited in the studies with worldwide sampling conducted to date. The thesis had been researched to development of a panel of rice varieties from Vietnam for GWAS purposes to identify some new QTLs and candidate genes associated with root development. Materials and Methods The panel, initially composed of 270 accessions, was characterized for simple agronomic traits (maturity class, grain shape and endosperm type) commonly used to classify rice varieties. We first genotyped the panel using Diversity Array Technology (DArT) markers (6144 clones). We analyzed the panel structure, identified two subpanels corresponding to the indica and japonica sub-species and selected around 200 non-redundant accessions for Genotyping By Sequencing (GBS) (with 50000 marker). A matrix adapted for GWAS was built by eliminating the markers with a minor allele frequency below 5% and imputing the missing data. The panel of 200 rice varieties was phenotyped under greenhouse conditions for several root traits in an experimental design with 3 replicates. The results were submitted to association mapping using a mixed model involving structure and kinship to enable the identification of significant associations. The analyses were conducted successively on the whole panel (185 accession) and on its indica (115 accessions) and japonica (64 accessions) subpanel. Main findings and Conclusions Scientific and practical significance The publicly available panel constitutes an imprortant resource giving access to original allelic diversity. It will be use for GWAS on root, panicle traits, grain and yield traits, or abiotic stress adaption. Some of the major QTLs we detected through this Genome-wide Association Study contain promising candidate genes encoding regulatory elements of known key xiv regulators of root formation and development. In rice breeding, major QTLs and candidate SNPs, candidate genes associated with such agronomy traits, identified though GWAS in this thesis research (after confirmed by functional studies and validations), have been deployed to enhance adaption and productivity of rice in future. Conclusions 1) The rice varieties studied showed a strong diversity of basic agronomic traits such as tree height, flowering time, branching and effective branching, growth time, grain shape, endosperm characteristics. The 270 rice varieties exhibited genetic diversity with bipolar structure, mainly indica (168 germplasms), and japonica (88 germplasms), the remaining are Aus/Boros and Sadri/Basmati. 2) Results of GBS analysis produced a set of genetic data consisting of a polymorphic matrix of 25971 marker species with nearly 200 rice varieties in Vietnam, the PIC of these markers is 32% in average. Results of population structure analysis with SNP marker showed indica group was divided into 6 sub-populations (from I1 to I6) and japonica was divided into 4 sub-populations (from J1 to J4). Each group has its own unique characteristics of basic agronomic traits, ecological regions and source of collection. 3) The phenotypic assessment results provided a set of phenotypic data of 18 traits directly or indirectly related to rice root development in 194 rice varieties. The mean comparisons showed that subpopulations I3 and I6 in the indica subpanel and subpopulations J1 and J3 in the japonica subpanel had the deepest and thickest roots while subpopulations I1 and I4 as well as J2 and J4 registered the poorest performances in this respect. The indica types from group I3 constitute interesting donors of deep and thick root that may be used as parents in crosses in root breeding programes, example: Ble Blau Cho (G205), Te Nuong (G153), Khau Nam Rinh (G189), Khau Pe Lanh (G155). 4) Identified 88 QTLs at a high level for 18 traits. Identify two strong QTLs related to root numbers (NCR) on chromosome 11 and related to root thickness (THK) on chromosome 2. Based on the location of QTLs, in LD was calculated, 899 candidate genes were identified in the high confidence region of 88 QTLs, 33 QTLs in genes with predicted functions, 407 genes were identified function in hypothetical, 24 genes were identified whose reported biological function in consistent with the associated phenotype, the rice gene or its predicted Arabidopsis ortholog. xv PH N 1. M Đ U 1.1. TệNH C P THI T C A Đ TĨI Lúa (Oryza sativa L.) lƠ cơy l ng thực chính nuôi sống h n một nửa dơn số thế giới. Tổng di n tích gieo trồng c a lúa trên toƠn thế giới trong 10 năm gần đơy dao động trong kho ng 156 đến 161,7 tri u hecta (STATISTAT, 2018). Cơy lúa đ ợc gieo trồng nhiều quốc gia trên thế giới với nhiều h sinh thái khác nhau (t ới tiêu, n ớc tr i đồng bằng, ngập n ớc, n ng rẫy vùng cao). So với các cơy trồng khác, cơy lúa có nhu cầu n ớc lớn h n. Sự thích nghi với các chế độ th y văn khác nhau tr thƠnh một trong những đặc điểm c a giống tích lũy qua quá trình thuần hóa vƠ ch n l c tự nhiên. NgƠy nay, tr ớc những di n biến ph c t p khó kiểm soát c a Biến đổi khí hậu, các cơy trồng đặc bi t lƠ cơy lúa đang đ ng tr ớc nguy c b tổn h i nghiêm tr ng về năng su t vƠ s n l ợng do những nh h ng c a h n, mặn, vƠ ngập lụt kéo dƠi. Bộ r đóng vai trò quan tr ng trong đ i sống cơy lúa, giúp cơy bám vƠo đ t, hút n ớc, dinh d ỡng vƠ nhiều ho t động trao đổi ch t khác nh h ng trực tiếp đến kh năng sinh tr ng, phát triển, năng su t, đặc bi t lƠ khi cơy gặp các điều ki n ngo i c nh b t lợi. Một bộ r có kh năng ăn sơu, r dƠy vƠ kh năng phơn nhánh rộng có thể giúp cơy lúa khai thác đ ợc n ớc từ những lớp đ t sơu h n trong điều hi n h n hán (Fukai and Cooper, 1995; Gowda et al., 2011). Bộ r ho t động tốt h n trong điều ki n ngập n ớc sẽ giúp tăng kh năng chống ch u vƠ duy trì năng su t lúa trong điều ki n ngập lụt (Bailey-Serres and Voesenek, 2010). T o ra những giống lúa có kiểu hình bộ r phù hợp với mỗi điều ki n gieo trồng lƠ mục tiêu c a các nhƠ ch n t o giống lúa trong bối c nh di n biến ph c t p c a Biến đổi khí hậu toƠn cầu nh ng r t khó thực hi n vì những h n chế trong quan sát trực tiếp bộ r . Hiểu biết về các yếu tố di truyền có liên quan đến các đặc điểm phát triển vƠ thích nghi c a bộ r lƠ c s để phát triển vƠ ng dụng ph ng pháp ch n l c phơn tử trong các nghiên c u ch n t o, c i tiến bộ r lúa. Trong những năm gần đơy nghiên c u về r cơy trồng nói chung vƠ lúa nói riêng ngƠy cƠng đ ợc quan tơm. Nhiều ph ng pháp khác nhau đƣ đ ợc sử dụng để khám phá các yếu tố di truyền liên quan đến bộ r lúa, nh ph ng pháp gơy đột biến (Guiderdoni and Gantet 2012; Lorieux et al., 2012; Wei et al., 2013), ph ng pháp phơn tích s n phẩm phiên mƣ (transcriptomic) (Takehisa et al., 2012), ph ng pháp xác đ nh QTLs sử dụng các quần thể lập b n đồ (Champoux 1 et al., 1995; Kamoshita et al., 2008; Khowaja et al., 2009). Nhiều gen liên quan đến đặc điểm hình thái vƠ ch c năng sinh lý c a r đƣ đ ợc xác đ nh, m ra c hội để c i tiến năng su t lúa (Coudert et al., 2010; Orman-Ligeza et al., 2013; Mai et al., 2014; Wu and Cheng, 2014). HƠng trăm QTLs liên quan đến các tính tr ng bộ r lúa đƣ đ ợc công bố trên các quần thể lập b n đồ khác nhau (Courtois et al., 2009). Tuy nhiên, h n chế c b n c a các QTLs đ ợc thiết lập bằng các quần thể lập b n đồ lƠ độ dƠi c a đo n NST mang QTLs/gen ng viên có kích th ớc r t lớn (Courtois et al., 2009). Mặt khác, số l ợng alen đ ợc đánh giá trong mỗi nghiên c u xác đ nh QTLs sử dụng quần thể lập b n đồ r t h n chế, th i gian nghiên c u kéo dƠi (Buckler and Thornsberry, 2002). Ph ng pháp GWAS (Genome-wide Association Studies) xu t hi n lần đầu tiên trong một nghiên c u di truyền ng i (Hirschhorn and Daly, 2005) sau sự ki n gi i trình tự h gen ng i thƠnh công. GWAS nhanh chóng đ ợc đ a vƠo các nghiên c u thực vật, đặc bi t lƠ các cơy mô hình nh Arabidopsis (Atwell et al., 2010). B n ch t c a GWAS lƠ thiết lập mối quan h thống kê liên kết giữa sự dao động c a các tính tr ng đ nh l ợng ph c t p với các kiểu gen trong quần thể (Nordborg and Weigel, 2008). Bằng vi c sử dụng số l ợng ch th lớn, mật độ cao, bao ph toƠn h gen vƠ các quần thể tự nhiên có sự suy gi m liên kết m t cơn bằng một cách nhanh chóng, GWAS đƣ m nh mẽ c i tiến độ phơn gi i t i mỗi v trí QTLs xuống còn từ 1 đến vƠi chục kilo-base thay vì đ ợc tính bằng mega-base trong các nghiên c u tr ớc đó (Buckler and Thornsberry, 2002; Zhu et al., 2008). Những QTLs đầu tiên liên quan đến sự phát triển c a bộ r lúa đ ợc xác đ nh bằng ph ng pháp GWAS đƣ đ ợc công bố trên các t p chí uy tín (Clark et al., 2013; Courtois et al., 2013), cho th y tiềm năng ng dụng c a ph ng pháp nƠy trong nghiên c u di truyền các tính tr ng liên quan đến sự phát triển bộ r lúa. Sự tiến bộ vƠ ngƠy cƠng hoƠn thi n c a công ngh phơn tích genome thông l ợng cao, sự phát triển các h thống ph ng pháp luận vƠ phần mềm phơn tích, lƠ điều ki n thúc đẩy ngƠy cƠng nhiều các nhƠ khoa h c lựa ch n sử dụng GWAS trong các nghiên c u c a mình (Zhu et al., 2008). Các bộ dữ li u kiểu gen đ i di n cho sự đa d ng c a về đ a lý c a Oryza đƣ đ ợc xơy dựng (Tung et al., 2010; Courtois et al., 2013) vƠ đ ợc sử dụng trong GWAS với các tính tr ng r lúa (Famoso et al., 2011; Courtois et al., 2013). Mặc dù h đƣ sử dụng quần thể có kích th ớc khá lớn (từ 200 đến 400 mẫu giống), nh ng vẫn ch khai thác đ ợc 2 một phần nhỏ sự đa d ng c a lúa trên thế giới. Nền văn minh Vi t Nam gắn liền với cơy lúa n ớc. Các giống lúa đ a ph ng Vi t Nam khá đa d ng (ĐoƠn Thanh Quỳnh vƠ cs., 2016). Tuy ch a ph n ánh hết sự đa d ng c a lúa trên thế giới nh ng những nguồn gen đ a ph ng, đáng chú ý lƠ từ những vùng có điều ki n đ a lý, sinh thái khác nhau có thể mang các tính tr ng, các QTLs, các gen có ý nghĩa quyết đ nh trong các tính tr ng nông h c quan tr ng cần đ ợc khám phá, khai thác (Myint et al., 2012; Radanielina et al., 2013). Đơy lƠ nguồn tƠi nguyên quý giá để xác đ nh các yếu tố di truyền kiểm soát sự phát triển bộ r vƠ kh năng chống ch u với các stress phi sinh h c cơy lúa. Xác đ nh các QTLs/gen ng viên liên quan đến sự phát triển r các giống lúa Vi t Nam sẽ cung c p nền t ng quan tr ng để lƠm sáng tỏ c chế phơn tử về sự phát triển bộ r vƠ t o điều ki n để c i tiến kh năng chống ch u với các điều ki n ngo i c nh b t lợi lúa. 1.2. M C TIểU NGHIểN C U C A Đ TĨI - Lựa ch n các mẫu giống phù hợp để phát triển bộ dữ li u kiểu gen vƠ dữ li u kiểu hình phục vụ cho các nghiên c u GWAS thông qua hh o sát sự đa d ng về đặc điểm nông sinh h c c b n vƠ di truyền c a một tập đoƠn các mẫu giống lúa Vi t Nam. - Xơy dựng bộ dữ li u kiểu gen (haplotype) c a tập đoƠn mẫu giống đ ợc ch n, lƠm c s dữ li u để phát triển các nghiên c u GWAS với các tính tr ng quan tơm. - Xơy dựng bộ dữ li u kiểu hình c a một số tính tr ng chính liên quan đến sự phát triển bộ r c a các mẫu giống lúa đ ợc ch n, lƠm c s cho nghiên c u GWAS để xác đ nh các QTLs/gen ng viên liên quan đến sự phát triển bộ r c a lúa Vi t Nam. - Sử dụng ph ng pháp GWAS để lập b n đồ liên kết toƠn h gen, từ đó xác đ nh các QTLs vƠ gen ng viên liên quan đến sự phát triển bộ r c a các giống lúa Vi t Nam. 1.3. PH M VI NGHIểN C U - Nghiên c u đ ợc thực hi n trên c s một tập đoƠn gồm 214 mẫu giống lúa đ ợc thu thập từ nhiều vùng c a Vi t Nam, 33 mẫu giống lúa đối ch ng đ i di n cho đa d ng c a Oryza sativa trên thế giới do CIRAD cung c p vƠ 23 mẫu giống khác đ ợc cung c p b i Vi n Di truyền Nông nghi p. Các mẫu giống đƣ 3