Tài liệu Tuyển chọn chủng nấm men, tìm điều kiện tối ưu cho quá trình lên men vang táo mèo

1 LêI C¶M ¥N Trước khi trình bày đề tài nghiên cứu của mình, em xin được gửi đến cô giáo TS. Đinh Thị Kim Nhung lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất. Cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài này. Bằng tấm lòng thành kính, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh. KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khoá luận này. Một lần nữa em xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô cùng toàn thể các bạn. Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy cô để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! ĐHSPHN2, ngày 14 tháng 5 năm 2007 Sinh viên NguyÔn ThÞ Hång K29A – SINH Më §Çu A. Lý do chọn đề tài. Rượu là một trong những sản phẩm lên men đầu tiên của nhân loại, mặc dù ban đầu người ta không hề biết đến các vi sinh vật đã thực hiện quá trình chuyển hoá đường thành rượu. Trên các di vật lưu chữ được tìm thấy có các hình vẽ từ thời cổ Hy Lạp minh hoạ quá trình nấu rượu. Các hình vẽ trên Kim Tự Tháp cho thấy nghề nấu rượu đã hết sức phát triển ở vùng này. Riêng nghề làm rượu vang đã có trước khi con người phát hiện ra nấm men (thế kỉ XVII) và trước khi Louis Pasteur khám phá ra bản chất của quá trình lên men (1854 - 1864 ). Rượu vang đã trở thành một loại đồ uống được ưa thích ở hầu hết các nước trên thế giới. Người ta biết đến rượu vang như một sản phẩm lên men tự nhiên từ nước ép trái nho. Mỗi nước đều có sản phẩm vang nổi tiếng và đã trở thành thương hiệu cả thế giới biết đến như các loại vang của Pháp, Italia, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Mỹ, Hà Lan...với các loại rượu nổi tiếng như Brandy, Champagne, Sherry (Fino, Oloroso, Amontillado), Port, Medeira, Venmouth [15]. Ngày nay, với những hiểu biết về bản chất của quá trình lên men rượu và những hiểu biết về nấm men thì rượu vang còn được lên men từ các nguồn hoa quả khác. Việt nam và một số nước trên thế giới đã sản xuất được một số loại rượu vang từ các nguồn nguyên liệu như: Anh Đào, Mơ, Dâu, Vải Thiều...Thị trường vang trong nước và thế giới hiện nay hết sức phong phú. Tuy vậy, rượu vang ở Việt Nam được biết đến chưa nhiều và chưa có được sản phẩm đặc sắc nổi tiếng. Với tâm nguyện tạo cho Việt Nam một sản phẩm vang đặc trưng và nổi tiếng như các nước trên thế giới, chúng tôi đã tiến hành tìm kiếm nguồn nguyên liệu để lên men vang. Thông qua việc quan sát và phân tích sơ bộ một số chỉ tiêu, chúng tôi nhận thấy: Quả táo mèo rất có triển vọng trong việc sử dụng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất vang. Cũng đã có một số công trình nghiên cứu về vang Táo Mèo, nhưng chúng tôi nhận thấy còn rất nhiều yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men chưa được khám phá kỹ. Đối tượng nấm men phân lập từ quả Táo Mèo chưa được nghiên cứu sâu. Do vậy, chúng tôi quyết định tiến hành đề tài nghiên cứu: “Tuyển chọn chủng nấm men, tìm điều kiện tối ưu cho quá trình lên men vang Táo Mèo”. Với mong muốn những chỉ tiêu và kết quả phân tích được sẽ hỗ trợ cho những nghiên cứu tiếp theo về nấm men. Và quy trình lên men sẽ được mở rộng trên quy mô sản xuất. Rượu vang Táo Mèo sẽ là sản phẩm đặc trưng bổ sung vào sự phong phú cho thị trường vang Việt Nam. B. Mục tiêu nghiên cứu. 1. Phân lập và tuyển chọn được chủng nấm men lên men vang từ dịch Táo Mèo. Định loại chủng nấm men này. 2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng đã tuyển chọn. 3. Tách chiết DNA tổng số. 4. Lên men rượu vang Táo Mèo trên quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng quy trình lên men. C. Đối tượng nghiên cứu. - Quả Táo Mèo (Docynia indica). - Chủng nấm men có khả năng lên men vang Táo Mèo. D. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của công trình. - Nghiên cứu đặc tính sinh lí, sinh hoá của chủng nấm men có khả năng lên men vang Táo Mèo. Tách chiết DNA tổng số. Kết quả nghiên cứu này là dẫn liệu góp phần bổ sung cho các nghiên cứu về nấm men và ứng dụng của nấm men trong đời sống. - Tạo ra sản phẩm vang mới làm phong phú thị trường vang trong nước và thế giới. E. Cấu trúc luận văn Ngoài phần mở đầu, mục lục, phụ lục, danh mục, tài liệu tham khảo, đề tài gồm 4 chương: Chương 1. Tổng quan tài liệu Chương 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận Chương 4. Kết luận và đề nghị. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tìm hiểu chung về rượu vang 1.1.1. Khái niệm rượu vang Rượu vang là một sản phẩm lên men không qua chưng cất từ nước ép các loại hoa quả như: Nho, Dâu, Mơ, Vải Thiều, Táo... Theo từ điển viện hàn lâm ẩm thực Pháp, rượu vang được định nghĩa như sau: “Là một chất lỏng sinh động, rượu vang có thể mang bệnh, có thể già và chết”. Thành phần chủ yếu của rượu vang gồm có: - Rượu Etylic: Đây là sản phẩm của quá trình lên men, quá trình chuyển hoá đường thành rượu trong điều kiện kỵ khí. Hàm lượng Etanol trong rượu vang thường ở mức 10 – 14 độ rượu. Đây là sản phẩm của giai đoạn lên men chính. Phương trình hoá học biểu diễn sự chuyển hoá đường thành rượu: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 33KCal - Các chất bổ dưỡng có trong vang: Đường trong vang từ 62-132g/l. Chủ yếu là glucoza, fructoza .....và galactoza. - Các axit vô cơ và hữu cơ: axit malic, axit tartaric, axit citric, axit axalic....hàm lượng axit tổng số từ 4-7 g/l(quy ra axit tartaric). 1.1.2. Phân loại rượu vang Có nhiều cách để phân loại rượu vang. Hiện nay có thể chia rượu vang thành các loại sau: - Vang không gaz (still wines). Nổi tiếng là vang không bọt của Pháp, ngoài ra kể đến Ý, Đức, Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Nga, Mỹ.... - Vang có gaz (Spanking wine) tiêu biểu nhất là Champagne. Champagne nổi tiếng ở Pháp, người ta phân biệt 3 loại Champagne: + Loại không ngọt (brut) + Loại rất ít đường (extra dry, extra see). + Loại ngọt (sec;dry). Ngoài ra có các loại rượu được pha trộn từ nhiều loại vang khác nhau tạo thành như: Brandy, sherry, rượu thơm (chủ yếu là vermouth)..... [15]. - Căn cứ vào màu sắc có thể chia rượu vang (chủ yếu là vang nho) thành các loại: + Vang đỏ: lên men từ nho đỏ có xác quả. + Vang trắng: lên men từ nước ép nho trắng hoặc nước ép nho đỏ. + Vang hồng: lên từ nho đỏ và xác quả nhưng thời gian tiếp xúc giữa xác quả và dịch ép ngắn hơn. [14] 1.1.3. Nguồn nguyên liệu sản xuất vang Nguyên liệu sản xuất vang là dịch ép các loại trái cây tươi hoặc dịch chiết siro của các loại trái cây như: Nho, Mơ, Dâu, Táo, Vải, Anh đào..... Thành phần hoá học một số loại trái cây dùng để lên men vang bảng 1.1 và bảng 1.2 Bảng 1.1. Thành phần hoá học một số loại quả Thành phần hoá học cơ bản (%) Tên quả Nước Đườn axit Pectin Tanin g Nho 73,1 9,88 0,56 0,092 0,07 Vải 84,28 16,1 5,16 0,249 0,83 Dứa 54,3 3,9 0,6 0,249 0,83 Mơ 73,8 9,0 1,1 0,249 0,83 Dâu 84,74 9,19 0,49 0,31 0,035 Bảng 1.2. Thành phần hoá học của dịch táo mèo STT Thành phần hóa học Nơi thu mẫu Đơn vị Yên Bái Sơn La Trung bình 1 Đường tổng số % 4,8 4,82 4,81 2 Axit tổng số % 1,45 1,48 1,47 3 Vitamin C mg/l 11,0 11,4 11,22 4 Nước % 84,0 85,1 84,6 5 Protein toàn phần % 0,92 0,92 0,92 6 Ph 2,8 3,0 2,9 Các chỉ tiêu cơ bản như hàm lượng đường, pH, axit tổng số cho thấy có thể dùng táo mèo làm nguyên liệu cho lên men rượu vang. 1.2. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang và bệnh vang 1.2.1. Nấm men 1.2.1.1. Cấu tạo và hình thái tế bào nấm men - Cấu tạo tế bào: Nấm men thuộc loài Saccharomyces là đối tượng chính tham gia vào quá trình chuyển hoá đường thành rượu. Nấm men là vi sinh vật nhận thực, có cấu tạo đơn bào và cấu tạo phức tạp hơn vi khuẩn. Thành tế bào là cơ quan bảo vệ và duy trì hình dạng tế bào. Thành chứa chất có khả năng kết dính. Điều này có ý nghĩa lớn trong công nghệ sản xuất bia, rượu. Thành có thành phần hoá học chủ yếu là hemixenluloza(70% trọng lượng khô). Ngoài ra còn có kitin 1- 3%, protein 6- 10%, lipit 8- 8,5%, khoáng7%. Thành phần nội bào quan trọng của nấm men đó là ty thể, không bào và nhân. Số lượng ty thể khoảng 10- 20/ 1 tế bào. Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và sinh sản của nấm men. Không bào được hình thành từ thể golgi hay mạng lưới nội chất. Không bào chứa hệ thống keo bao gồm: enzym, protein, hydrocacbon, muối canxi, kali, phenolflavin, ribo flavin, axit nucleic và các chất dự trữ khác. Nhân có hình ovan, hình tròn nằm gần không bào trung tâm với kích thước khoảng 2,4µm. Nhân chứa toàn bộ hệ gen tham gia điều khiển quá trình sinh tổng hợp của tế bào nấm men. - Hình thái tế bào: đa số có hình trứng, cầu hay hình Ovan. Kích thước tế bào từ 3-10µm, 5-12µm. Hình thái và kích thước tế bào thay đổi theo điều kiện môi trường nuôi cấy. Khi môi trường nghèo dinh dưỡng nấm men thường có dạng hình giày. 1.2.1.2. Sinh sản của tế bào nấm men Nấm men sinh sản vô tính bằng hình thức đâm chồi và giữa các quá trình này có xen lẫn hình thức sinh sản hữu tính. Nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất. Khi tế bào phát triển đến một mức độ nhất định thì trên cơ thể nảy một chồi nhỏ là mầm. Mầm (tế bào con), phát triển trên cơ thể mẹ, cũng có thể tách khỏi cơ thể mẹ để phát triển độc lập. Trong điều kiện thuận lợi chỉ 20 đến 30 phút có một thế hệ tế bào con được hoàn chỉnh. Nấm men Saccharomyces có khả năng hình thành bào tử. Bào tử túi được sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang. Mỗi túi nang chứa 1-8 bào tử. Nấm men Saccharomyces được hình thành theo lối sinh sản vô tính. Đó là quá trình tạo bào tử trực tiếp từ một tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp. Bào tử túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành một tế bào nấm men mới. Tiếp theo tế bào này lại sinh sản theo lối nảy chồi. * Nấm men được dùng trong lên men rượu vang đó là Saccharomyces cerevisiae. Theo quan điểm kinh tế người ta chia thành các chủng: - Chủng lên men với hiệu suất cao ở thời gian tối ưu sản sinh tới 20%V cồn. - Chủng lên men ở thời gian ngắn, lên men tạo 8-12%V cồn. - Chủng chịu nồng độ cồn cao, lên men trong rượu vang dưới 30% đường tạo 10-13%V cồn. 1.2.2 Vi khuẩn Trong nước quả và rượu vang có thể phát triển những dạng vi khuẩn có tính ổn định lớn với rượu và axit hữu cơ. Chúng có thể là nguyên nhân gây nên những biến đổi sâu sắc trong rượu vang về vị chua, mùi, có loại còn gây đục vang. Đó thường là các loại vi khuẩn: Acetobacter xyllium, Acetobacter aceti. Louis Pasteur đã tìm ra cơ chế làm hỏng vang khi rượu vang tiếp xúc với không khí có vi khuẩn Bacillus. Do vậy, để bảo quản rượu vang người ta có thể thanh trùng Pasteur. Nhưng phương pháp này có thể làm giảm chất lượng của vang. Ngoài ra, người ta còn dùng phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản như SO2 (75120mg/l). 1.2.3. Nấm mốc Nấm mốc phát triển ở quả chất bã của sản xuất rượu vang, thùng thiết bị hoặc trong không khí. Một số loại nấm mốc hay gặp thuộc các chi: Rhizopus, Aspergillus. 1.2.4. Vi sinh vật làm hỏng vang Có không ít vi sinh vật làm cho vang bị đục, bị chua gắt có mùi khó chịu, làm cho vang bị hỏng như: Acetobacter xylium, Acetobacter aceti. [8]. Các vi khuẩn kị khí: các vi khuẩn lactic như: Lb.brevia, Lb.pastoerianus, Lb.plantarum... đã làm cho vang bị vẩn đục, chúng tác động làm chuyển hoá axit citric, tạo ra lượng lớn axit lactic, axit axetic và 2,3 butadiol. Các vi khuẩn hiếu khí: một số loài nấm men tạo màng trên bề mặt vang như: Candida, Zygopichia, Pichia... phân giải đường thành các axit hữu cơ: xitric, axetic... làm cho vang bị đục, độ chua tăng, vị không ngon. [11]. 10 1.3. Ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men 1.3.1. Nguồn cacbon - Cacbon là nguồn nguyên liệu cơ bản kiến tạo nên bộ khung tế bào nấm men. Là thành phần quan trọng của tất cả các chất trao đổi. Cacbon là nguồn dinh dưỡng hàng đầu cho vi sinh vật. - Nguồn cacbon cung cấp cho nấm men Saccharomyces cerevisiae được lấy chủ yếu từ các nguồn đường: Glucoza, saccaroza, fructoza. - Nguồn cacbon đáp ứng 3 nhu cầu cơ bản của nấm men. + Sản sinh năng lượng thông qua quá trình oxi hoá khử. + Tạo thành những tiền chất. + Tham gia vào các quá trình oxi hoá khử. 1.3.2. Nguồn nitơ và khoáng chất Nitơ là thành phần quan trọng trong tế bào vi sinh vật, nó là một trong những nguyên tố cấu thành lên axit nucleic. Nitơ cung cấp cho vi sinh vật chủ yếu từ 2 nguồn: nguồn vô cơ và nguồn hữu cơ. 1.3.3. Ảnh hưởng của oxy Quá trình tăng sinh của nấm men là quá trình hiếu khí vì vậy oxy là nguồn quan trọng để nấm men tăng sinh khối trong giai đoạn nhân giống. 1.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 1.4.1 Hàm lượng cồn và pH Nấm men lên men luôn sản sinh một lượng cồn. Nồng độ cồn thích hợp cho nấm men phát triển tốt là 9-14%V. Khả năng chịu cồn và lên men tốt trong môi trường có nồng độ cồn thích hợp là một tiêu chí để tuyển chọn chủng nấm men cho quá trình sản xuất rượu. Trong quá trình lên men pH môi trường luôn biến đổi. Ở giai đoạn cuối pH hơi tăng do nấm men tự phân huỷ giải phóng ra NH3. Ở pH=2,3 quá trình lên men yếu pH > 6,5 – 7,5 khả năng lên men không còn. pH thích hợp là 4-5. 1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng khá lớn đến quá trình lên men. 0 - Nhiệt độ < 20 C: sự lên men chậm chạp, độ rượu tạo thành thấp 0 - Nhiệt độ < 10 C: không diễn ra quá trình lên men. 0 - Nhiệt độ ở 35 C: nguy hiểm cho quá trình lên men, nấm men không chết nhưng mất tác dụng 0 - Nhiệt độ > 35 C: quá trình lên men dừng lại, lượng đường sót cao vi khuẩn hoạt động đặc biệt nhiều vi khuẩn chuyển hoá đường thành axit axetic gây chua, giảm chất lượng vang. 0 Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 26 - 28 C. 1.4.3. Hàm lượng đường và hàm lượng men giống Đường và các chất hoà tan tạo nên áp suất thẩm thấu ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển các chất ra vào tế bào. Hàm lượng đường thích hợp cho quá trình lên men là 12-25%. Hàm lượng đường 30%V sẽ ức chế quá trình lên men. Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi hàm lượng đường trong dịch lên men tăng thì hàm lượng axit axetic trong vang cũng cao. Mặt khác tỉ lệ các loại đường trong dịch lên men cũng ảnh hưởng không nhỏ đến tốc độ và hiệu xuất lên men. Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy: glucoza là loại đường phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển của tế bào nấm men cũng như quá trình tạo rượu , tiếp đó là đường fructoza và đường sacaroza… Vì vậy quả có chứa hàm lượng đường khử càng cao càng có lợi cho quá trình lên men và chất lượng vang thành phẩm[9]. Hàm lượng men giống cũng ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinh trưởng cũng như quá trình lên men của nấm men. Hàm lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian lên men càng kéo dài hơn, dễ bị nhiễm khuẩn, ngược lại hàm lượng men giống trong dịch lên men cao thì thời gian lên men ngắn hơn, hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của tế bào nấm men. Nhưng hàm lượng tế bào men giống quá cao sẽ làm thay đổi thành phần môi trường lên men và sẽ không có lợi cho quá trình lên men và chất lượng vang. Nhìn chung hàm lượng men giống thích hợp cho quá trình lên men khoảng 10%. CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, thiết bị và hoá chất 2.1.1. Nguyên liệu chính - Quả táo mèo thu nhận từ hai tỉnh Yên Bái và Sơn La. - Các chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch quả táo mèo có vị trí phân loại theo YelinovN.P (1996) sau đây: 1. Lớp : Hemiascomycetes 2. Bộ : Endomycetales 3. Họ : Saccharomycetaceae 4. Giống : Saccharomyces 5. Loài : Cerevisiae 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 2.1.2.1. Hoá chất Một số hoá chất được sử dụng: MgSO4,KH2PO4, (NH4)2SO4, axit xitric (hãng: FENXICHUN-Trung Quốc), K2S2O5 (hãng: BATOL-của C.H Pháp), các loại muối nitrat, các loại đường (hãng: BDH-Anh)… 2.1.2.2. Thiết bị Hộp petri, ống nghiệm, đường kế Đức, tủ sấy, tủ lạnh sâu, buồng cấy vô trùng, buồng đếm Goriaev, máy đo pH, máy quang phổ kế, máy so màu, máy ly tâm, kính hiển vi quang học Nikon Nhật, nồi khử trùng cao áp, máy lắc ổn nhiệt, máy lắc sinh học, … 2.1.3 Các loại môi trường 2.1.3.1 Môi trường Hansen (môi trường 1) g/l 1. Đường glucoza : 2. Pepton : 50g 5g 3. MgSO4 : 0,5g 4. KH2PO4 : 1g 5. (NH4)2SO4 : 1g 6. Thạch Aga : 20g 7. Nước : 1000ml 2.1.3.2. Môi trường nhân giống (môi trường 2) g/l 1. Đường glucoza : 50g 2. Pepton : 5g 3. MgSO4 : 0,5g 4. KH2PO4 : 1g 5. (NH4)2SO4 : 1g 6. Nước : 1000ml 2.1.3.3. Môi trường lên men (môi trường 3)g/l 1. Dịch siro hoa quả : 200ml 2. MgSO4.7H2O : 0,5g 3. KH2PO4 : 1g 4. KH2PO4 : 1g 5. (NH4)2SO4 : 1g 6. Nước : 1000ml 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh: phân lập, tuyển chủng nấm men dựa trên việc nghiên cứu hình thái tế bào nấm men, xác định số lượng tế bào nấm men, hoạt lực lên men. 2.2.2 Phương pháp hóa lý: xác định hàm lượng đường tổng số bằng khúc xạ kế, hàm lượng đường sót bằng phương pháp DNS [5], hàm lượng cồn bằng phương pháp bicromatkali [3], hàm lượng axít tổng số theo axít tartaric, dựa vào nguyên tắc trung hoà axít bằng dung dịch NaOH 0,1 N [4], pH bằng máy đo pH 2.2.3 Phương pháp phân tích cảm quan [6]. 2.2.4 Phương pháp xử lý các kết quả thu được bằng phần mềm Excel và thống kê toán học. 2.3. Phạm vi nghiên cứu Chủng nấm men Saccharomyces tuyển chọn trên đối tượng là quả táo mèo được thu từ Trạm Tấu (Yên Bái), Sơn La. 2.4. Địa điểm thực hiện đề tài Phòng thí nghiệm Vi sinh-CNSH, Khoa sinh-KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa sinh-KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.2 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CHỦNG NẤM MEN LÊN MEN VANG TÁO MÈO 3.2.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo Nguyên liệu dùng để sản xuất rượu vang ở đây là các loại quả táo mèo (quả sơn tra ). Táo mèo được thu hoạch vào tháng 6, tháng 7. Quả thu hoạch về cần phải được chọn lấy các quả đã chín, loại bỏ các quả non, quả dập nát thối rữa. Quả đã chọn đem rửa sạch bằng nước đạt tiêu chuẩn vệ sinh rồi để ráo nước. Sau đó cho vào các ang thùng ngâm đường theo tỉ lệ 1:1. Quả táo mèo ta khía các đường nhỏ quanh quả. Khoảng hai ngày khuấy trộn một lần. Sau một tháng ta thu được một thứ siro nước quả có nồng độ đường khoảng 60-80 % và nhiều dưỡng chất khác được chiết ra từ thịt quả. Pha loãng dịch quả bằng nước đảm bảo vệ sinh cho đến khi đạt nồng độ đường 20%. Dịch pha loãng được sunfít hoá bằng K2S2O5 với liều lượng thích hợp để không giết chết nấm men thuần chủng. Sau đó để lên men tự nhiên ở 0 nhiệt độ 28 - 30 C, đến ngày lên men thứ 3-5 chúng tôi lấy khoảng 5-10ml -1 -2 -3 dịch đang lên men đem pha loãng ở các nồng độ khác nhau: 10 , 10 , 10 , -4 -5 -10 10 , 10 ….10 . Từ mỗi ống nghiệm chứa dịch pha loãng ta lấy 1 giọt, dùng bàn trang trải đều trên hép lồng có chứa môi trường Hansen rồi để trong tủ ấm 0 28 - 30 C trong khoảng thời gian 2 - 3 ngày [7]. Từ các hộp lồng này ta lựa chọn lấy các khuẩn lạc to, trơn, nhẵn, bóng, sáng đem cấy riêng rẽ vào các ống thạch nghiêng, nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng tuyển chọn. Bằng cách tuyển chọn như trên lặp lại ba lần, chúng tôi thu được 38 mẫu nấm men. Từ số mẫu này tuyển chọn được 4 chủng có đường kính khuẩn lạc lớn hơn 1,5mm, chúng tôi dùng 4 chủng làm đối tượng nghiên cứu tiếp, các chủng này kí hiệu là TM1, TM2, TM3, TM4. Tiếp theo xác định hoạt lực lên men và dựa vào khoá phân loại của Yelinov N.P xác định tên khoa học của 4 chủng nấm men đã chọn là TM1, TM2, TM3, TM4. 3.2.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo Nấm men đóng vai trò quan trọng đối với toàn bộ quy trình sản xuất và chất lượng của vang. Nấm men sử dụng lên men rượu vang từ dịch táo mèo phải đạt các yêu cầu sau: [12] 1. Lên men được ở nồng độ đường và nồng độ axit khá cao. 2. Có hiệu suất lên men cao. 3. Có khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm. 4. Tạo được hương thơm đặc trưng và không có vị lạ, không sinh độc tố. Ổn định lâu dài trong sản xuất 3.2.2.1. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng nấm men tuyển chọn Môi trường chúng tôi dùng để thử khả năng sinh trưởng và phát triển của 4 chủng nấm men thu được là môi trường dịch siro táo mèo có bổ sung nước chiết giá đỗ xanh. Môi trường nuôi cấy sau khi được khử trùng được đưa vào 0 các bình tam giác 250 ml và đặt lên máy lắc ổn nhiệt (28-30 C) tốc độ 150 vòng /phút. Tiến hành xác định số lượng tế bào nấm men ở OD 610nm với khoảng thời gian thử mẫu là 4 giờ một lần trong 23 giờ liên tục. Kết quả được dẫn ra ở bảng 3.2.2.1 và đồ thị 3.1 Tốc độ sinh sản trung bình của các chủng nấm men trong 1 giờ được tính bằng công thức: v = Trong đó dx dt v : tốc độ sinh trưởng trung bình của nấm men trong 1 giờ dx: số tế bào nấm men tăng thêm trong 1 ml dịch ( từ thời điểm t1 đến t2 ) dt : thời gian nuôi cấy ( dt = t2 – t1) Bảng 3.2.2.1. Khả năng sinh trưởng và phát triển của 4 chủng nấm men SL tế bào 6 Chủng nấm men x 10 Thời gian TM1 TM2 TM3 TM4 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,5±1,1 3,6±1,1 7±1,1 3,6±1,1 6,2±1,1 5,4±1,1 10±1,1 6,4±1,1 15 ( giờ ) 0h 4 h 8h h 12 16 10 5 0 8,4±1,1 12±1,1 20,75±1,1 14,8±1,1 h 87,25±1,1 65±1,1 100±1,1 102±1,1 h 16±1,1 147,5±1,1 205±1,1 210±1,1 h 245±1,1 305±1,1 390±1,1 405±1,1 Biểu đồ 3.1. Tốc độ sinh sản trung h 250±1,1 312±1,1 396,6±1,1 505±1,1 bình của bốn chủng nấm men h 248±1,1 310±1,1 390±1,1 498±1,1 20 24 28 32 20 TM1 TM2 TM3 TM4 Kết quả thí nghiệm cho thấy: Chủng có tốc độ sinh sản trung bình cao nhất là chủng TM4 Chủng có tốc độ sinh sản trung bình thấp nhất là chủng TM1 3.2.2.2. Nghiên cứu khả năng lên men, thử hoạt lực lên men của bốn chủng nấm men đã tuyển chọn Các chủng nấm men được lên men trong môi trường dịch sirô táo mèo có hàm lượng đường 240 g/l. Đây là hàm lượng đường thường được dùng cho 0 lên men rượu vang của các loại quả, nhiệt độ lên men 28-30 C. Sau khi kết thúc quá trình lên men rượu ( 15- 17 ngày ) chúng tôi tiến hành phân tích một số chỉ tiêu hoá lý để xác định khả năng lên men của các chủng nấm men và kết quả thí nghiệm được dẫn ra ở bảng 3.2.2.2a Bảng 3.2.2.2a Khả năng lên men của bốn chủng nấm men Chỉ tiêu đánh giá Chủng nấm men Đơn vị TM1 TM2 TM3 TM4 Đường tổng số g/l 75 70 65 50 Đường khử g/l 0,75 0,7 0,65 0,45 Độ cồn %V 9,76 9,84 10,51 11,17 Hiệu suất lên men % 76,2 76,6 81,9 87,06 Môi trường nghiên cứu là dịch siro táo mèo có bổ sung cao men và được pha loãng để đạt nồng độ đường là 20%. Tiến hành lên men trong các bình h tam giác ở quy mô 150 ml với thời gian là 36 . Chúng tôi thu được kết quả sau. Các chủng đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt và đạt số lượng tế bào cực đại sau 28 giờ nuôi cấy. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2.2.2b Bảng 3.2.2.2b Hoạt lực lên men của bốn chủng nấm men STT Chủng Độ pH 3,4 3,8 4,2 4,5 4,8 5,2 1 TM1 + + + ++ ++ ++ 2 TM2 + ++ ++ +++ ++++ ++++ 3 TM3 ++ ++ +++ ++++ ++++ ++++ 4 TM4 ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ Trong đó + + + +: Hàm lương CO2 được tạo ra > 32g/l dịch lên men + + +: Hàm lượng CO2 được tạo ra từ 1624g/l dịch lên men + + : Hàm lượng CO2 được tạo ra từ 816g/l dịch lên men + : Hàm lượng CO2 được tạo ra < 8g/l dịch lên men Từ kết quả thu được cho thấy rằng: Các chủng đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong khoảng pH từ 3,8-5,2. Hai chủng có hoạt lực lên men mạnh nhất là TM3 và TM4. 20 3.2.2.3. Khả năng kết lắng, khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm 3.2.2.3.a Khả năng kết lắng Hoà sinh khối nấm men thu được vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian 3-5 phút và để lắng 15 phút. Chúng tôi thu được kết quả sau: Bảng 3.2.2.3a Khả năng kết lắng của bốn chủng nấm men Tên chủng TM1 TM2 TM3 TM4 Chiều cao cột sinh khối ( mm ) 14 16 17,5 18 Theo kết quả ở bảng trên, chủng có khả năng kết lắng tốt nhất là TM4, tiếp theo là các chủng TM3, TM2 và kém nhất là chủng TM1. Khả năng kết lắng của nấm men có ý nghĩa rất lớn trong quá trình sản xuất vang. Đặc biệt là giai đoạn lọc vang. Chủng có khả năng kết lắng càng tốt thì sản phẩm vang càng trong, và càng dễ thu sinh khối tế bào. Chính vì vậy khả năng kết lắng được xem như một tiêu chuẩn chọn lựa chủng nấm men dùng cho qua trình sản xuất rượu vang. 3.2.2.3.b Khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm Sau khi kết thúc lên men được 30 ngày, chúng tôi tiến hành xác định khả năng tạo hương thơm bằng phương pháp cảm quan và xác đinh độ trong sản phẩm ở OD 600 nm. Chúng tôi thu được kết quả dẫn ra ở bảng sau: Bảng 3.2.2.3b Khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm của bốn chủng nấm men TT Chủng Chỉ tiêu đánh giá TM1 TM2 TM3 TM4 1 Độ đục ( OD ) 0,08 0,12 0,98 0,033 2 Hương thơm Thơm Ít thơm Ít thơm Thơm