Tài liệu Phân tích hàm lượng β caroten trong một số loại ngũ cốc có màu ở thừa thiên huế bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (tt)

ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TRƢƠNG NGỌC BẢO HIẾU PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG β - CAROTEN TRONG MỘT SỐ LOẠI NGŨ CỐC CÓ MÀU Ở THỪA THIÊN HUẾ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO DemoChuyên Version -ngành: Select.Pdf SDK Hóa Phân Tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. NGÔ VĂN TỨ Thừa Thiên Huế, Năm 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu ghi trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả luận văn Trƣơng Ngọc Bảo Hiếu Demo Version - Select.Pdf SDK ii Lời Cảm Ơn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS. Ngô Văn Tứ đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này, đồng thời đã bổ sung cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong khoa Hóa trường Đại học Sự phạm và Đại học Khoa học - Đại học Huế đã giảng dạy, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học Cao học và thực hiện luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm và thực phẩm Thừa Thiên Huế đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện luận văn. Bằng tình cảm chân thành, tôi xinSDK gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia Demo Version - Select.Pdf đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn thạc sĩ này. Xin chân thành cảm ơn! Thừa Thiên Huế, năm 2017 Trương Ngọc Bảo Hiếu iii MỤC LỤC Trang phụ bìa .......................................................................................................... i Lời cam đoan.......................................................................................................... ii Lời cảm ơn .............................................................................................................iii Mục lục ................................................................................................................... 1 Danh mục các từ viết tắt .......................................................................................... 4 Danh mục các bảng và hình ..................................................................................... 5 MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 8 NỘI DUNG ........................................................................................................... 10 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 10 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NGŨ CỐC ........................................................... 10 1.2. GIỚI THIỆU VỀ CAROTENOIT ................................................................... 12 1.2.1. Cấu tạo ........................................................................................................ 12 1.2.2. Tính chất...................................................................................................... 14 1.2.3. Nhân tố và cơ chế sự mất carotenoit ............................................................ 14 1.3. TỔNG QUAN VỀ β-CAROTEN .................................................................... 15 Demo Version - Select.Pdf SDK 1.3.1. Lịch sử tìm ra β-caroten và vitamin A .......................................................... 15 1.3.2. Cấu tạo ........................................................................................................ 16 1.3.3. Tính chất...................................................................................................... 18 1.3.4. Quá trình chuyển hóa β-caroten thành vitamin A ......................................... 19 1.3.5. Chức năng của β-caroten đối với sức khỏe con ngƣời .................................. 20 1.3.6. Nguồn cung cấp β-caroten ........................................................................... 21 1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH β-CAROTEN ........................................ 22 1.4.1. Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................................................... 22 1.4.2. Quang phổ ................................................................................................... 22 1.4.3. Sắc kí khí ..................................................................................................... 23 1.4.4. Điện di mao quản ......................................................................................... 23 1.4.5. Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (APCI) .............................................. 24 1.4.6. Quang Phổ Hồng Ngoại Biến Đổi Fourier (FTIR) ........................................ 24 1.5. GIỚI THIỆU VỀ PHƢƠNG PHÁP HPLC ..................................................... 25 1.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp HPLC ............................................................ 25 1 1.5.2. Các giai đoạn chạy sắc ký HPLC ................................................................. 26 1.5.3. Pha tĩnh trong HPLC.................................................................................... 26 1.5.4. Pha động trong HPLC .................................................................................. 27 1.5.5. Detector trong HPLC ................................................................................... 27 1.5.6. Cách đánh giá peak, phƣơng pháp định lƣợng theo HPLC ........................... 29 1.5.6.1. Cách đánh giá peak ................................................................................... 29 1.5.6.2. Phƣơng pháp định lƣợng ........................................................................... 29 CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 33 2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................... 33 2.2. DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT .......................................................................... 33 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 34 2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu và chuẩn bị mẫu ........................................................ 34 2.3.2. Kỹ thuật xử lý mẫu ...................................................................................... 34 2.3.3. Chuẩn bị mẫu trắng ...................................................................................... 34 2.3.4. Khảo sát các điều kiện phân tích .................................................................. 34 2.3.4.1. Bƣớc sóng phát hiện ................................................................................. 34 2.3.4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của pha động ............................................................. 34 Demo Version - Select.Pdf SDK 2.3.4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ dòng ......................................................... 34 2.3.5. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích ........................................... 35 2.3.5.1. Khảo sát tính tƣơng thích hệ thống HPLC ................................................. 35 2.3.5.2. Khảo sát khoảng tuyến tính ....................................................................... 35 2.3.5.3. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng .................................. 35 2.3.5.4. Độ lặp lại .................................................................................................. 36 2.3.5.5. Độ đúng .................................................................................................... 37 2.3.5.6. Định lƣợng và tính toán kết quả ................................................................ 37 2.3.5.7. Xử lý số liệu thực nghiệm và đánh giá kết quả phân tích ........................... 37 2.3.6. Áp dụng phƣơng pháp để định lƣợng β-caroten trong một số loại ngũ cốc có màu ở Thừa Thiên Huế ..................................................................................... 40 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 41 3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH THEO PHƢƠNG PHÁP HPLC .................................................................................................................... 41 3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chạy sắc ký ................................................................... 41 2 3.1.2. Ảnh hƣởng của thành phần pha động ........................................................... 42 3.1.3. Ảnh hƣởng của tốc độ dòng pha động .......................................................... 44 3.2 KỸ THUẬT XỬ LÝ MẪU .............................................................................. 46 3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘ TIN CẬY CỦA PHƢƠNG PHÁP HPLC XÁC ĐỊNH βCAROTEN ............................................................................................................ 47 3.3.1. Độ ổn định của hệ thống HPLC sử dụng detectơ PAD ................................. 47 3.3.2. Khoảng tuyến tính của phƣơng pháp định lƣợng .......................................... 47 3.3.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng ................................................... 48 3.3.4. Độ lặp lại của phƣơng pháp ......................................................................... 49 3.3.5. Độ đúng của phƣơng pháp ........................................................................... 50 3.4. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ................................................. 52 3.5. ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP ĐỂ PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG βCAROTEN TRONG MỘT SỐ MẪU NGŨ CỐC CÓ MÀU Ở THỪA THIÊN HUẾ ...................................................................................................................... 54 3.5.1. Mẫu phân tích .............................................................................................. 54 3.5.2. Phân tích và đánh giá hàm lƣợng β-caroten trong một số mẫu ngũ cốc có màu ở Thừa Thiên Huế ........................................................................................ 54 Demo Version - Select.Pdf SDK 3.5.3. Đánh giá kết quả phân tích hàm lƣợng β-caroten so với hàm lƣợng ở bảng thành phần thực phẩm Việt Nam của Bộ y tế (2007) .............................................. 59 3.5.4. Đánh giá hàm lƣợng β – caroten trong cùng một mẫu ngũ cốc có màu ở điều kiện bảo quản khác nhau ................................................................................................ 61 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 64 PHỤ LỤC ............................................................................................................. P1 Phụ lục 1. Sắc ký đồ khảo sát khoảng thuyến tính, LOD và LOQ .......................... P1 Phụ lục 2. Sắc ký đồ các mẫu ngũ cốc có màu ....................................................... P3 3 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Stt Ký hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt 1 AOAC Association of Official Hiệp hội các nhà hóa phân Analytical Chemists tích chính thức 2 BHT Butylated hydroxytoluene Hydroxytoluen butylat 3 CAS Chemical Abstracts Service Hiệp hội hóa chất Hoa Kỳ 4 ĐKTN Experimental condition Điều kiện thực nghiệm 5 HPLC 6 IUPAC 7 LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện 8 LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lƣợng 9 MeOH Methanol Metanol 10 OCC Open column chromatography Sắc ký cột mở 11 PAD Photodiode Array Detector 12 ppb Part per billion Phần tỷ 13 ppm Part per million Phần triệu 14 Rev Recovery Độ thu hồi 15 RF Fluoresence Huỳnh quang 16 RP Reverse phase Pha ngƣợc 17 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối 18 S/N Signal to noise ratio 29 TCVN Vietnam standard Tiêu chuẩn Việt Nam 20 THF Tetrahydrofuran Tetrahydrofuran 21 UV-VIS Ultraviolet visible Tử ngoại – khả kiến 22 V Volume Thể tích 23 VSATTP Hygiene and food safety Vệ sinh an toàn thực phẩm High performance liquid chromatography International Union Of Pure And Applied Chemistry Demo Version - Select.Pdf SDK 4 Sắc ký lỏng hiệu năng cao Hiệp hội Hóa Học Quốc Tế Detector mảng diot phát quang Tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH 1. BẢNG Stt Bảng Tiêu đề 1 Bảng 1.1 Hàm lƣợng β-caroten trong một số loại thực phẩm 21 2 Bảng 1.2 Phƣơng pháp thêm chuẩn đƣờng chuẩn 31 3 Bảng 2.1 Ma trận thực nghiệm để phân tích ANOVA một yếu tố 39 4 Bảng 2.2 Bảng phân tích phƣơng sai theo ANOVA một yếu tố 39 5 Bảng 3.1 Hệ số đuôi peak với các tỷ lệ về dung môi pha động 42 6 Bảng 3.2 Các thông số cơ bản ở tốc độ dòng khác nhau 44 7 Bảng 3.3 Các thông số sắc ký của peak β – carotene 48 8 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 48 9 Bảng 3.5 Kết quả xác định giới hạn phát hiện 49 10 Bảng 3.6 Kết quả diện tích peak và nồng độ khảo sát độ lặp lại 50 11 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu ngũ cốc Kết quả thời gian lƣu và diện tích peak các mẫu thêm Trang 50 12 BảngDemo 3.8 Version - Select.Pdf SDK chuẩn 51 13 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu ngũ cốc 51 14 Bảng 3.10 Thông tin về các mẫu ngũ cốc chế biến lấy đợt 1 54 15 Bảng 3.11 Thông tin về các mẫu ngũ cốc chế biến lấy đợt 2 54 16 Bảng 3.12 17 Bảng 3.13 18 Bảng 3.14 19 Bảng 3.15 20 Bảng 3.16 Kết quả phân tích hàm lƣợng β – caroten trong mẫu ngũ cốc (mẫu đợt 1) Kết quả phân tích hàm lƣợng β – caroten trong mẫu ngũ cốc (mẫu đợt 2) Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố của mẫu ngũ cốc 55 56 57 M1 Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố của mẫu ngũ cốc 57 M2 Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố của mẫu ngũ cốc M3 5 57 Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố của mẫu ngũ cốc 21 Bảng 3.17 22 Bảng 3.18 23 Bảng 3.19 24 Bảng 3.20 25 Bảng 3.21 Kết quả kiểm tra hàm lƣợng β – caroten 26 Bảng 3.22 27 Bảng 3.23 58 M4 Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố của mẫu ngũ cốc M6 Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố của mẫu ngũ cốc M7 Kết quả phân tích hàm lƣợng β – caroten trong 06 mẫu ngũ cốc 58 58 60 60 Kết quả phân tích hàm lƣợng β-caroten trong mẫu kê ở điều kiện bảo quản mẫu khác nhau 61 Kết quả đánh giá theo phƣơng pháp ANOVA một yếu tố đối với mẫu kê ở điều kiện bảo quản mẫu khác nhau Demo Version - Select.Pdf SDK 6 62 2. HÌNH Tiêu đề Stt Hình 1 Hình 1.1 Một số loại ngũ cốc 10 2 Hình 1.2 Sơ đồ giải phẫu hạt ngũ cốc 11 3 Hình 1.3 Một số carotene phổ biến trong thực phẩm 12 - 13 4 Hình 1.4 Một số xanthophyll phổ biến trong thực phẩm 13 - 14 5 Hình 1.5 Sơ đồ biến đổi carotenoit 6 Hình 1.6 7 Hình 1.7 Quá trình chuyển hóa β-caroten thành vitamin A 19 8 Hình 1.8 Minh họa quá trình tách các chất trong cột sắc ký 25 9 Hình 1.9 Giới thiệu hệ thống HPLC 25 10 Hình 1.10 Detectror phổ hấp thụ quang phân tử UV-VIS 28 11 Hình 1.11 Detector mảng diot phát quang của Agilent 29 12 Hình 1.12 Chuẩn hoá một điểm 30 13 Hình 1.13 Đồ thị của phƣơng pháp đƣờng chuẩn 30 14 Version Select.Pdf SDK HìnhDemo 1.14 Đồ thị của -phƣơng pháp thêm chuẩn đƣờng chuẩn 15 Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động 16 Hình 3.2 Sắc ký đồ của hệ pha động methanol : nƣớc với các tốc độ dòng khác nhau 44 - 45 17 Hình 3.3 Sắc đồ dung dịch thử β-caroten và chuẩn β-caroten 46 18 Hình 3.4 Đƣờng hồi quy tuyến tính 49 19 Hình 3.5 20 Hình 3.6 21 Hình 3.7 Một số đồng phân hình học quan trọng của βcaroten Sắc ký đồ khảo sát độ đúng của phƣơng pháp khi thêm chuẩn β-caroten Quy trình phân tích mẫu ngũ cốc theo phƣơng pháp HPLC Biểu đồ hàm lƣợng β-caroten (ppm) trong một số loại ngũ cốc có màu 7 Trang 15 16 - 18 32 43 52 53 61 MỞ ĐẦU Carotenoit là các sắc tố tự nhiên tạo ra màu vàng, da cam, đỏ trong rất nhiều loại hoa quả (gấc, chanh, cam, nho,…), rau (cà rốt, cà chua,…), nấm và hoa; chúng cũng có mặt trong các sản phẩm động vật nhƣ: trứng, tôm hùm, cá,… Ngày nay, các hợp chất carotenoit rất đƣợc quan tâm, nghiên cứu và đã đạt đƣợc các kết quả không chỉ về ảnh hƣởng của chúng đến cơ thể sinh vật mà còn đƣa ra một số sản phẩm thuốc và thực phẩm thuốc bổ sung hàng ngày cho cơ thể [4], [12]. β-caroten là một trong số 600 loại carotenoid tồn tại trong tự nhiên. Trong cơ thể, ngƣời ta đã tìm thấy khoảng 70 carotenoit là tiền chất của vitamin A, trong đó có β-caroten. Và khi bị thừa thải thì β – carotene sẽ đƣợc dự trữ trong gan đến lúc cần thiết chứ không phải bị đào thải nhƣ khi thừa thải vitamin A. β – caroten tham gia và ảnh hƣởng đến một số quá trình sinh lý trong cơ thể: tăng cƣờng hệ miễn dịch, ngăn ngừa một số ung thƣ, làm giảm nguy cơ mắc phải nhiều bệnh về tim mạch, lão hóa, sa sút trí nhớ ở ngƣời già,…[7], [43], [44]. β – caroten có nhiều trong gấc, cà rốt, dƣa đỏ, củ cải đỏ, dâu tây, bí ngô,… và một số ngũ cốc: khoai lang, kê, đậu nành, đậu xanh, vừng đen,… [8], [15]. Ngũ cốc là một trong những loại thực phẩm không thể thiếu trong khẩu phần Demo Version - Select.Pdf SDK ăn hàng ngày. Nó cung cấp rất nhiều dƣỡng chất cho cơ thể, bao gồm chất xơ, tinh bột, các axit béo thiết yếu, các chất chống oxi hoá, các vitamin, các khoáng chất, lignin và các hợp chất phenolic. Các hợp chất này có khả năng làm giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, ung thƣ, đái tháo đƣờng, béo phì và các bệnh khác [42]. Ngũ cốc có màu là một trong những sản phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao. Việc nghiên cứu xác định hàm lƣợng β-caroten có trong các loại ngũ cốc có màu giúp ngƣời tiêu dùng lựa chọn sản phẩm ngũ cốc có màu thích hợp để bổ sung vào khẩu phần ăn hàng ngày, góp phần nâng cao giá trị dinh dƣỡng của những bữa ăn và chăm sóc tốt hơn sức khoẻ con ngƣời. Hiện nay, trên thế giới cũng nhƣ ở nƣớc ta đã có nhiều công trình nghiên cứu thành công về xác định hàm lƣợng β – caroten trong các loại rau củ và hạt bằng các phƣơng pháp khác nhau nhƣ: quang phổ hấp thụ phân tử, sắc ký lỏng hiệu năng cao,… [7], [8], [24], [28], [42]. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một trong những phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến để phân tích hàm lƣợng β-caroten. Phƣơng pháp sắc ký lỏng 8 hiệu năng cao có độ nhạy cao, hiệu suất tách cao, tiết kiệm đƣợc thời gian và dung môi. [30], [37], [39], [40]. Tuy nhiên, các nghiên cứu xác định hàm lƣợng β – caroten trong các loại ngũ cốc – nguồn thực phẩm trong đời sống hàng ngày chƣa đƣợc nghiên cứu đầy đủ. Vì vậy, tôi chọn đề tài: “Phân tích hàm lượng β - caroten trong một số loại ngũ cốc có màu ở Thừa Thiên Huế bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình phân tích β - caroten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. - Áp dụng quy trình phân tích hàm lượng β - caroten vào một số loại ngũ cốc có màu ở Thừa Thiên Huế. - Đánh giá và so sánh hàm lượng β - caroten trong từng loại ngũ cốc để có cơ sở lựa chọn khẩu phần ăn hợp lý nhằm đảm bảo lượng β – caroten cần thiết cho cơ thể. Demo Version - Select.Pdf SDK 9