Tài liệu Phân tích cấu trúc của một số hợp chất lai giữa tritecpenoit và chất có hoạt tính kháng hiv

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC BÙI THỊ ĐIỀN PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT LAI GIỮA TRITECPENOIT VÀ CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG HIV LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÁI NGUYÊN - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC BÙI THỊ ĐIỀN PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT LAI GIỮA TRITECPENOIT VÀ CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG HIV Ngành: Hóa phân tích Mã số: 8.44.01.18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. ĐẶNG THỊ TUYẾT ANH THÁI NGUYÊN - 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được khoá luận này em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc T.S Đặng Thị Tuyết Anh đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hóa Dược và các em sinh viên phòng Hóa Dược đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp - những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này. Trong quá trình thực hiện, mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy em kính mong nhận được ý kiến đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô. Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2018 Tác giả luận văn Bùi Thị Điền a MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. a MỤC LỤC ................................................................................................................... b DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................. c DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................................ d DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................................. d DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... e DANH MỤC PHỤ LỤC ............................................................................................. f MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về betulin ............................................................................................ 3 1.2. Tổng quan về các phương pháp phân tích ............................................................. 9 1.2.1. Các phương pháp chiết ...................................................................................... 3 1.2.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất .............. 4 1.2.3. Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất ...................................... 6 Chương 2. THỰC NGHIỆM .................................................................................. 11 2.1. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................ 11 2.1.1. Hóa chất và dung môi ..................................................................................... 11 2.1.2. Thiết bị xác định cấu trúc ................................................................................ 11 2.1.3. Xác định cấu trúc của các mẫu chất hữu cơ chuẩn bị được ............................ 11 2.2. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc một số dẫn xuất của tritecpenoit ................ 12 2.2.1. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc chất 6a-b ................................................. 12 2.2.2. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc chất 7a-b ................................................. 14 2.2.3. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc chất 8 a-b ................................................ 15 Chương 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN .................................................................... 18 3.1. Phân tích và xác định cấu trúc của hợp chất 6 a-b..................................................... 18 3.2. Phân tích và xác định cấu trúc của các hợp chất 6a-b với 7a-b ......................... 20 3.3. Phân tích và xác định cấu trúc các hợp chất lai giữa hợp chất 7a-b với AZT .......... 26 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 34 PHỤ LỤC PHỔ b DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT H, C 13 1 C- NMR H- NMR Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C Nuclear Magnetic Resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic Resonance) CHCl3 Clorofoc dd Double doulet DMF Dimethylformamide EtOH Etanol IR MS Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) Phổ khối lượng va chạm điện tử (Electron Impact-Mass Spectrometry) OMe Methoxy ppm Phần triệu (parts per million) s Singlet TLC Thin-layer chromatography c DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1. Một số tín hiệu đặc trưng khung lupan trong các hợp chất 6a-b .... 19 Bảng 3.2. Các pic cộng hưởng đặc trưng của các este 7a-b δ (ppm); (số proton); J (Hz) ............................................................................. 23 Bảng 3.3. Một số tín hiệu đặc trưng phổ 13C-NMR của các hợp chất 7a-b .... 25 Bảng 3.4. Các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng phổ 1H của các hợp chất 8a-b δ (ppm); s, m, hoặc d, t, J (Hz); số proton ........................... 29 Bảng 3.5. Tín hiệu cộng hưởng 13C đặc trưng của các hợp chất 8a-b δ (ppm)..... 32 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1. Tổng hợp các chất lai betulin và AZT qua cầu este-triazol ........ 12 Sơ đồ 3.2. Tổng hợp các propagyl este 7a-b ................................................ 20 Sơ đồ 3.3. Phản ứng “Click” tổng hợp các hợp chất lai 8a-b ....................... 27 d DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hợp chất lai triterpenoit-AZT ........................................................ 2 Hình 1.1. Một số dẫn xuất este của betulin có hoạt tính gây độc tế bào ....... 9 Hình 3.1. Cấu trúc hóa học và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất 6 a-b ... 19 Hình 3.2. Phổ NOESY của hợp chất 6b ....................................................... 20 Hình 3.3. Phổ giãn 1H-NMR của este 7a ..................................................... 22 Hình 3.4. Phổ giãn 1H-NMR của este 7a phần H-Csp3 ................................. 22 Hình 3.5. Cấu trúc hóa học và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất 7a-b .. 24 Hình 3.6. Phổ giãn 13C-NMR của hợp chất 7a ............................................. 26 Hình 3.7. Cấu trúc hóa học và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất 8a-b .... 27 Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của hợp chất 8a ...................................................... 29 Hình 3.9. Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất 8b ............................................. 30 Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất 8a..................................................... 31 Hình 3.11. Phổ giãn 13C-NMR của hợp chất 8a ............................................. 31 e DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ NOESY của hợp chất 6b ....................................................... 1 Phụ lục 2: Phổ giãn 1H-NMR của este 7a ...................................................... 2 Phụ lục 3: Phổ giãn 1H-NMR của este 7a phần H-Csp3.................................. 2 Phụ lục 4: Phổ giãn 13C-NMR của hợp chất 7a ............................................. 3 Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR của hợp chất 8a ...................................................... 3 Phụ lục 6: Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất 8b. ............................................. 4 Phụ lục 7: Phổ 13C-NMR của hợp chất 8a ..................................................... 4 Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR của hợp chất 8a ..................................................... 5 f MỞ ĐẦU Hiện nay, các nhà khoa học đã nghiên cứu tổng hợp các thuốc có cấu trúc lai, chứa hai thuốc có cơ chế tác dụng khác nhau, hoặc hai hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau tạo ra hợp chất lai có tính năng vượt trội so với các chất ban đầu. Đây là hướng nghiên cứu mới và rất được quan tâm hiện nay. Phản ứng “Click" là phương pháp hiệu quả để tổng hợp các dẫn xuất triazol, đặc biệt là tổng hợp các hợp chất lai có cầu nối triazol. Triazol là những hợp chất dị vòng có hoạt tính sinh học lý thú. Một số hợp chất triazole đã được sử dụng trong dược phẩm như thuốc chống nấm miconazol, fluconazol, thuốc chống ung thư letrozol… Hoạt tính sinh học của các triecpenoit rất đa dạng bao gồm: hoạt tính chống ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, chống ký sinh trùng, kháng virus, chống dị ứng, chống co thắt, kháng viêm và các đặc tính điều hòa miễn dịch hoặc thuốc bổ. Ngoài ra, một số tritecpenoit còn có thể được sử dụng như chất kháng côn trùng. Axit betulinic, betulin, axit oleanolic và axit ursolic là triterpenoit có hoạt tính chống HIV, kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống ung thư [42-44]. Do có nhiều hoạt tính sinh học rất có giá trị như vậy, việc nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất tritecpenoit nhằm tìm ra các hợp chất mới là có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Hợp chất nucleoside AZT ức chế enzym phiên mã ngược cuả virút HIV được sử dụng để điều trị bệnh HIV. Hiện nay, tổng hợp các chất lai giữa các nucleozit với các thuốc chống HIV khác đã được nghiên cứu. Tuy nhiên, các chất lai giữa triterpenoit và AZT rất ít được nghiên cứu. 1 O O NH HO O R'' R' R O H O R'' N R' n H N O H HO O N n H N NH R A O N H N N N O H H N B Hình 1. Hợp chất lai triterpenoit-AZT Việc phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ là một trong số các nhiệm vụ quan trọng của Hóa học vì chỉ khi biết chính xác cấu trúc, chúng ta mới có câu trả lời chính xác cho việc định tính, định lượng và phân tích chúng trong các mẫu nghiên cứu thực cũng như trong đời sống và công nghệ. Vì vậy, luận văn đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Phân tích cấu trúc của một số hợp chất lai giữa tritecpenoit và chất có hoạt tính kháng HIV ”. Mục tiêu chính của luận văn: Phân tích cấu trúc của một số sản phẩm chuyển hóa giữa tritecpenoit và chất có hoạt tính kháng HIV bằng các phương pháp phổ. 2 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về các phương pháp phân tích 1.1.1. Các phương pháp chiết Phương pháp chiết xuất bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ và cách chiết. Một phương pháp chiết xuất thích hợp chỉ có thể được hoạch định khi biết rõ thành phần của các chất cần biết trong cây ra. Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi. Vì vậy không thể có một phương pháp chiết xuất chung cho tất cả các dược liệu. Về nguyên tắc có hai phương pháp chiết: Phương pháp 1: Phương pháp chiết xuất nhằm mục đích nghiên cứu sơ bộ khi chưa biết rõ thành phần hóa học của dược liệu, dùng phương pháp cổ điển là sử dụng một dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh để phân đoạn các hợp chất ra khỏi dược liệu. Ví dụ: sử dụng dãy dung môi: ete dầu, ete, clorofoc, cồn và cuối cùng là nước. Phương pháp 2: Phương pháp chiết xuất khi cần chiết lấy toàn bộ thành phần trong dược liệu thì dung môi thích hợp nhất metanol hoặc etanol (60%). Nhất là etanol được xem như là dung môi có thể hòa tan được chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với các nhóm phân cực khác. Dịch chiết với etanol thu được, đem loại hết dung môi thu được cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất của dược liệu. Khi cần tách phân đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng dung môi không hòa lẫn với nước và có độ phân cực từ yếu đến mạnh. Ví dụ dãy dung môi: Ete dầu, ete, clrofoc, etyl axetat, n-butanol. Cách chiết có hai cách chiết chiết ở nhiệt độ thường và chiết nóng. + Chiết ở nhiệt độ thường: Cách chiết thông thường là ngấm kiệt và ngâm phân đoạn. + Chiết nóng: Nếu dung môi là các chất bay hơi thì áp dụng cách chiết liên tục hoặc chiết hồi lưu, nếu dung môi là nước thì sắc đặc hoặc là hãm phân đoạn. 3 Để thu hồi dung môi, sử dụng máy cô quay chân không dưới áp suất giảm cho hiệu suất cao. 1.1.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất Để phân tích, phân tách các phần chiết và phân lập các hợp chất đã sử dụng các phương pháp chiết, các phương pháp chiết hai pha rắn - lỏng, chiết hai pha lỏng - lỏng, các phương pháp sắc ký phân tích như sắc ký lớp mỏng (TLC), các phương pháp sắc ký điều chế như sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC), sắc ký cột tinh chế (Mini-C), sắc ký cột pha đảo (RP-CC) và các phương pháp kết tinh chọn lọc. 1.1.2.1. Phương pháp chiết hai pha lỏng Phương pháp dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha lỏng không hòa trộn (một pha nước và một pha hữu cơ). Các hợp chất hữu cơ sẽ được chuyển từ một pha nước sang một pha hữu cơ còn các chất nền phân cực sẽ ở lại trong pha nước. Quá trình chiết có thể được thực hiện ở các điều kiện được kiểm soát ví dụ như pH, độ phân cực của dung môi chiết, tỷ lệ thể tích pha hữu cơ/pha nước, nhiệt độ,… 1.1.2.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng trên silicagel là phương pháp thích hợp cho phân tích các hợp chất hữu cơ. Vì sự phân tích TLC trên silica gel là một quá trình hấp phụ các hợp chất được phân tách theo độ phân cực theo cách tương tự như trong sự phân tách sắc ký cột. Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích để lụa chọn các hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột. Để định tính các hợp chất, các giá trị Rf và màu sắc của các vệt chất được phát hiện trên bản mỏng TLC cần được mô tả. Dựa vào sắc ký đồ TLC có thể đánh giá định tính số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silicagel tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với chiều dày lớp silica gel là 0,2 mm. Đưa mẫu phân tích lên bản mỏng: Hòa tan mẫu thử trong dung môi thích hợp (1 mg/ml), sau đó dùng capilla đưa dung dịch mẫu thử lên bản mỏng (10 l). 4 Dung môi triển khai: Các dung môi dùng trong TLC đều được làm khan và chưng cất lại trước khi sử dụng. Các hệ dung môi được trộn theo tỷ lệ phù hợp với từng mẫu phân tích. Sau khi pha phải lắc kỹ cho các dung môi trong hệ trộn đều nhau rồi cho vào bình triển khai sắc ký đáy bằng, có nút nhám kín đến chiều cao 0,5 cm. Để yên đến khi bình được bão hòa dung môi mới tiến hành triển khai bản mỏng. Triển khai bản mỏng: Bản mỏng được cắt với kích thước phù hợp với tuyến xuất phát của dung môi, dung môi có chiều cao 1 cm. Dùng kẹp sắt đưa nhanh bản mỏng đã được tẩm mẫu vào bình triển khai sắc ký, đậy kín nắp, để yên và quan sát. Khi quan sát thấy dung môi đã chạy đến tuyến dung môi trên, dùng kẹp sắt lấy bản mỏng ra khỏi bình và tiến hành phát hiện vệt chất trên bản mỏng. Phát hiện vệt chất trên bản mỏng: Bản mỏng được phun các thuốc hiện FeCl3/EtOH 5% và vanillin/H2SO4 đặc 1%, sau đó được hơ nóng ở 120 0C, đánh dấu vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị Rf và ghi màu sắc của các vệt chất. 1.1.2.3. Sắc ký cột thường Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi. Cột sắc ký được thiết kế với khóa dưới và nhám trên có đường kính trong và chiều cao tùy theo lượng mẫu cần phân tách. Chấp hấp phụ dùng cho CC là silica gel (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với các cỡ hạt 63-200 m và 40-63 m. Dung môi hữu cơ dùng cho sắc ký cột được làm khan, chưng cất lại và bảo quản trong bình kín trước khi sử dụng. Nhồi cột sắc ký: Phương pháp nhồi cột ướt: Một lượng silicagel ứng với cột sắc ký có đường kính thích hợp, có chiều cao là 30 cm được khuấy đều thành bột nhão trong một lượng vừa đủ n-hexan khan. Bột nhão này được đuổi hết bọt khí và được nhồi vào cột sắc ký. Có thể dùng bơm nén hoặc trọng lực dung môi n-hexan đi qua cột nhiều lần cho đến khi lớp silica gel hoàn toàn ổn định. 5 Đưa mẫu lên cột sắc ký: Phương pháp tẩm mẫu trên silicagel: Mẫu được hòa tan trong một lượng vừa đủ dung môi dễ bay hơi thích hợp. Trộn dung dịch thu được với silicagel (cỡ hạt 40-63 m) với tỷ lệ là 1 g chất /1,2 g đến 1,5 g silicagel. Hỗn hợp này được làm bay hơi dung môi đến khi khô kiệt thu được bột mịn của mẫu chất hấp phụ trên silicagel. Bột này được đưa lên cột sắc ký phía trên lớp chất hấp phụ silica gel. Triển khai sắc ký cột: Mở khóa dưới cột sắc ký để cho dung môi chảy ra khỏi cột sắc ký, cho đến khi bề mặt dung môi cách bề mặt silicagel khoảng 2 mm. Cho từ từ mẫu tẩm trên silicagel lên cột. Khi đưa mẫu lên cột cần phải chú ý đảm bảo cho bề mặt của lớp chất phía trên cột sắc ký tạo thành mặt phẳng ngang. Rắc một lớp cát lên phía trên để tránh các chất bột bị hòa tan ngược. Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi được xác định nhờ vào các khảo sát thăm dò TLC, tốc độ rửa giải 20 giọt/phút, thu các phân đoạn theo thể tích 150 ml, 50 ml và 20 ml (CC, FC). Với cột sắc ký tinh chế (Mini-C) các phân đoạn được thu theo thể tích 3-5 ml. Khảo sát sắc ký các phân đoạn: Tiến hành khảo sát các phân đoạn nhận được bằng TLC, gộp các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau lại, sau đó cất loại kiệt dung môi để thu được các nhóm phân đoạn. 1.1.2.4. Phương pháp kết tinh lại Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để phân lập và tinh chế chất rắn. Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của chất và tạp chất trong dung môi hoặc hệ dung môi đã chọn và độ tan của chất ở các nhiệt độ khác nhau. 1.1.3. Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp giữa việc xác định các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại. Tuy nhiên, phương pháp phổ biến nhất là các phương pháp đo phổ như: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT,…). 6 * Phổ hồng ngoại (IR) Phổ hồng ngoại cho nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất [18-19]. Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định. Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân tử. Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân ngón tay. Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau. Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng. Các pic nằm trong vùng từ 4000 - 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ từ 1300 - 626 cm-1 phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay. * Phổ khối lượng (MS) Phổ khối lượng dựa trên sự phân tách chất tương ứng khối lượng phân tử và nguyên tử bằng cách sử dụng từ trường và điện trường để tác động lên các hạt tích điện (ion) trong chân không. Phổ khối không xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định tỉ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z). Ở các phân tử nhỏ, điện tích của ion thường là 1 nên giá trị m/z của phổ khối liên quan trực tiếp tới khối lượng của ion. Dưới những điều kiện nhất định, phân tử các chất bị mất đi electron tạo nên ion phân tử (hay còn gọi 7 la ion mẹ) M+. Ion mẹ này có thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnh nhỏ hơn là các ion con và các mảnh trung hòa. Vì khối lượng của các electron rất nhỏ có thể bỏ qua, nên khối lượng của M+ chính là khối lượng của phân tử [18-19]. * Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân viết tắt là NMR (Nuclear Magnetic Resonance), là một phương pháp phân tích hiện đại, được sử dụng rộng rãi trong hóa học. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc các hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ ( 1H và 13 C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học [18-19]. Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR độ chuyển dịch hoá học của các proton được xác định trong thang TMS từ 0 ppm đến 14 ppm tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của phân tử. Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau và vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ chuyển dịch hoá học khác nhau. Dựa vào độ chuyển dịch hoá học, diện tích pic cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất. Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu phổ vạch carbon. Mỗi nguyên tử carbon ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm). Phổ DEPT: Phổ này cho các tín hiệu phổ phân loại các bậc carbon khác nhau. Trên phổ DEPT 135 không cho tín hiệu của carbon bậc 4, tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía, còn tín hiệu của CH2 nằm về phía đối diện. Trên 8 phổ DEPT 90 chỉ có duy nhất tín hiệu phổ của CH. Kết hợp phổ 13C-NMR và phổ DEPT sẽ cho ta biết chính xác số carbon bậc 1, 2, 3, 4. 1.2. Tổng quan về betulin Betulin hay 20(29)-lupene-3,28-diol (1), lần đầu tiên được phân lập vào năm 1788 từ loài Betula alba (Betulaceae), là một trong các hợp chất thiên nhiên phổ biến thuộc nhóm tritecpenoit khung lupan.Trong tự nhiên, betulin được tìm thấy ở nhiều loài thực vật, nhiều nhất là trong thành phần vỏ cây bạch dương (chiếm tới 30% trọng lượng khô của dịch chiết từ vỏ của loài B. verrucosa). Một lượng betulin cũng được tìm thấy ở nhựa của loài cây này [1] và được phát hiện có nhiều hoạt tính như hoạt tính gây độc tế bào đối với tế bào ung thư da, ung thư não và nhiều dòng tế bào ung thư ở người [12-14] và hoạt tính chống HIV [15-17]. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng betulin có khả năng ức chế sự trưởng thành của các Protein điều tiết sterol (SREBPs) [2]. Sự ức chế SREBPs của betulin làm giảm sinh tổng hợp cholesterol và axit béo. Trong thử nghiệm lâm sàng, betulin cải thiện tình trạng béo phì do chế độ ăn uống gây ra, làm giảm lượng lipid trong huyết thanh và các mô, và làm tăng độ nhạy của insulin. Hơn nữa, betulin giảm kích thước và cải thiện sự ổn định của mảng xơ vữa động mạch. Do tính sẵn có và là một tritecpenoit thiên nhiên có hoạt tính sinh học tốt nên betulin được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu các dẫn xuất của betulin trong đó có nhiều dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học cao, nhiều hợp chất được nghiên cứu lâm sàng [12-14, 22]. Hình 1.1. Một số dẫn xuất este của betulin có hoạt tính gây độc tế bào 9 Rất nhiều dẫn xuất của betulin được tổng hợp và kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học của chúng cho thấy nhiều dẫn xuất este của betulin có hoạt tính gây độc tế bào rất tốt (hợp chất 2, 3). Nghiên cứu trên nhiều dẫn xuất este của betulin, Kommera và các cộng sự nhận thấy nếu giữ nhóm OH tự do ở C-3 và este hóa nhóm OH ở C-28 (2 và 3) thì hoạt tính chống ung thư của các dẫn xuất có xu hướng tăng mạnh. Bên cạnh đó, các dẫn xuất este hóa nhóm OH ở C-3 và giữ nhóm OH tự do ở C-28 có hoạt tính tốt hơn betulin nhưng giảm mạnh so với các dẫn xuất C-28 (hợp chất 4 và 5) [4]. Việc nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất có hoạt tính gây độc tế bào của betulin vẫn đang là mối quan tâm của các nhà khoa học. Thuốc dạng deoxynucleozit như Zidovudin (3'-azido-3'deoxythymidin hay AZT), là nucleozit đã được sử dụng trong lâm sàng để chữa HIV. Thuốc này cũng được biết đến như là các hoạt chất kháng retrovirus tiềm năng [5-7], và hoạt chất kháng ung thư [8-11]. Do đó việc lai hóa các thuốc AZT với betulin qua các nhóm cầu nối khác nhau hứa hẹn sẽ tạo ra nhiều hợp chất lai có hoạt tính sinh học có giá trị. 10 Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và thiết bị 2.1.1. Hóa chất và dung môi Các hoá chất dùng cho chuẩn bị mẫu hữu cơ và dung môi được mua của hãng Merck, hãng Sigma Aldrich và hãng Fluka và thuộc loại phân tích dùng cho phân tích. Bột silicagel cho sắc ký cột 100 - 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silicagel đế nhôm Art. 5554 DC - Alufolien Kiesel 60F254(Merck). 2.1.2. Thiết bị xác định cấu trúc Để xác định cấu trúc các mẫu chất hữu cơ, chúng tôi tiến hành các phương pháp sau: - Xác định nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo trên máy đo trên máy Gallenkeamp của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ - Viện hóa học - Viện Hàn Lâm khoa học & Công nghệ Việt Nam. - Phổ hồng ngoại (IR) Phổ IR của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Impact 410 Nicolet, tại phòng thí nghiệm Phổ hồng ngoại Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, đo ở dạng ép viên với KBr rắn. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13 C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500MHz với dung môi DMSO và TMSlà chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân - Viện Hóa học Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam. 2.1.3. Xác định cấu trúc của các mẫu chất hữu cơ chuẩn bị được Cấu trúc của các mẫu chất hữu cơ chuẩn bị được, được xác định nhờ các phương pháp phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR, 13C-NMR, phổ hồng ngoại (IR). 11 2.2. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc một số dẫn xuất của tritecpenoit Sơ đồ 3.1. Tổng hợp các chất lai betulin và AZT qua cầu este-triazol 2.2.1. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc chất 6a-b * Chuẩn bị mẫu: Hỗn hợp gồm 1,0 mmol betulin (1) và 1,2 mmol Et3N trong 5ml diclometan được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Thêm 4,0 mmol anhidrit axit dicacboxylic tương ứng vào bình phản ứng và tiếp tục khuấy trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc, dung môi được loại bỏ ở áp suất thấp. Hỗn hợp phản ứng được chiết bằng etyl axetat (3 x 20 ml). Pha hữu cơ được làm khan bằng Na2SO4, loại bỏ dung môi, thu được sản phẩm là dẫn xuất este của betulin (các hợp chất 6 a-b tương ứng).Các sản phẩm được làm sạch bằng sắc kí cột trên silica gel với hệ rửa là n-hexan/etyl axetat (8:2). 12