Tài liệu Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn khả năng sinh cellulase từ đất tại xuân hoà phúc yên vĩnh phúc

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH- KTNN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE TẠI XUÂN HÒA- PHÚC YÊN- VĨNH PHÚC Chuyên ngành: Vi sinh vật Xuân Hòa- 2010 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình chỉ bảo, hướng dãn em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô trong tổ vi sinh đã chỉ bảo và giúp đỡ để em có thể hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này. Em cũng xin chân thành cảm ơn ban chủ nhiệm khoa SinhKTNN và ban giám hiệu nhà trường đã tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này. Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn! Xuân Hòa , tháng 05 năm 2010 Sinh viên Hoàng Mai Linh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên cứu , số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với kết quả của tác giả khác. Tác giả Hoàng Mai Linh CÁC TỪ VIẾT TẮT VSV : Vi sinh vật ISP : International Steptomyces Project N : Nitơ C : Cacbon CFU : Colony Forming Unit HSKS : Hệ sợi khí sinh HSCC : Hệ sợi cơ chất MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU…………………………………………………………..........1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………...4 1.1 Vị trí và phân loại xạ khuẩn………………………………............4 1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn………………………………….9 1.3 1.4. Cellulose và cellulase……………………………………………...12 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase ở Việt Nam và trên thế giới …………………………………………………………………………….14 CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU………..15 2.1. Vật liệu…………………………………………………………….15 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………..18 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………..20 3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn từ đất…………………………………..20 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng đã phân lập đƣợc……………….23 3.3. Xác định khả năng sinh cellulase của xạ khuẩn…………………….30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………..34 1. Kết luận……………………………………………………………..34 2. Kiến nghị……………………………………………………………34 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………35 DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH TRONG KHÓA LUẬN BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất mùn 20 3.2 Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất ruộng 21 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 24 3.4 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 26 3.5 Hình dạng cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn 3.6 nghiên cứu 28-29 Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa 30 CMC 3.7 Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa bột giấy 31 HÌNH Hình Tên hình Trang 3.1 22-23 3.2 Một số chủng xạ khuẩn phân giải cellulose phân lập từ đất Khuẩn lạc xạ khuẩn 3.3 Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập 27-28 3.4 Hình ảnh cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc 29-30 3.5 Hình ảnh hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 32-33 25 Khãa luËn tèt nghiÖp §H Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Xạ khuẩn cư trú chủ yếu trong đất, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành và phát triển của đất. Xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững như cellulose, chất mùn, kitin, keratin, lignin…góp phần khép kín các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Xạ khuẩn còn giúp tích lũy chất mùn làm nên độ phì nhiêu của đất. Ngày nay xạ khuẩn được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp lên men (sản xuất axit hữu cơ như lactat, axetat, glutamat…). Chế biến tạo các sản phẩm enzyme, ứng dụng enzyme do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều như: cellulase, proteinase… Hầu hết các loài xạ khuẩn thuộc giống Actinomyces đều có khả năng hình thành kháng sinh (streptomicine, oreomicine…), một số vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12) chúng được ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm, y học…[1]. Cellulose là thành phần chủ yếu tạo lên bộ khung xương tế bào thực vật. Trung bình mỗi năm ước tính có khoảng 30 tỉ tấn chất hữu cơ được cây xanh tổng hợp trên trái đất trong đó có 30% là thành tế bào thực vật, thành phần chủ yếu của thành là cellulose. Hàng năm trái đất phải nhận về một lượng chất thải khổng lồ (chất thải sinh hoạt, chất thải thực vật như lá, cành …, chất thải công nghiệp), thành phần chủ yếu của các loại chất thải này là cellulose. Để phân giải lượng lớn cellulose này khu hệ vi sinh vật trong đất đóng vai trò không nhỏ, muốn làm được điều đó các vi sinh vật phải sản sinh ra cellulase, enzyme này đóng vai trò phân giải cellulose. Ngoài protenase ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa, amylase trong công nghiệp rượu, bia thì cellulase cũng là một trong những enzyme Hoµng Mai Linh -1- K32D - Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §H Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất giấy, công nghiệp may, sợi… Cellulase ứng dụng sản xuất thức ăn cho gia súc, xử lý chất thải nông nghiệp, sản xuất các loại đường probiotin mà nguyên liệu dùng ở đây chủ yếu là dùng vi sinh vật sống. Từ những lí do trên với mục đích tìm hiểu, làm quen với phương pháp nghiên cứu vi sinh vật (VSV) nói chung, phương pháp nghiên cứu xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase nói riêng, tôi chọn đề tài: “Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase từ đất tại Xuân Hòa- Phúc Yên- Vĩnh Phúc”. 2. Mục tiêu của đề tài - Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase ở các độ sâu: 0cm, 5cm, 10cm, 15cm, 20cm, 25cm, 30cm từ hai loại đất mùn và đất ruộng tại Xuân Hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc. - Nghiên cứu các đặc điểm hình thái: hệ sợi khí sinh (HSKS), hệ sợi cơ chất (HSCC), sắc tố tan, cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn phân lập được. - Thử hoạt tính enzyme cellulase của một số chủng xạ khuẩn phân lập được. 3. Nội dung của đề tài Đề tài “ Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase từ đất tại Xuân Hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc” để tìm hiểu: - Đặc điểm sự phân bố của xạ khuẩn và khẳng định được vai trò của chúng trong đất. - Nghiên cứu đặc điểm hình thái (HSKS, HSCC, sắc tố tan, cuống sinh bào tử…). - Thử hoạt tính sinh cellulase của xạ khuẩn phân lập từ đất. Hoµng Mai Linh -2- K32D - Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §H Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 4. Ý nghĩa của đề tài Đề tài góp phần tạo cơ sở khoa học cho các phương thức canh tác, cày xới, cải tạo đất, bón phân… theo hướng lợi dụng VSV phân giải cellulose, tăng cường các quá trình phân giải hợp chất hữu cơ để làm giàu dinh dưỡng cho đất, tăng năng suất cây trồng. Mặt khác đề tài còn cho phép tuyển chọn những chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase cao, từ đó có thể tạo ra các chế phẩm VSV chớ các chủng xạ khuẩn này phục vụ cho việc xử lí rác thải (ủ rác sinh học), chế biến thức ăn gia súc probiotin… Hoµng Mai Linh -3- K32D - Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §H Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vị trí và phân loại xạ khuẩn 1.1.1. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới Theo Krassinikov, xạ khuẩn được tách thành lớp riêng gồm xạ khuẩn bậc cao có hệ sợi phát triển, có cơ quan sinh sản riêng và xạ khuẩn bậc thấp có hệ sợi không phát triển, tế bào hình que hoặc hình cầu. Trong cuốn “Bergey’s Manual” (1989) Bergey xếp xạ khuẩn vào bộ riêng (Actinomycetales). Bộ xạ khuẩn thuộc lớp Thallobacteria, ngành Firmicutes, giới Bacteria, siêu giới Prokaryota. Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc nhóm VSV nhân nguyên thủy (Procaryota) thuộc giới khởi sinh (Monera) trong hệ thống phân loại năm giới hay bảy giới thì xạ khuẩn đều thuộc giới vi khuẩn chuẩn (Eubacteria), thuộc siêu giới nhân sơ. Bộ xạ khuẩn bao gồm 10 họ : - Actinomycetaceae - Actinoplanaceae - Permatophilaceae - Frankiaceae - Micramonosporaceae - Thermonosporaceae - Mycobacteriaceae - Norcarddiceae - Streptomycetaceae Hoµng Mai Linh -4- K32D - Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §H Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 Trong đó Streptomycetaceae là loại xạ khuẩn có hệ sợi giống nấm và được nghiên cứu khá kĩ. 1.1.2. Phân loại xạ khuẩn 1.1.2.1. Lƣợc sử phân loại xạ khuẩn Krainki lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu mới trong việc phân biệt các loài khác nhau và đã sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi Actinomyces. Ông coi các đặc điểm sinh lí, sinh hóa là mấu chốt trong nguyên tắc phân loại [8]. Waksman và Cutis đã đề cập đến dạng trung gian trong mô tả phân loại của mình và coi đặc điểm hình thái bào tử là đặc tính quan trọng nhất của các cá thể và đưa ra một số loài mới có ý nghĩa [8]. Millard và Burr tìm ra 17 loại, Jensen tìm ra 2 loại mới, Dutche tìm ra 13 loại mới [8]. 1chi Streptomyces dựa trên HSKS, HSCC và một số đặc điểm trung gian khác [8] Waksman và Henrici đã đưa ra hệ thông phân loại và đến năm 1961 hệ thống phân loại này đã được sửa đổi lại. Trong hệ thống phân loại này thì xạ khuẩn được xếp thành 3 họ, 10 chi và đã mô tả được hơn 250 loài thuộc chi Streptomyces. Hệ thống phân loại này dựa vào màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng bào tử, chuỗi bào tử…[8]. Krassinicov công bố hệ thống phân loại nấm tia mới dựa tên hệ thống đã công bố năm 1949, trong đó xạ khuẩn được chia thành 6 họ với 26 chi [8]. Những năm gần đây các hệ thống phân loại ngày càng nhiều, để thống nhất trong cách mô tả, ISP (International Streptomyces Project) đã nêu lên các phương pháp và môi trường mô tả [9]. 1.1.2.2. Một số phƣơng pháp trong phân loại xạ khuẩn Nhờ sự phát triển nhanh chóng của khoa học kĩ thuật, số lượng xạ khuẩn được mô tả ngày càng nhiều và chính xác dựa trên cơ sở sự phát triển Hoµng Mai Linh -5- K32D - Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §H Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 của sinh học phân tử, hóa sinh học, lí sinh học… Để phân loại nhanh chóng và chính xác, người ta sử dụng phân loại số (Numberical taxonomy), nghiên cứu chủng loại phát sinh ( Phylogeny taxonomy). Tuy nhiên hiện nay trong thực nghiệm, người ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc điểm sinh lí, sinh hóa , miễn dịch học và sinh học phân tử. 1.1.2.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy Dựa vào đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy người ta chia xạ khuẩn ra làm 4 nhóm chính: - Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và phân hóa thành HSKS, HSCC. - Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hướng vuông góc với nhau tao thành cấu trúc tương tự nang bào tử. - Nhóm 3: Gồm các xạ khuẩn có dạng Norcadia, sinh sản bằng phân đốt hệ sợi. - Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào có hình chữ T, V và thường không có hệ sợi. Trong những năm gần đây, dựa vào nghiên cứu xạ khuẩn trên các môi trường khác nhau, người ta chia hình dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn thành 6 kiểu: - Kiểu S: Type “Sprina” – chuỗi bào tử xoắn. - Kiểu SRA: Type “Sprina- Rectinaculum- Apertum” – chuỗi bào tử xoắn có dạng móc câu hay xoắn không hoàn toàn. - Kiểu SRF: Type “Spirina- Rectus- Flexibilis” - chuỗi bào tử xoắn, cong đến thẳng. - Kiểu RA: Type “Rectinaculum- Apertum” - chuỗi bào tử có móc, có khóa. Hoµng Mai Linh -6- K32D - Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §H Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 - Kiểu RA- RF : Type “Rectinaculum Apertum- Rectus Flexibilis” – chuỗi bào tử có dạng móc hay xoắn không hoàn toàn. - Kiểu RF : Type “Rectus- Flexibilis” – chuối bào tử thẳng đến lượn sóng. Hiện nay có rất nhiều khóa phân loại xạ khuẩn nhưng có thể gộp thành hai hệ thống sau đây : 1. Hệ thống phân loại chủ yếu giựa vào đặc điểm hình thái để phân loại nhóm lớn như họ, giống. Các phân loại thấp hơn loài thì dùng đặc điểm nuôi cấy, sinh lí, sinh hóa để phân loại [8] 2. Hệ thống phân loại chủ yếu giựa vào các đặc điểm sinh lí như màu sắc hệ sợi… để phân nhóm, sau đó dùng các đặc điểm nuôi cấy để phân loại đến loài. Nhóm hệ thống này của Waksman, Gause… các tác giả đều thống nhất lấy đặc điểm sử dụng nguồn nitơ, cacbon làm yếu tố bổ sung cho phân loại đến loài. 1.1.2.2.2. Đặc điểm hóa phân loại Phương pháp hóa phân loại dựa vào các dữ liệu về định tính, định lượng các thành phần hóa học trong tế bào VSV để phân loại, chủ yếu là các đặc điểm sau : - Type thành tế bào - Type peptidoglucan - Axit mycolic - Axit béo - Menaquinon - Type photpholipit Trong type thành tế bào, người ta phân thành tế bào xạ khuẩn thành 4 dạng : + Type I: Thành tế bào có L- ADP và glixin + Type II: Thành tế bào có m- ADP và glixin Hoµng Mai Linh -7- K32D - Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §H Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 + Type III : Thành tế bào có m- ADP + Type IV : Thành tế bào có m- ADP, đường arabinose, galactose Trong type peptidoglucan người ta chia xạ khuẩn thành : Type Type phụ A (3-4) B (2-4) Cầu liên kết A1 - Liên kết peptide trực tiếp A2 - Chuỗi peptide bên A3 - Glycerol hoặc axit monocacboxylic A4 - Axit dicacboxylic B1 - Axit được diamine hóa B2 - Các axit amin được diamine hóa 1.1.2.2.3. Phân loại số Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về mức độ giống nhau giữa các VSV trong một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lí để so sánh các chủng với nhau từng đôi một theo công thức sau : SAB = nS*100/ ( nS + nd ) Trong đó : - SAB: mức độ giống nhau giữa hai cá thể - nS: tổng số các đặc điểm dương tính của 2 chủng so sánh - nd: tổng số các đặc điểm dương tính của chủng này mà âm tính của chủng kia Kết quả này được biểu hiện trên sơ đồ nhánh và tùy thuộc mức độ giống nhau mà các VSV được xếp vào các nhóm. 1.1.2.2.4. Nghiên cứu về phát sinh chủng loại Nhờ sự sắp xếp phát sinh chủng loại mà các sinh vật được xếp vào hệ thống phân loại gần tự nhiên hơn. Các nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng cách tiến hành so sánh các cao phân tử ADN, ARN, protein Hoµng Mai Linh -8- K32D - Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §H Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 mà quan trọng hơn cả là sự sắp xếp các nucleotit của rARN 16S. Mức độ giống nhau giữa hai cá thể so sánh thể hiện mối quan hệ giữa chúng. 1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Tùy loại môi trường mà xạ khuẩn có hình thái khác nhau. Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc. Tùy theo loài, môi trường nuôi cấy mà kích thước màu sắc khuẩn lạc có thể khác nhau như : đỏ, da cam, vàng, nâu, hồng, xám… Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng nhung tơ, hay dạng màng dẻo và thường có cấu trúc 3 lớp : lớp ngoài có cấu trúc sợi bền chặt, lớp giữa có dạng cấu trúc tổ ong và lớp trong cùng có cấu trúc tương đối xốp. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hướng sinh trưởng trong môi trường tạo ra HSCC và mặt ngoài môi trường tạo ra HSKS. Đường kính hệ sợi xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,2-1,0µm đến 2,0-3,0µm . Đa số các xạ khuẩn có hệ sợi phân nhánh mạnh, không có vách ngăn. Màu sắc hệ sợi đa dạng, có thể gặp các màu trắng, vàng, da cam, nâu, tím, đen… HSCC có thể sinh ra các sắc tố tan trong nước hoặc tan trong dung môi hữu cơ. HSKS ở tận cùng thường là các chuỗi bào tử có dạng xoắn, lượn sóng, thẳng, vòng… Đây là đặc điểm khá quan trọng để phân loại xạ khuẩn [1] Các bào tử xạ khuẩn có thể có hình tròn, bầu dục, hình que, hay hình trụ… Cấu trúc bề mặt bào tử có thể có dạng nhẵn (Smooth), có gai (Spinny), khối u (Warty), nếp nhăn (Rugose) hay dạng tóc (Hairy). Hình dạng, kích thước, cấu trúc bề mặt bào tử cũng là một trong những chỉ tiêu quan trọng để định loại xạ khuẩn [1]. Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc thành dạng màng hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy, trên bề mặt môi trường hay thành dạng bọt hoặc kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên máy lắc hoặc nồi lên men được khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng Hoµng Mai Linh -9- K32D - Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §H Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 sợi bông hoặc cặn xốp. Nhưng thường gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành những quả cầu nhỏ chứa đầy môi trường, kích thước từ 0,1mm đến 2-3mm. 1.2.2. Cấu tạo của xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu tạo tương đối giống vi khuẩn gồm có thành tế bào, màng tế bào chất, vật chất nhân sơ và các hạt dự trữ. Xạ khuẩn thuộc nhóm VSV Gram (+). Thành tế bào dày khoảng 20nm có vai trò duy trì hình dạng hệ sợi và bảo vệ tế bào, được cấu tạo chủ yếu gồm các lớp glucopeptit, các gốc N-Acetylglucosamine liên kết với N-Acetylmuramic (hoặc NGlycolylmuramic, ví dụ như chi Micromonospora). Căn cứ vào kết cấu hóa học có thể chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4 nhóm sau : - Nhóm 1 (Type I): có chứa L-ADP (L-Diaminopimelic) và glixin. Gồm có các chi Streptomyces, Norcardioider… - Nhóm 2 (Type II): có chứa m-ADP (meso- Diaminopimelic) và glixin. Gồm các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella… - Nhóm 3 (Type III): có chứa m-ADP (meso- Diaminopimelic). Gồm có Actinomadura, Actinobigfida, Micronobispora… - Nhóm 3 (Type III):có chứa m-ADP (meso- Diaminopimelic) , đường arabinose, galactose. Gồm có Norcadia, Pseudonocardia, Mycrobacterium… 1.2.3. Đặc điểm sinh lí , sinh hóa của xạ khuẩn Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon. Còn nitrat, nitrit, muối amon, ure, pepton, cao thịt… để làm nguồn nitơ. Ở các loài khác nhau thì khả năng hấp thụ các hợp chất này là khác nhau. Phần lớn xạ khuẩn là VSV hiếu khí, ưa ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và phát triển là 25-300C. Đa số xạ khuẩn phât triển tốt trong môi trường kiềm. Hoµng Mai Linh - 10 - K32D - Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §H Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), đặc biệt khác với các sinh vật khác của nhóm nhân sơ có tỉ lệ (G+X) cao (trên 70%), trong khi đó vi khuẩn khá thấp (25-45%). Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN. Điều này gây ra tính đa dạng của hình thái, tính chất, sinh lí, sinh hóa của xạ khuẩn (khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính kháng sinh, tính kháng thuốc, khả năng phân giải cellulose…). 1.2.4. Phân bố của xạ khuẩn Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Xạ khuẩn có thể phân lập từ đất, nước, không khí, bùn, rác thải…Đặc biệt trong đất xạ khuẩn chiếm số lượng rất lớn. Theo Waksman thì trong đất xạ khuẩn chiếm 9-45% tổng số các VSV. Và trong 1g đất có chứa tới 29.00024.000.000 mầm xạ khuẩn. Tuy nhiên tùy vùng đất khác nhau trên thế giới mà có sợ biến đổi lớn về số lượng xạ khuẩn trong đất, số lượng xạ khuẩn ở nam bán cầu bao giờ cũng cao hơn bắc bán cầu. Ngoài ra số lượng xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc vào mức độ canh tác, độ phì nhiêu của đất, mức độ che phủ của thực vật… Đất giàu dinh dưỡng, hữu cơ, khoáng thì có nhiều xạ khuẩn hơn so với đất nghèo dinh dưỡng. Trong 1g đất canh tác có thể phân lập được 5.000.000 CFU/g xạ khuẩn. Đất vùng sa mạc khô nóng, nghèo dinh dưỡng có số lượng xạ khuẩn ít hơn, không dao động trong khoảng 10.000 – 100.000 CFU/g. Xạ khuẩn là nhóm VSV ưa trung tính hay kiềm yếu, do đó sự phân bố của xạ khuẩn trong đất phụ thuộc vào độ pH của đất. Ở các đất có độ pH trung tính hoặc hơi kiềm thì có mật độ xạ khuẩn cao hơn so với các vùng đất có độ pH kiềm hoặc axit. Đồng thời số lượng xạ khuẩn còn phụ thuộc vào các thời điểm trong năm. Do đó khi lấy mẫu đất nghiên cứu cần phải chú ý tới các điều kiện như thành phần lớp đất, sinh cảnh, thời điểm lấy mẫu, độ ẩm, nhiệt độ… Hoµng Mai Linh - 11 - K32D - Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §H Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 1.2.5. Vai trò của xạ khuẩn Xạ khuẩn là một trong nhiều loại VSV có ý nghĩa trong tự nhiên bởi vai trò tích cực tham gia vào quá trình chuyển hóa những hợp chất trong đất, nước… Xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh, có 60-70% xạ khuẩn phân lập từ đất như Streptomyces, Actinomyces… có khả năng này, các chất kháng sinh do chúng sinh ra được sử dụng rộng rãi trong y học. Ngoài ra xạ khuẩn còn có khả năng phân giải cellulose trong bã thải nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm để chế biến thức ăn gia súc probiotin, phân bón hữu cơ, xử lí rác thải… 1.3. Cellulose và cellulase 1.4.1. Cellulose Cellulose là một polysaccharite mạch thẳng gồm từ 1400- 12.000 gốc β-D-glucose liên kêt với nhau bởi các liên kết β-1,4-glucoside. Trong phân tử cellullose các phân tử β-D-glucose có cấu trúc không gian dạng ghế bành. Hai phân tử khác nhau quay góc với nhau 1800. Cellulose là loại hợp chất hữu cơ dồi dào trong tự nhiên chiếm tới 40-50% hydratcacbon. Cellulose có cấu trúc không gian dạng sợi song song, dài khoảng 5µm , đường kính 3nm. . Các sợi này liên kết với nhau bới các liên kết hidro và các liên kết vandervan tạo thành các bó sợi nhỏ có đường kính 10-40nm gọi là vi sợi (microfibrin). Các vi sợi có cấu trúc không đồng nhất tạo nên cấu trúc mixen của cellulose [8] Cellulose dạng mixen gồm 2 vùng : - Vùng kết tinh (Crystolline regions) : Có các hệ sợi chặt chẽ, đậm đặc ngăn cản sự hấp thụ nước và ít chịu tác động phân giải. Vùng này chiếm 3/4 cấu trúc cellulose. - Vùng vô định hình (Amorphous regions) : Có cấu trúc kém chặt chẽ, dễ bị trương lên và dễ bị phân giải. Hoµng Mai Linh - 12 - K32D - Sinh Khãa luËn tèt nghiÖp §H Tr-êng §HSP Hµ Néi 2 Trong tự nhiên cellulose khá bền vững, không tan và bị trương lên khi hấp thụ nước. Cellulose bị phân hủy khi đun nóng với axit hay kiềm ở nhiệt độ khá cao hoặc bị phân giải bởi các cellulose sinh ra từ nhiều loại sinh vật. 1.4.2. Cellulase Enzyme cellulase xúc tác cho qua trình chuyển hóa cellulose thành các sản phẩm hòa tan dễ sử dụng. Hệ thông cellulase gồm 3 loại chính sau: - Endo-β-glucanase hay 1,4-β-D-glucanhydronase, cellobiohydrolase (CBH), CMC-ase: Enzyme này tấn công vào các điểm khác nhau trên chuỗi cellulose của CMC, cellulose trương phồng, các celloligosaccharide. Chúng phân cắt các chuỗi cellulose một cách ngẫu nhiên, sản phẩm tạo thành là glucose và các oligosaccharide (có thể từ 3-6C hoặc nhiều hơn). Sự phân cắt này hình thành các đầu khử tự do, tạo điều kiện cho exoglucanase hoạt động. Bởi vậy cellulose vùng kết tinh được phân giải triệt để, hiệu quả. - Exo-β-glucanase hay 1,4- β-D-glucan cellobiohydronase, avicelase: enzyme này tấn công vào đầu không khử của cellulose và kết quả tạo ra các cellobinose. - β-glucosidase hay cellobinose: Thủy phân cellobinose và một vài celloligosaccharit thành glucose. Hoạt tính của β-glucosidase mạnh nhất trên cellobinose và giảm dần theo chiều dài chuỗi. 1.4.3. Hệ enzyme phân giải cellulose Một số nhóm VSV phân giải được cellulose là nhờ phức hệ enzyme cellulose gồm 4 enzyme khác nhau tác dụng với các mối liên kết của cellulose. Đầu tiên enzyme cellobihydrolase có tác dụng cắt đứt liên kết hidro, biến cellulose tự nhiên có cấu hình không gian thành dạng cellulose vô định hình không có cấu trúc lớp. Hoµng Mai Linh - 13 - K32D - Sinh