Tài liệu Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn nội sinh cây cà chua đối kháng với vi khuẩn ralstonia solanacearum

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ CHUA ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM Kiều Đức Toàn Đà Nẵng, năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ CHUA ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM Ngành: Công nghệ sinh học Khóa: 2018-2022 Sinh viên: Kiều Đức Toàn Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Minh Lý Đà Nẵng, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực. Đây là kết quả nghiên cứu của tôi và giảng viên hướng dẫn chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác trước đây. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa học. Tên SV Kiều Đức Toàn i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp tại Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài khoá luận của mình. Để hoàn thành được khoá luận tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi xin chân thành cảm ơn đến TS. Nguyễn Minh Lý đã tận tình hướng dẫn, khích lệ, động viên và định hướng cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp này. Cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi đạt được kết quả tốt nhất. Xin chân thành cảm ơn! ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................................ vii DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................................... ix TÓM TẮT ............................................................................................................................x MỞ ĐẦU..............................................................................................................................1 1. Đặt vấn đề ........................................................................................................................1 2. Mục tiêu của đề tài ...........................................................................................................2 3. Ý nghĩa .............................................................................................................................2 3.1. Ý nghĩa khoa học ..........................................................................................................2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...........................................................................................................2 2.3. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................................2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................4 1.1. Giới thiệu về vi khuẩn nội sinh thực vật .......................................................................4 1.1.1. Định nghĩa ..................................................................................................................4 1.1.2. Nguồn gốc và đa dạng vi khuẩn nội sinh ...................................................................4 1.1.3. Sự xâm nhập và vai trò của vi khuẩn nội sinh ...........................................................5 1.1.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ....................................................................8 1.2. Giới thiệu về Ralstonia solanacearum..........................................................................9 1.2.1. Bệnh héo xanh vi khuẩn .............................................................................................9 1.2.2. Phân loại của Ralstonia. solanacearum ...................................................................10 1.2.3. Đặc điểm hình thái, cấu tạo vi khuẩn Rastonia solanacearum ................................10 1.2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn Ralstonia solanacearum .........................10 iii 1.2.5. Các hình thức xâm nhập và triệu chứng và nguyên nhân phát sinh bệnh của vi khuẩn Ralstonia solanacearum .....................................................................................................11 1.2.6. Tình hình nghiên cứu bệnh HXVK ở Việt Nam và trên Thế giới ...........................12 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................14 2.1. Phạm vi nghiên cứu.....................................................................................................14 2.2. Vật liệu nghiên cứu .....................................................................................................14 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................14 2.3.1 Phương pháp thu mẫu ...............................................................................................14 2.3.2. Phương pháp phân lập ..............................................................................................14 2.3.3. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp mã vạch DNA ...........................................18 2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt lực đối kháng của vi khuẩn nội sinh ...........................20 2.3.5. Phương pháp khảo sát thử nghiệm khả năng chống chịu với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây con .................................................................................................20 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................22 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh .............................................................................22 3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn và định danh Ralstonia solanacearum .............................24 3.2. Kết quả định danh vi khuẩn Ralstonia solanacearum ................................................28 3.2.1. Kết quả phản ứng PCR với cặp mồi 759/760 và đoạn mồi 16S 23S .......................29 3.2.2. Kết quả giải trình tự vi khuẩn Ralstonia solanacearum ..........................................29 3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn Ralstonia solanacearum .....................................................................................................................30 3.4. Đánh giá một số hoạt tính sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn B01 và B02 .....................32 3.5. Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum của vi khuẩn nội sinh ở giai đoạn cây con .....................................................................................................33 3.6. Tái phân lập vi khuẩn và xác định tác nhân gây HXVK ............................................36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................................................39 1. Kết luận ..........................................................................................................................39 iv 2. Kiến nghị ........................................................................................................................39 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................40 PHỤ LỤC ...........................................................................................................................44 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid HXVK Héo xanh vi khuẩn NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction PGPB Plant Growth Promoting Bacteria TN Thí nghiệm VKNS Vi khuẩn nội sinh VSV Vi sinh vật vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Số thứ tự Tên hình hình Trang Hình 1.1 Ứng dụng của vi khuẩn nội sinh 16 Hình 3.1 Các vị trí khuẩn lạc được chọn 32 Hình 3.2 Kết phản ứng Colony - PCR với cặp mồi 759/760 32 Hình 3.3 Kết quả nuôi cấy khuẩn lạc trên môi trường TZC 33 Hình 3.4 Kết quả nuôi cấy từng vị trí của khuẩn lạc và nhuộm Gram vi khuẩn 34 Hình 3.5 Kết quả phản ứng Colony – PCR với cặp mồi 759/760 36 Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc và nhuộm Gram các chủng vi khuẩn 36 Hình 3.7 Kết quả phản ứng PCR với cặp mồi 759/760 và đoạn mồi 16S 23S 40 Hình 3.8 Kết quả thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán lỗ thạch 41 Hình 3.9 Kết quả thử nghiệm khả năng sinh enzyme của chủng B01 và B02 42 Hình 3.10 Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum của chủng vi khuẩn B01 và B02 ở giai đoạn cây con 43 Hình 3.11 Cây có triệu chứng nhiễm bệnh và cây khỏe mạnh 45 Hình 3.12 Tái phân lập vi khuẩn trên môi trường TZC 45 vii Hình 3.13 Kết quả sản phẩm PCR - Colony 46 viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Số thứ tự Tên bảng bảng Bảng 3.1 Kết quả giải trình tự vi khuẩn Ralstonia soalanacearum Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Trang 38-39 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn phân lập 46 Hoạt lực đối kháng của 2 chủng vi khuẩn nội sinh bằng khuếch tán lỗ thạch 48 Kết quả thử nghiệm phản ứng sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn B01 và B02 43 Bảng 3.5 Khảo sát trên cây con 44 Bảng 3.6 Hiệu suất khả năng giảm bệnh trên cây con 44 ix TÓM TẮT Vi khuẩn nội sinh hay còn gọi là endophytes, là những vi khuẩn sống cư trú bên trong mô của thực vật. Không những không gây hại cho kí chủ mà nó còn có tiết ra nhiều chất giúp tăng trưởng thực vật và còn có khả năng ức chế những tác nhân gây hại. Các vi khuẩn gây bệnh thực vật ảnh hưởng đến sức khỏe thực vật và là gánh nặng chính mối đe dọa đối với sản xuất lương thực và sự ổn định của hệ sinh thái. Đặc biệt là vi khuẩn Ralstonia solanacearum, gây héo nặng trên thực vật. Tăng cường sử dụng thuốc trừ sâu hóa học để kiểm soát bệnh hại cây trồng gây ra một số tác động tiêu cực đến con người và môi trường. Một trong những phương pháp thay thế là sử dụng vi khuẩn nội sinh thực vật. Tổng số 10 chủng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ cây cà chua tại địa bàn Thành phố Đà Nẵng. Trong đó tuyển chọn được chủng vi khuẩn B01 và B02 thuộc chi Bacillus là có khả năng ức chế vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua invitro. Chủng B02 làm giảm 86,01% tỉ lệ bệnh trên cây cà chua con còn chủng B01 làm giảm 77,76%. Từ khóa: Ralstonia solanacearum, Bacillus spp, đối kháng, héo xanh, vi khuẩn nội sinh. x MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Thực vật được coi là một hệ thống vi sinh phức tạp, nơi các môi trường sống khác nhau được khai thác bởi nhiều loại vi khuẩn (Kloepper và cs,1994). Những môi trường sống này không chỉ được thể hiện bởi bề mặt bên ngoài của thực vật, nơi vi khuẩn biểu sinh chiếm ưu thế, mà còn bởi các mô bên trong, nơi nhiều vi sinh vật xâm nhập và tồn tại (Cindy Lodewyckx và cs, 2002). Vi khuẩn nội sinh là những vi sinh vật sống trong các mô thực vật mà không gây ra bất kỳ tác động bất lợi nào cho vật chủ của chúng. Do những lợi ích khác nhau của vi khuẩn nội sinh, sự quan tâm đến chúng ngày càng tăng trong những năm gần đây và nhiều kết quả đã được công bố. Vi khuẩn nội sinh được biết đến để tăng cường cố định nitơ thực vật hoặc tiết ra các chất giống như hormone thực vật để thúc đẩy tăng trưởng, và cũng để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp đa năng, có các ứng dụng y tế và công nghiệp. Ngoài ra, kiểm soát bệnh thực vật bằng vi khuẩn nội sinh là một trong những đặc tính hữu ích vì bản thân nó có thể hỗ trợ nông nghiệp bền vững và chúng không gây ô nhiễm môi trường hoặc các tác động độc hại không giống như thuốc trừ sâu hóa học (Chi Eun Hong và cs, 2016). Bệnh hại cây trồng đã gây thiệt hại đáng kể trong sản xuất và bảo quản nông sản. Trong đó, phải kể đến bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra, bệnh này được coi là một trong năm loại bệnh cây trồng thuộc đối tượng quan tâm nhất của chương trình phòng trừ sâu bệnh tổng hợp của FAO (1992) và chịu sự kiểm soát chặt chẽ của kiểm dịch Quốc tế, nhất là các nước thuộc cộng đồng châu Âu (Lê Thị Thanh Thủy ,2015). Bệnh héo xanh là một bệnh rất khó phòng chống, bệnh không những xuất hiện ở cây cà chua mà còn ở các loài thực vật có giá trị kinh tế cao như khoai tây, ớt, vừng, lạc, đậu tương,... Hiện nay, công tác phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn còn gặp rất nhiều khó khăn và phức tạp (Lê Vũ Khánh Trang, 2020). Trước tình hình đó, đã có nhiều nghiên cứu về canh tác và chọn giống cây trồng, sử dụng thuốc hóa học bảo vệ thực vật cũng như áp dụng biện pháp kiểm soát sinh học bằng cách sử dụng các chế phẩm vi sinh chứa các chủng vi sinh vật đối kháng có khả năng ức chế và làm giảm tính độc của Ralstonia. 1 solanacearum. Tuy nhiên, các biện pháp vẫn còn hạn chế là: khả năng giảm tỉ lệ bệnh còn thấp, thời gian bảo quản chế phẩm ngắn, hiệu quả chưa cao nên chưa đáp ứng nhu cầu của thực tiễn. Trong khi đó, việc sử dụng thuốc hóa học để hạn chế vi khuẩn Ralstonia solanacearum không những không có hiệu quả mà còn gây ảnh hưởng xấu tới môi trường sinh thái, chất lượng sản phẩm và sức khỏe cộng đồng (Lê Thị Thanh Thủy ,2015). Do đó việc phân lập các chủng vi sinh vật vừa có khả năng đối kháng cao với chúng vừa cạnh tranh tốt với các vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, giảm thiệt hại kinh tế cho người nông dân và xã hội là việc làm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao (Lê Vũ Khánh Trang 2020). Vì việc tìm ra những chủng vi sinh vật có khả năng phòng trừ là rất cần thiết nên tôi thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn nội sinh cây cà chua đối kháng với vi khuẩn Ralstonia Solanacearum”. 2. Mục tiêu của đề tài Phân lập ra chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng đối kháng với vi khuẩn Ralstonia Solanacearum, phục vụ công tác trong phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn ở cây cà chua. 3. Ý nghĩa 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả đề tài nghiên cứu sẽ cung cấp một số dẫn liệu khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về vi khuẩn nội sinh thực vật. Cung cấp thêm một số thông tin, tài liệu cho quá trình học tập và nghiên cứu về lĩnh vực sinh học, công nghệ sinh học. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Ứng dụng, sử dụng vi khuẩn nội sinh như tác nhân kiểm soát sinh học có thể chống lại mầm bệnh héo xanh. 2.3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn nội sinh cây cà chua Nội dung 2: Phân lập và định danh vi khuẩn Ralstoni solanacearum 2 Nội dung 3: Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn nội sinh đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum invitro Nội dung 4: Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà chua con 3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về vi khuẩn nội sinh thực vật 1.1.1. Định nghĩa Vi khuẩn nội sinh thực vật ("Endophytic bacteria") hiểu theo nghĩa đen là vi khuẩn cư trú bên trong cây ("endon" = bên trong; "phyton" = cây). Kể từ khi phát hiện ra các vi sinh vật nội sinh ở Đức vào năm 1904, các nhà nghiên cứu đã định nghĩa vi sinh vật nội sinh theo nhiều cách khác nhau, thường là tuỳ thuộc phương pháp vi sinh vật nội sinh được phân lập và đánh giá. Theo Hallmann và cs, (1997) mô tả vi khuẩn nội sinh là những sinh vật có thể phân lập được từ các bộ phận đã khử trùng bề mặt của cây hoặc được chiết xuất từ các nội mô thực vật và không gây thiệt hại cho cây chủ. Kado (1992) định nghĩa vi khuẩn nội sinh là những "vi khuẩn cư trú trong mô thực vật sống mà không làm tổn hại đáng kể hoặc đạt được lợi ích khác ngoài việc đảm bảo cư trú". Định nghĩa này được xem là quá hạn chế, vì nó loại trừ khả năng các vi khuẩn nội sinh có thể hình thành các mối quan hệ cộng sinh với kí chủ. Mặc dù vi khuẩn nội sinh đã được mô tả trong thế kỷ trước, nhưng chúng chỉ được chú ý nhiều trong thập kỷ qua khi khả năng bảo vệ vật chủ của chúng chống lại các yếu tố sinh học được công nhận. Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào mô thực vật chủ yếu qua vùng rễ; tuy nhiên, các bộ phận trên không của thực vật như hoa, thân và lá mầm cũng có thể được sử dụng để xâm nhập. Khi chúng xâm nhập vào bên trong mô thực vật, vi khuẩn nội sinh có thể vẫn còn cư trú tại điểm xâm nhập hoặc lan rộng khắp cây. Các vi khuẩn này có khả năng xâm nhập vào mô vật chủ, tham gia vào việc thúc đẩy tăng trưởng cây trồng và bảo vệ cây trồng đã làm cho chúng có giá trị đối với nông nghiệp như một công cụ để cải thiện sản lượng cây trồng (N. Amaresana và cs, 2011). 1.1.2. Nguồn gốc và đa dạng vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh thực vật hiện diện phổ biến trong hầu hết tất cả các loài thực vật, chúng sống tiềm ẩn hoặc tích cực xâm chiếm nội mô thực vật một cách cục bộ hoặc hệ thống (Hallmann và cs, 1997). Vi khuẩn nội sinh bắt nguồn từ các cộng đồng vi khuẩn biểu sinh vùng rễ và lá, cũng như từ hạt hoặc các vật liệu nhân giống vô tính. Nhiều nghiên cứu 4 cho rằng vùng rễ là nguồn vi khuẩn nội sinh chính, từ đó chúng xâm chiếm vào bên trong mô tế bào thực vật (Verma và cs, 2001). Thành phần vi khuẩn nội sinh thực vật rất đa dạng, chúng được phân lập từ cả thực vật một lá mầm và hai lá mầm, từ các loài thân gỗ, thân bụi, thân leo, đến các thực vật thân thảo (lúa, củ cải đường, ngô, nha đam và cỏ chăn nuôi,…). Rất nhiều tác giả đã tổng hợp sự đa dạng của vi khuẩn nội sinh thực vật (Hallmann và cs,1997, Lodewyckx và cs,2002). Gần đây nhất, Miliute và cộng sự (2015) đã tóm tắt các chủng vi khuẩn nội sinh phân bố rộng và phổ biến nhất trong nhiều loại cây trồng nông nghiệp (Đỗ Thị Kiều An, 2019). Khoảng 300.000 loài thực vật có một hoặc nhiều endophytes (Strobel và cs, 2004). Vi khuẩn nội sinh đã được quan sát thấy bên trong các mô thực vật như lá, rễ, hạt, thân, quả, noãn và củ (Benhizia và cs, 2004; Hallmann và cs, 1997; Sturz và cs,1997). Các vi khuẩn nội sinh được nghiên cứu rộng rãi nhất xuất hiện ở ba loại chính: Firmicutes, Proteobacteria và Actinobacteria. Các chi endophytic quan trọng như Pseudomonas bukholderia,… 1.1.3. Sự xâm nhập và vai trò của vi khuẩn nội sinh Sự xâm nhập đặc biệt nhiều trong mô rễ có thể phản ánh thực tế rằng rễ là vị trí chính mà vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào thực vật. Ngoại trừ vi khuẩn truyền hạt có trong cây, Vi khuẩn nội sinh trước tiên phải cư trú trên bề mặt rễ trước khi xâm nhập vào cây. Điều này có thể giải thích mối quan hệ chặt chẽ giữa vi khuẩn sống trong thực vật và vi khuẩn sống trong sinh quyển, tức là, nhiều vi khuẩn nội sinh có thể sống được như vi khuẩn sống trong sinh quyển. Sự xâm nhập chính của vi khuẩn nội sinh dường như là qua các vết thương xảy ra một cách tự nhiên do sự phát triển của thực vật hoặc qua các lông rễ và tại các điểm nối biểu bì (Sprent và cs,1994). Mặc dù vùng rễ cung cấp vị trí xâm nhập rõ ràng nhất cho nhiều vi khuẩn nội sinh, sự xâm nhập cũng có thể xảy ra tại các vị trí trên các bộ phận khác của thực vật. Sharrocket và cộng sự (1991) cho rằng, trong một số trường hợp, quần thể nội sinh bên trong quả có thể phát sinh bằng cách xâm nhập qua hoa. Sự xâm nhập của vi khuẩn nội sinh cũng được cho là xảy ra thông qua các lỗ mở tự nhiên trên lá như khí khổng hoặc qua các hạt đậu lăng ở thân (Cindy Lodewyckx và cs, 2002). Thực tế là vi khuẩn dường như có khả năng định cư các mô bên trong của thực vật có thể mang lại lợi thế sinh thái so với vi khuẩn chỉ có thể cư trú trên bề mặt thực vật. Các mô bên trong của thực vật được cho là cung cấp một môi trường bảo vệ và đồng đều hơn cho vi sinh vật so với bề mặt thực vật, nơi tiếp xúc với các điều kiện môi trường khắc nghiệt, 5 chẳng hạn như nhiệt độ, bức xạ tia cực tím, là những yếu tố chính hạn chế sự tồn tại lâu dài của vi khuẩn (Cindy Lodewyckx và cs, 2002). Các vi khuẩn nội sinh thực vật có thể ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự phát triển của thực vật. Việc thúc đẩy trực tiếp sự phát triển của thực vật nhờ PGPB, có thể cố định nitơ trong khí quyển và cung cấp cho cây trồng; chúng tổng hợp các tế bào phụ có thể hòa tan và cô lập sắt từ đất và cung cấp cho cây trồng; tổng hợp một số phytohormone khác nhau có thể hoạt động để tăng cường các giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật; chúng có thể có cơ chế hòa tan các khoáng chất như Photpho và chúng có thể tổng hợp một số hợp chất hoặc enzym có khối lượng phân tử thấp, ít đặc trưng hơn, có thể điều chỉnh sự tăng trưởng và phát triển của thực vật. Trong số 16 nguyên tố cơ bản, thực vật chủ yếu cần C, H, N, O và P để sinh trưởng và phát triển. Các nguyên tố này có sẵn dưới dạng các hợp chất hóa học và có thể được thu hồi từ khí quyển, đất, nước, chất thải vô cơ,… Sự cố định nitơ hoặc sản xuất phytohormone như auxin, cytokinin và axit gibberellic bởi những vi khuẩn nội sinh này có thể thúc đẩy sự phát triển và nuôi dưỡng thực vật. Tuy nhiên, trong số các vi khuẩn thúc đẩy thực vật, vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPB) được nghiên cứu rộng rãi để ứng dụng hiệu quả trên thực địa trong các điều kiện khác nhau, Dựa theo Cattelan và cộng sự (1999) phytohormone như axit axetic indole (IAA), axit gibberellic, cytokinin và ethylene được sản xuất bởi vi khuẩn nội sinh có liên quan đến việc thúc đẩy tăng trưởng thực vật. Tương tự như vậy, sản xuất siderophore, β-1,3 glucanase, chitinase, kháng sinh và xyanua bởi vi khuẩn nội sinh giúp tăng cường hoạt động đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh thực vật. Việc sử dụng các chất dinh dưỡng dạng hòa tan và khoáng chất khác cũng giúp trong cơ chế thúc đẩy sự phát triển của cây trồng. Vai trò của vi khuẩn nội sinh thực vật đã được ghi nhận trong nhiều nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước. Tác dụng và ứng dụng của vi khuẩn nội sinh thực vật được trình bày tóm tắt trong hình 1.1. 6 Hình 1.1. Ứng dụng của vi khuẩn nội sinh Cơ chế của những tác động có lợi của vi khuẩn nội sinh đối với cây chủ tương tự như của các vi khuẩn vùng rễ có khả năng thúc đẩy sinh trưởng thực vật (Kloepper và cs, 1991). Điều này là do hầu hết các vi khuẩn nội sinh được phân lập từ nội mô các loài thực vật khỏe mạnh và có thể được xem như nội sinh không bắt buộc và có khả năng sống bên ngoài mô thực vật như những vi khuẩn vùng rễ (Lodewyckx và cs, 2002). Các nghiên cứu khác nhau trước đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn nội sinh có thể đóng những vai trò có lợi như thúc đẩy tăng trưởng hoặc kiểm soát sinh học trên cây chủ của chúng. Có những giả thuyết cho rằng thực vật ký chủ được hưởng lợi từ vi khuẩn nội sinh theo nhiều cách khác nhau như dinh dưỡng, dị hóa chất ô nhiễm và tăng cường phản ứng phòng vệ của thực vật đối với các áp lực môi trường hoặc tấn công mầm bệnh. Cũng có các nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng vi khuẩn endophytic làm tăng sự phát triển của thực vật bằng cách tạo ra các tế bào phụ và phytohormone, cũng như tăng khả năng chống lại mầm bệnh (Kambiz Bahmani và cs, 2021). Bacillus subtilis, Bacillus pumilus và Bacillus cereus là những vi khuẩn gram dương rất phổ biến, không độc và không gây hại cho người, động vật và môi trường. Nhiều nghiên 7 cứu đã chỉ ra rằng Bacillus subtilis, Bacillus pumilus và Bacillus cereus có quan hệ mật tăng sự phát triển thực vật tốt hơn so với việc bổ sung riêng rẽ từng loài. Xử lý hỗn hợp Azospirillum lipoferum, Gluconacetobacter và B. vietnamiensis (108 CFU/ml) vào cây lúa +5 ngày tuổi đã giúp làm tăng năng suất 14,4% trong khi việc bổ sung riêng lẻ từng dòng chỉ tăng tối đa 6,2% (Đỗ Thị Kiều An, 2019). 1.1.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh 1.1.4.1. Trên thế giới Vi khuẩn nội sinh đối kháng với một số bệnh cây trồng đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và ứng dụng từ những năm đầu của thế kỷ XX. Hiện nay có nhiều công trình nghiên cứu về sự đối kháng của vi sinh vật công bố trên thế giới có hoạt tính đối kháng chống lại một số mầm bệnh thực vật như Pseudomonas fluorescens 89B-27 và Serratia marcescens 90-166 cảm ứng kháng với P. syringae pv. lachrymans, Fusarium oxysporum f.sp. cucumerium và Colletrotrichum orbiculare (Liu và cs,1995). Theo Amaresan và cs, (2012), các vi khuẩn nội sinh đối kháng lại Ralstonia solanacearum thuộc nhiều chi khác nhau như: Bacillus, Proteus, Pseudomonas. Có 8 chủng vi khuẩn nội sinh cụ thể là Pseudomonas brassicacearum Psb101 và Ps169; Bacillus licheniformis BL17; Pseudomonas putida Ps52; Paenibacillus peoriae Pa86; và Bacillus pumilus Bp91, Bp1, Bp49 có thể kiểm soát bệnh héo xanh trong điều kiện in vitro và in vivo (Kambiz Bahmani và cs, 2021). Trong điều kiện nhà kính, vi khuẩn nội sinh Bacillus. subtilis bảo vệ đáng kể cây dâu chống lại Ralstonia solanacearum (Ji và cs, 2008). Nghiên cứu trước đây cho biết Pseudomonas fluorescens PfG32 được phân lập từ thân rễ của hành tây tích cực ngăn chặn tỷ lệ bệnh héo do vi khuẩn ở cà chua vì nó tạo ra các tế bào phụ và kháng sinh ( Purnawati. A và cs, 2014). Xử lý trước với Bacillus cereus XB177R có thể làm chậm sự xuất hiện của bệnh héo xanh do vi khuẩn và giảm tỷ lệ bệnh đến mức 80,0% (A. Achari1 và cs, 2018). Bacillus amyloliquefaciens BL10 có thể là các loài vi khuẩn nội sinh mới của cà chua có thể được sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học của Ralstonia solanacearum (Ika Damayanti và cs, 2011). 1.1.4.2. Trong nước Vi khuẩn gram dương có một số đặc điểm giống với các đặc điểm của chi Bacillus và vi khuẩn gram âm thuộc chi Agrobacterium và Pseudomonas được phân lập từ một số 8