Tài liệu Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc m4v có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi

Header Page Khóa 1 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 LỜI CẢM ƠN Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Phương Phú Công, người đã trực tiếp, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong tổ Vi sinh vật học và toàn thể các thầy cô khoa Sinh – KTNN trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại đây. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Dung 1 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 1 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 2 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, các kết quả thu được trong khoá luận là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kì công trình khoa học nào. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Dung 2 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 2 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 3 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ phẩm nông nghiệp phổ biến ................................................................. 7 Bảng 3.1. Khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V trên các nguồn cơ chất khác nhau........................................................... 26 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V ......................................................................................... 29 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase .................................................................................... 30 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase ................ 31 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase ............ 33 Bảng 3.6. Hàm lượng đường tổng số của các mẫu cơ chất trước và sau khi lên men ......................................................................... 35 Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các mẫu cơ chất trước và sau khi lên men ..................................................................................... 37 Bảng 3.8. Kết quả phân tích hoạt tính cellulase từ các mẫu sau khi lên men (UI/g) .......................................................................... 38 3 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 3 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 4 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức hoá học của cellulose ................................................... 4 Hình 1.2. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase ..................... 8 Hình 3.1. Hoạt tính của chủng M4V trên nguồn cơ chất vỏ trấu, vỏ lạc và lõi ngô .................................................................................... 27 Hình 3.2. Hoạt tính của chủng M4V ở tỉ lệ phối trộn 4:4:2 và 4:3:3 ........... 29 Hình 3.3. Hoạt tính của chủng M4V ở thời gian lần lượt là 36 giờ và 48 giờ ......................................................................................... 31 Hình 3.4. Hoạt tính của chủng M4V ở 320C và 440C.................................. 32 Hình 3.5. Hoạt tính của chủng M4V ở nguồn nitơ pepton và NaNO 3 ......... 33 4 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 4 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 5 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Cs : Cộng sự CMC : Cacboxyl methyl cellulose CMC – ase : Cacboxylmethylcellulase 5 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 5 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 6 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 2 2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2 3. Nội dung của đề tài..................................................................................... 2 4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 4 1.1. Cellulose và sự phân bố cellulose trong thực vật .................................... 4 1.1.1. Cellulose .............................................................................................. 4 1.1.2. Sự phân bố cellulose trong thực vật ...................................................... 6 1.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase .................................... 8 1.2.1. Hệ thống cellulase ................................................................................ 8 1.2.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase .................................. 8 1.3. Ứng dụng của cellulase .......................................................................... 9 1.3.1. Cellulase với công nghiệp thực phẩm ................................................... 9 1.3.2. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ...................................... 10 1.3.3. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm .............................................. 10 1.3.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ .................................... 11 1.3.5. Trong công nghệ xử lí rác thải và sản xuất phân bón vi sinh ............... 12 1.3.6. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi ................................... 12 1.4. Các nhóm vi sinh vật tham gia phân giải cellulose ................................ 13 1.4.1. Vi khuẩn ............................................................................................. 13 1.4.2. Xạ khuẩn loài Actimomyces (Streptomyces) ...................................... 14 1.4.3. Nấm sợi .............................................................................................. 14 1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật ........ 14 1.5.1. Giống vi sinh vật ................................................................................ 14 6 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 6 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 7 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 1.5.2. Nguồn dinh dưỡng .............................................................................. 15 1.5.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon.......................................................... 15 1.5.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ............................................................... 15 1.5.3. Điều kiện nuôi cấy .............................................................................. 16 1.5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................... 16 1.5.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ...................................................................... 16 1.5.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ................................................... 17 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 18 2.1. Nguyên liệu và vi sinh vật ..................................................................... 18 2.1.1.Chủng vi sinh vật ................................................................................. 18 2.1.2. Nguyên liệu ........................................................................................ 18 2.1.3. Hóa chất – thiết bị .............................................................................. 18 2.1.4. Môi trường ......................................................................................... 18 2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 20 2.2.1. Phương pháp vi sinh ........................................................................... 20 2.2.1.1. Thu thập mẫu ................................................................................... 20 2.2.1.2. Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản..................................... 20 2.2.1.3. Hoạt hoá vi sinh vật ......................................................................... 20 2.2.2. Phương pháp hoá sinh ........................................................................ 21 2.2.2.1. Nuôi cấy chủng nấm mốc để thử hoạt tính ....................................... 21 2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính carboxymethylcellulase ................ 22 2.2.2.3. Phương pháp xác định protein tổng số ............................................ 24 2.2.2.4. Phương pháp xác định lượng đường tổng số ................................... 25 2.2.3. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................... 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .................................................... 27 3.1. Khảo sát khả năng sinh cellulase của chủng M4V trên các phế phụ phẩm nông nghiệp ........................................................................................ 27 7 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 7 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 8 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 3.2. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V ..................... 29 3.2.1. Ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V ....................................... 29 3.2.2. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V ..................... 31 3.2.2.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase ....... 31 3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase ........ 32 3.2.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase .................. 33 3.3. Nâng cao chất lượng phế phụ phẩm nông nghiệp thông qua sử dụng chủng nấm mốc M4V để ứng dụng trong chăn nuôi ............................ 35 3.3.1. Kiểm tra hàm lượng đường tổng số của môi trường trước và sau khi lên men bằng chủng nấm mốc M4V ....................................................... 35 3.3.2. Kiểm tra hàm lượng protein của môi trường trước và sau khi lên men bằng chủng nấm mốc M4V ................................................................... 37 3.3.3. Phân tích hoạt tính cellulase của các mẫu nghiên cứu ......................... 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 40 8 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 8 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 9 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Trong thời gian gần đây chăn nuôi đang gặp phải những khó khăn với hàng loạt các vấn đề nổi lên như: nhiều dịch bệnh như cúm gia cầm tái phát và giá thức ăn chăn nuôi cao,… Chính vì vậy, ngành chăn nuôi nước ta đang đứng trước một thách thức mới là làm thế nào để có một nền nông nghiệp bền vững và ổn định trong thời kì kinh tế hội nhập, phát triển nhanh, luôn đổi mới và nhiều cạnh tranh này. Mặt khác, một nền nông nghiệp phát triển như ở Việt Nam thì vấn đề được đặt ra là đầu ra cho các phế phụ phẩm trong nông nghiệp sau thu hoạch như rơm rạ, vỏ trấu, vỏ lạc…Nguồn phế phụ phẩm trong nông nghiệp thải ra trong quá trình sản xuất và chế biến nông sản của nước ta ước tính khoảng trên 50 triệu tấn mỗi năm. Lượng phế thải lớn này là những hợp chất hữu cơ giàu cacbon và các chất khoáng đa vi lượng. Đây là nguồn nguyên liệu có giá trị cao cho sản xuất các dạng chế phẩm sinh học cũng như phân hữu cơ sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp đặc biệt là trong lĩnh vực chăn nuôi. Do vậy, cần phải có những phương pháp, những nghiên cứu khả thi và hiệu quả để tận dụng nguồn phế phẩm nông nghiệp dồi dào này [26] Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose, chúng được tổng hợp chủ yếu nhờ vi sinh vật trong đó nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose cao hơn cả như Aspegillus, Mucor, Tricoderma…Cellulase là một phức hệ enzyme rất quan trọng và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Cellulase được sử dụng với 2 mục đích chính : Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải các phế thải của công nghiệp thực phẩm, phế thải nông nghiệp bổ sung vào thức ăn gia súc và vào trong công nghệ môi trường ; Thủy phân cellulase tạo cơ chất lên men để thu sản 9 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 9 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 10 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 phẩm cuối cùng khác nhau. Cellulase đã, đang và sẽ ngày càng được sử dụng nhiều hơn để bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi [12]. Từ rất lâu trước, con người cũng đã biết đến sự tồn tại của các chủng nấm mốc và đã biết ứng dụng chúng vào nhiều lĩnh vực như công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường, nông nghiệp…Trên thế giới cũng như trong nước đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong chăn nuôi như : Chu Thanh Bình và Cs (2012) đã ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bãi thải hoa quả giàu cellulose làm thức ăn gia súc ; Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp sắn bằng cách sử dụng Aspergillus hennebergi niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho bò; Phương Phú Công (2008) Tuyển chọn và ứng dụng một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men xylan trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu xylanase phục vụ cho chăn nuôi… và đã thu được kết quả cho nhiều triển vọng. Xuất phát từ những yều cầu cấp thiết như trên tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi” 2. Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V trong việc phân giải cellulose trên các phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi. 3. Nội dung của đề tài 3.1. Tuyển chọn và nghiên cứu chủng nấm mốc M4V có khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp. 3.2. Bước đầu đánh giá sản phẩm lên men từ chủng nấm mốc M4V để bổ sung vào thức ăn làm tăng năng suất vật nuôi. 10 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 10 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 11 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 4. Ý nghĩa của đề tài 4.1. Ý nghĩa lý luận Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Bước đầu nghiên cứu nâng cao chất lượng phế phụ phẩm trong ngành nông nghiệp Việt Nam để phục vụ chăn nuôi. 11 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 11 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 12 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cellulose và sự phân bố cellulose trong thực vật 1.1.1. Cellulose Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C 6H10O5)n, và là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-O- (β-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.1). Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 1011 tấn cellulose (trong gỗ,cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%) [27]. Hình 1.1. Công thức hoá học của cellulose Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Waals Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hoá chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose không liên kết chặt với nhau nên dễ bị tấn công [27]. Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo dài và định hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Ao và xếp xen kẽ với vùng vô định hình [27]. 12 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 12 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 13 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng khớp khoảng 1000. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thuỷ phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết β – glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo ra sự thay đổi 180o cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thuỷ phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hoá trị (β – glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro[27]. Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen. Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose. Cellulose là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết β-1→4- glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác. Giống như tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Mỗi chuỗi có nhiều nhóm - OH tự do, vì vậy giữa các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa các nhóm - OH của chúng. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hơn hay còn gọi đó là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose [27]. Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thuỷ phân. Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hoá được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hoà hoạt động của hệ 13 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 13 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 14 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 thống tiêu hoá. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm cũng có thể phân huỷ cellulose, vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn [24]. 1.1.2. Sự phân bố cellulose trong thực vật Cellulose được tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn. Sinh khối thực vật của trái đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose chiếm tới 720 tỷ tấn. Khối lượng cellulose khổng lồ này ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có trong động vật và vi sinh vật nhưng với số lượng nhỏ. Cùng với cellulose, hemicellulose và lignin phối hợp với nhau tạo nên cấu trúc và quyết định tính chất hoá học và cơ lí của nguyên liệu có nguồn gốc thực vật. Các hợp chất này thường đi cùng với nhau, do đó người ta thường gọi là ligno – cellulose (Bảng 1.1) [27]. 14 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 14 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 15 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Bảng 1.1. Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ phẩm nông nghiệp phổ biến Nguồn lignocellulose Cellulose Hemicellulose Lignin (%) (%) (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85-99 0 0-15 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu của lúa mì 30 50 15 Rác đã phân loại 60 20 20 Lá cây 15-20 80-85 0 Hạt bông 80-95 5-20 0 Giấy báo 40-55 25-40 18-30 Giấy thải từ bột giấy hoá học 60-70 10-20 5-10 Chất rắn nước thải ban đầu 8-15 - 24-29 Chất thải của lợn 6 28 - Phân bón gia súc 1.6-4.7 1.4-3.3 2.7-5.7 Cỏ ở bờ biển Bermuda 25 35.7 6.4 Cỏ mềm 45 31.4 12 25-40 25-50 10-30 33.4 30 18.9 Các loại cỏ (trị số trung bình cho các loại) Bã thô 15 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 15 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 16 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 1.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase 1.2.1. Hệ thống cellulase Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm: endo-β-1,4-glucanase, exoglucanase và β-glucosidase.  Endo-β-1,4-glucanase được gọi là endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4).  Exoglucanase, gồm 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (giống như cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91).  β – glucosidase hoặc β – glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [28]. 1.2.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase Hình 1.2. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase 16 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 16 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 17 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2  Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết α-1,4- glucoside trong cellulose, lignin và α- D glucan một cách ngẫu nhiên. Sản phẩm của quá trình phân giải là các cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose.  Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose.  Cellobiase: tham gia phân giải cellobiose (disaccharide) và cellotetrose thành glucose [28]. 1.3. Ứng dụng của cellulase 1.3.1. Cellulase với công nghiệp thực phẩm Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi loại rau quả cũng như trong các nguyên liệu, phế liệu của ngành trồng trọt và nông nghiệp. Nhưng người và động vật không có khả năng phân giải cellulose. Nó chỉ có giá trị làm tăng tiêu hoá, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hoá. Chế phẩm cellulase thường dùng để: Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc, tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật [31]. Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật. Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em và nói chung chất lượng thực phẩm được tăng lên. Một số nước đã dùng cellulase để xử lí các loại rau quả cải bắp, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn xử lí cả chè và các loại tảo biển,… [25]. Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase thành tế bào của hạt đại mạch bị phá huỷ tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hoá. Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase đã làm tăng chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Đặc biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật 17 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 17 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 18 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 đem thuỷ phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men. Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao [25]. 1.3.2. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn. Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Trước khi nghiền hoá học, gỗ được xử lí với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hoá chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin [32]. Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy [12]. 1.3.3. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm Trong quá trình sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ, bỏ hạt được dịch nhuyễn. Từ thịt quả nghiền đã ép bã thu được dịch quả. Dịch này thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao. Để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả và giảm bớt một số công đoạn thì việc bổ sung endoglucanase là rất quan trọng. Enzyme này là mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hoá. Sự kết hợp của glucanase và pectinase 18 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 18 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 19 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 sẽ phá huỷ hoàn toàn màng tế bào. Trong quá trình sản xuất, ở giai đoạn dịch hoá bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt sẽ tốt hơn. Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó giảm lượng diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia [15]. Trong dịch lên men có chứa một lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng tới khả năng lọc và gây đục cho bia [15]. Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao. Để tiến hành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được áp dụng. Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lí bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng trích li dịch quả. Trong khâu bóc vỏ, cellulase gây hiện tượng thẫm màu, làm giảm chất lượng sau khi sấy, đồng thời cản trở cho việc bóc vỏ. Khi sử dụng chế phẩm A. niger có tên thương mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho thấy số lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao. Trong quá trình trích li dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hoà tan trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích li cao hơn mẫu không sử dụng là 46% [9]. 1.3.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ Trong giai đoạn đường hoá của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thuỷ phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá huỷ thành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lượng đường tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu tăng lên 1,5% [27]. 19 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 19 of 128. K35B – SP Sinh Header Page Khóa 20 of 128. luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 1.3.5. Trong công nghệ xử lí rác thải và sản xuất phân bón vi sinh Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lí rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả. Enzyme này có khả năng thuỷ phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu năng lượng khác [27]. Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để chứ rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất. Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lí nguồn nước thải do các nhà máy giấy tạo ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao). Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose. Vì vậy nước thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao [33]. 1.3.6. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi Trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng ở thức ăn ở mức cao nhất. Để giải quyết nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme bổ sung khẩu phần thức ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng với các enzyme có sẵn trong đường tiêu hoá sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn, giúp cho con vật tiêu hoá được tốt hơn [3]. Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho gia súc. Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế phẩm enzyme này mà thường bổ sung cùng với các enzyme khác như: amylase, protease, xylanase,…tạo ra một dạng chế phẩm chứa nhiều loại enzyme. Việc 20 SVTH: Nguyễn Thị Dung luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 20 of 128. K35B – SP Sinh