Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn cao ethyl acetate ea1 cây chìa vôi (cissus modeccoides planch.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Ngọc Tín NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN CAO ETHYL ACETATE EA1 CÂY CHÌA VÔI (Cissus modeccoides Planch.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Ngọc Tín NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN CAO ETHYL ACETATE EA1 CÂY CHÌA VÔI (Cissus modeccoides Planch.) Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 8440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC KHOA HỌC VẬT CHẤT NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi tên Nguyễn Ngọc Tín, học viên cao học chuyên ngành hóa hữu cơ. Tôi xin cam đoan luận văn Thạc sĩ: “Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn cao ethyl acetate EA1 cây chìa vôi Cissus modeccoides Planch.” do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết. Các số liệu kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, có nguồn gốc rõ ràng. Theo sự hiểu biết của tôi cũng như tài liệu tham khảo, các kết quả nghiên cứu trong luận văn chưa từng được ai công bố trong bất cứ nghiên cứu nào khác. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 3 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Ngọc Tín LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên, khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh. Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã tận tình hướng dẫn cũng như giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Cô không chỉ hỗ trợ cho em về mặt kiến thức khoa học cũng như kỹ năng mà còn truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu khoa học. Đó là hành trang quý báu cho em trên bước đường tương lai sau này. Em xin hết lòng cảm ơn quý Thầy Cô trong phòng hợp chất thiên nhiên nói riêng và các Thầy Cô khoa Hóa học – trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh nói chung. Các Thầy Cô đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học quý báu trong suốt thời gian em học tại trường. Em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn trong phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên Trường đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình trao đổi những kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU.................................................................................................................................... 4 1. Lý do chọn đề tài .................................................................................................................... 4 2. Mục đích nghiên cứu .............................................................................................................. 4 3. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................................. 4 4. Nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................................................................. 4 5. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................................ 5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................................... 6 1. Các nghiên cứu về đặc điểm thực vật .................................................................................... 6 2. Các nghiên cứu về dược tính ................................................................................................. 6 2.1. 2.2. Dược tính theo y học cổ truyền ....................................................................................... 6 Dược tính theo y học hiện đại.......................................................................................... 6 2.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học ........................................................................... 8 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................................. 19 2.1. Hóa chất, thiết bị, phương pháp..................................................................................... 19 2.1.1. Hóa chất .......................................................................................................................... 19 2.1.2. Thiết bị ............................................................................................................................ 19 2.1.3. Phương pháp tiến hành.................................................................................................... 19 2.2. 2.3. Nguyên liệu ................................................................................................................... 20 Điều chế các loại cao ..................................................................................................... 20 2.4. Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn cao ethyl acetate EA1.................... 21 2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn cao ethyl acetate EA1 ............................................. 21 2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn HEA2...................................................................... 21 2.4.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn HEA6...................................................................... 22 2.4.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn HEA8...................................................................... 23 2.4.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn HEA11.................................................................... 23 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................... 27 3.1. Khảo sát cấu trúc hợp chất CM1 ................................................................................... 27 3.2. Khảo sát cấu trúc hợp chất CM2 ................................................................................... 28 3.3. Khảo sát cấu trúc hợp chất CM3 ................................................................................... 30 3.4. Khảo sát cấu trúc hợp chất CM4 ................................................................................... 33 3.5. Khảo sát cấu trúc hợp chất CM6 ................................................................................... 35 3.6. Khảo sát cấu trúc hợp chất CM8 ................................................................................... 37 3.7. Khảo sát cấu trúc hợp chất CM9 ................................................................................... 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................................ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................... 44 PHỤ LỤC ................................................................................ Error! Bookmark not defined. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt 1 H-NMR Tiếng Anh Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance  Ac C d dd EA g Glu H Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance Chemical shift Acetone Chloroform Doublet Double of doublet Ethyl acetate Gram Glucopyranosyl n-Hexane HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence 13 C-NMR HSQC Hz J m Me mg MHz ppm Rf RP-18 s SKC SKLM t UV Heteronuclear Single Quantum Correlation Hertz Coupling constant Multiplet Methanol Miligram Mega Hertz Part per million Retention factor Reversed Phase-18 Singlet Triplet Ultra Violet Tiếng Việt Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của proton (1) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của carbon (13) Độ chuyển dịch hoá học Mũi đôi Mũi đôi đôi Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết Hằng số ghép spin Mũi đa Một phần một triệu Pha đảo C-18 Mũi đơn Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng Mũi ba Tia cực tím DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Dược tính theo y học hiện đại của một số loài thuộc chi Cissus .................... 4 Bảng 1.2. Một số hợp chất đã được cô lập từ một số loài thuộc chi Cissus.................... 6 Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn cao ethyl acetate EA1........................... 18 Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn HEA2 ................................................... 19 Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn HEA6 ................................................... 19 Bảng 2.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn HEA8 ................................................... 20 Bảng 2.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn HEA11 ................................................. 21 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất CM1 và hợp chất so sánh .......................... 24 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất CM2 và hợp chất so sánh ......................... 26 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất CM3 và hợp chất so sánh .......................... 28 Bảng 3.4. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất CM4 và hợp chất so sánh .......................... 31 Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất CM6 và hợp chất so sánh .......................... 33 Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất CM8 và hợp chất so sánh .......................... 35 Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất CM9 và hợp chất so sánh .......................... 37 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hoa và lá cây Chìa vôi...................................................................................... 3 Hình 3.1. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất CM1 .......................... 24 Hình 3.2. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất CM3 .......................... 28 Hình 3.3. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất CM4 và cấu trúc hợp chất vitexin ............................................................................................................................ 30 Hình 3.4. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất CM6 .......................... 33 Hình 3.5. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất CM8 .......................... 34 Hình 3.6. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất CM9 .......................... 36 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế phân đoạn cao ethyl acetate EA1 từ cây Chìa vôi.......... 17 Sơ đồ 2.2 Quy trình cô lập các hợp chất CM4, CM6, CM8 .......................................... 22 Sơ đồ 2.3 Quy trình cô lập các hợp chất CM1, CM2, CM3, CM9 ............................... 22 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Từ xưa đến nay, ngoài các phương pháp điều trị bệnh của Tây y thì người dân Việt Nam vẫn luôn sử dụng các loài thực vật bản địa như một bài thuốc để trị bệnh. Các nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học một số loại thực vật giúp làm sáng tỏ, chứng minh, giải thích tác dụng của các bài thuốc đó, đóng góp nguồn tài liệu vô cùng quý giá cho sự phát triển của ngành Hóa dược. Những năm gần đây, các nhà nghiên cứu vẫn tích cực quan tâm, tìm kiếm và cô lập các hợp chất mới có hoạt tính sinh học cao trong các loài cây được dân gian sử dụng. Chi Cissus (C.) gồm 350 loài thuộc họ Nho (Vitaceae). Chúng phân bố rộng khắp, nhưng được tìm thấy nhiều nhất ở vùng nhiệt đới. Nhiều loài thuộc chi Cissus được nghiên cứu cho thấy có nhiều hoạt tính sinh học hữu ích như C. quadrangularis Linn. có tác dụng kháng viêm [1], khôi phục đặc tính và chống loãng xương [2,3], chống oxi hóa [4], kháng virus [5], …; C. sicyoides L. có tác dụng kháng khuẩn [6], chống dị ứng, hạ đường huyết [7], …; C. repens Lam. có tác dụng giảm đau, kháng viêm [8]; C. ibuensis Hook và C. pteroclada Hayata có tác dụng kháng khuẩn [9,10], … Cây Chìa vôi (Cissus modeccoides Planch), thuộc họ Nho (Vitaceae) được nhân dân sử dụng như một bài thuốc chữa đau nhức xương, đau nhức đầu và tê thấp [11]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Chìa vôi rất ít. Do đó, tôi chọn đề tài này để khảo sát thành phần hóa học của cây Chìa vôi C. modeccoides Planch. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn cao ethyl acetate EA1 cây Chìa vôi C. modeccoides Plach. 3. Đối tượng nghiên cứu Phân đoạn cao ethyl acetate EA1 cây Chìa vôi C. modeccoides Planch. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất trong phân đoạn cao ethyl acetate EA1 cây Chìa vôi C. modeccoides Planch. 5. Phương pháp nghiên cứu  Chiết xuất các hợp chất hữu cơ trong mẫu nguyên liệu bằng dung môi ethanol.  Dùng phương pháp sắc kí cột hở với dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần để điều chế các phân đoạn cao khác nhau.  Dùng sắc ký cột cổ điển với silica gel pha thường hoặc pha đảo, kết hợp với sắc ký lớp mỏng để phân lập một số hợp chất.  Khảo sát và xác định cấu trúc các hợp chất cô lập được bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại, chủ yếu là phổ cộng hưởng từ hạt nhân. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1. Các nghiên cứu về đặc điểm thực vật Cây Chìa vôi còn có tên gọi khác là bạch liễm, đau xương, bạch phấn đằng. Tên khoa học: Cissus modeccoides Planch. Thuộc họ: Nho Vitaceae. Cây Chìa vôi là một loại cây nhỏ, mọc leo, dài chừng 2 đến 4 m, toàn thân nhẵn, có tua cuốn đơn, nhỏ hình sợi Lá đơn, xẻ thùy chân vịt, phía cuống hình tim, dài và rộng từ 6 đến 8 cm, những lá phía gốc hầu như nguyên, hình mác, lá phía trên chìa 5 đến 7 thùy, dài gần bằng nhau, mép hơi có răng cưa. Hoa màu vàng nhạt, mọc đối diện với lá, nhưng ngắn hơn, có cuống. Cây Chìa vôi mọc hoang ở khắp các tỉnh miền Bắc và miền Nam. Cây thường được thu lấy rễ củ, thái mỏng, phơi hay sấy khô làm thuốc, có thể thu hoạch quanh năm nhưng vào mùa thu đông là tốt nhất [11]. Hình 1.1 hoa và lá cây Chìa vôi 2. Các nghiên cứu về dược tính 2.1. Dược tính theo y học cổ truyền Người dân thường dùng cây Chìa vôi để làm thuốc chữa đau nhức xương, đau nhức đầu, tê thấp (10g đến 30g thuốc sắc/ ngày hoặc ngâm rượu uống) [11]. 2.2. Dược tính theo y học hiện đại Do cây Chìa vôi chưa được nghiên cứu nhiều nên tôi trình bày dược tính của một số loài cùng chi theo bảng sau Bảng 1.1. Dược tính theo y học hiện đại của một số loài thuộc chi Cissus Dược tính Bộ phận dùng Tăng trọng lượng tử cung và tăng estrogen huyết thanh ở chuột cái Ức chế sự phù nề do EPP gây ra ở chuột Kháng viêm Ức chế sự phù nề do carragenin và arachidonic acid gây ra ở chuột Phân đoạn giàu friedelin (17) Dịch chiết ethanol 2 mg/con Dịch chiết ethanol 75, 150, 300 mg/kg thể trọng Loài Khôi phục đặc tính sinh học và cấu trúc xương Tăng độ dày của vỏ não và xương chàm ở chuột Chống loãng xương ở chuột C. quadrangularis Linn. Chống loãng xương sau thời kì mãn kinh Giảm tổn thất xương, gia tăng trọng lượng xương đùi, chống loãng xương ở chuột cái đã cắt tửng cung Hoạt tính chống oxi hóa khi thử nghiệm trên chuột Hoạt tính kháng virus HSV1 và HSV2 khi thử nghiệm trong ống nghiệm Có tác dụng giảm cân và hạn chế hội chứng chuyển hóa ở chuột C. sicyoides L. hoặc C. verticillata (L.) Tác dụng bảo vệ dạ dày do HCl/ethanol, piroxicam, ethanol và pylorus gây ra ở chuột Kháng khuẩn Bicillus subtlis TL TK [12] [1] Dịch chiết ether dầu 500 mg/kg thể [2] trọng trong 30 ngày Dịch chiết ethanol [3] 500 mg/kg thể trọng Dịch chiết ether dầu [13] 500 mg/kg thể trọng trong 3 tháng dịch chiết [4] methanol của cây Dịch chết [5] methanol của cây 100 μg/mL 514 mg mỗi liều gồm dịch chiết cây [14] và tá dược khác, dùng trong 8 tuần Dịch chiết methanol của cây [15] 250, 500, 1000 mg/kg thể trọng β-sitosterol (10)và β-sitosterol-3β-OD-glucopyranoside (11) nồng độ ức chế tối thiểu [6] Chống dị ứng Ức chế sự phóng thích histamine từ tế bào mast Hạ đường huyết và chống tăng lipid huyết ở chuột (giảm 25% đường huyết và 48% mức triglyceride) C. repens Lam. C. ibuensis Hook C. pteroclada Hayata Có hoạt tính giảm đau, chống viêm Có tác dụng kháng vi khuẩn Staphylococcus. aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Có tác dụng kháng khuẩn được thử trên khả năng anion superoxide và sự giải phóng bạch cầu trung tính (MIC) là 50 mg/mL và 100 mg/mL Dịch chiết methanol của cây [16] (0,5 mg/mL) Dịch chiết nước từ lá của cây (100[7] 200 mg/kg thể trọng trong 7 ngày) Lupenol (75) và ursolic acid (74) [8] (500 mg/ kg thể trọng) Dịch chiết cây (nồng độ 10 [9] mg/mL hoặc 5 μ/mL) Bergenin (87), 6O-galloylbergenin (89), 6-O[10] galloylnorbergenin (91) được cô lập từ thân và rễ 2.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học Thành phần hóa học của cây Chìa vôi cũng chưa được khảo sát, tuy nhiên một số loài cùng chi Cissus đã được các nhà khoa học quan tâm, khảo sát và đăng trên các tạp chí uy tín. Tôi xin trình bày thành phần hóa học của một số loài cùng chi trong bảng 1.2. Bảng 1.2. Một số hợp chất được cô lập từ các cây cùng chi Cissus Loài C. quadrangularis Linn. C. sicyoides L. hoặc C. verticillata (L.) Hợp chất 6-O-[2,3-Dimethoxy]-trans-cinnamoyl catalpol 6-O-meta-Methoxy-benzoyl catalpol Picroside 1 Quadrangularin A Quadrangularin B Quadrangularin C Pallidol Quercetin Kaempferol β-Sitosterol β-Sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside Stigmasterol α-Amyrin β-Amyrin Resveratrol Piceatannol Friedelin Ascorbic acid β-Carotene β-Amyrone β-Sitosterol β-Sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside Hecogenin Diosgenin 5,6,7,8-tetrahydroxycoumarin-5β-Dxylopyranoside Kaempferol 3-O-L-rhamnoside Quercetin 3-O-L-rhamnoside Linalool α-tocopherol 5,6,7,8-tetrahydroxycoumarin Cissosides I Cissosides II Cissosides III Cissusin Kí hiệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 10 11 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Bộ phận cây TLTK [4] [4] [4] [4] [17] [17] [17] [17] Thân [17] [4],[17] [4],[17] [17] [17] [17] [17] [17] [12] [14] Cả cây [14] [14] [15] [15],[18] [6] [6] Lá và [18] cành [18] [18] [18] [18] Cả cây [19] [20] Thân [20] và lá [20] [20] Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside Kaempferol-3-O-α-L-arabinofuranoside Kaempferol-7-O-α-L-rhamnopyranoside Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl7-O-α-L-rhamnopyranoside Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-Lrhamnopyranoside Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranosyl-7-O-α-Lrhamnopyranoside Kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranosyl-7-O-α-Lrhamnopyranoside Kaempferol-3-O-α-L-arabinofuranosyl-7-O-α-Lrhamnopyranoside Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside Quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside Quercetin-3-O-α-L-arabinopyranoside Quercetin-3-O-α-L-arabinofuranoside Rutin Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-α-Lrhamnopyranoside 7,3',4'-trihydroxyflavone Lanceolatin B Medicarpin Homopterocarpin Melilotocarpan D Isoliquiritigenin Pongamol E-7-O-methylpongamol 2-(2,4-dimethoxyphenyl)-5,6methylenedioxybenzofuran Pinoresinol Tryptanthrin 7-hydroxy-chromone Syringaldehyde 4-hydroxybenzoic acid Vanillic acid 4-hydroxycinnamic acid Gallic acid 24 33 34 35 [20] [20] [20] [20] 36 [20] 37 [20] 38 [20] 39 [20] 40 [20] 25 41 42 43 44 45 [20] [20] [20] [20] [20] [20] 46 [20] 47 48 49 50 51 52 53 54 [20] [20] [20] [20] [20] [20] [20] [20] 55 [20] 56 57 58 59 60 61 62 63 [20] [20] [20] [20] [20] [20] [20] [20] Methyl gallate Glucosyl salicylate Indican Epicatechin-3-O-gallate Vicenin-2 Isoshaftoside Shaftoside Homoorientin Vitexin Isovitexin Ursolic acid Lupeol trans-3-O-methyl-resveratrol-2-C-β-glucoside cis-3-O-methyl-resveratrol-2-C-β-glucoside C. repens Cissuside A Lam. Cissuside B trans-resveratrol trans-resveratrol-2-C-β-glucoside cis-resveratrol-2-C-β-glucoside Quercetin-3-O-rutinoside Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-βC. ibuensis D-galactopyranoside Hook Kaempferol-3-O-rutinoside Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-α-Lrhamnopyranosyl(1→2)-β-D-galactopyranoside C. populnea Physcion Guill & Perr Chrysophanol Bergenin Norbergenin C. pteroclada 6-O-galloylbergenin Hayata 6-O-(4-hydroxy benzoyl) bergenin 6-O-galloylnorbergenin Ursolic acid Lupeol Isolariciresinol-9-O-β-D-glucopyranoside C. asamica Daucosterin Craib 3,3'-O-dimethyl ellagic acid β-sitosterol Bergenin 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 15 80 81 45 82 Lá Rễ Phần trên của cây Lá [20] [20] [20] [20] [21] [21] [21] [21] [21] [21] [8] [8] [22] [22] [22] [22] [22] [22] [22] [9] [9] 83 [9] 84 [9] 85 86 87 88 89 90 91 74 75 92 11 93 10 87 Thân Thân và rễ [23] [23] [10] [10] [10] [10] [10] [24] [24] [24] [24] [24] [24] [24] (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (11) (10) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (20) (19) (21) (23) (27) (18) (22) (24) R=H; (25) R=OH (26) (28)