Tài liệu Nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ (carica papaya)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HOÁ HỌC ==== NGUYỄN THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOID GLYCOSIDE TỪ LÁ CÂY ĐU ĐỦ (CARICA PAPAYA) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ HÀ NỘI - 2018 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HOÁ HỌC ==== NGUYỄN THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOID GLYCOSIDE TỪ LÁ CÂY ĐU ĐỦ (CARICA PAPAYA) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. TS. NGUYỄN VĂN BẰNG HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này, em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các quý thầy cô, anh chị và bạn bè. Cảm ơn các anh chị trong phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt kiến thức, kiến thức trong suốt thời gian em thực tập. Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập tại Viện. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng, người thầy đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Và các thầy cô giáo trong Khoa Hóa họctrường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ, dạy bảo em trong suốt 4 năm em học tập tại trường. Cảm ơn anh chị và bạn bè đã bên cạnh giúp đỡ em trong suốt thời gian vừa qua. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình em, những người thân luôn bên em, hết lòng ủng hộ em về cả tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng em xin kính chúc các thầy cô trong Khoa Hóa học- trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các thầy cô cùng các anh chị trong phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thật dồi dào sức khỏe và thành công trong công việc. Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên NGUYỄN THỊ HUYỀN LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận: “Nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ (Carica papaya)”. Dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Văn Bằng là hoàn toàn trung thực và không trùng với kết quả của tác giả khác. Sinh viên NGUYỄN THỊ HUYỀN MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3 1.1 Nghiên cứu tổng quan ................................................................................. 3 1.1.1 Thực vật học ............................................................................................. 3 1.1.2 Phân bố và sinh thái................................................................................. 4 1.1.3 Tính vị và công dụng của cây đu đủ......................................................... 4 1.1.4. Thành phần hóa học ................................................................................ 5 1.1.5. Hoạt tính sinh học ................................................................................... 6 1.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật ................................................................ 9 1.2.1 Chọn dung môi chiết ................................................................................ 9 1.2.2 Quá trình chiết ....................................................................................... 10 1.2.3 Các yếu tố ảnh ưởng tới quá trình chiết ................................................ 11 1.3 Các phương pháp sắc kí trong quá trình phân lập các hợp chất hữu cơ ... 11 1.3.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc kí ..................................................... 11 1.3.2 Cơ sở phương pháp sắc ký ..................................................................... 12 1.3.3 Phân loại phương pháp sắc ký ............................................................... 12 1.4. Một số phương pháp hóa lí xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ .. 16 1.4.1. Phổ IR.................................................................................................... 16 1.4.2 Phổ khối lượng ....................................................................................... 17 1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân .................................................................. 18 CHƢƠNG 2. MẪU THỰC VẬT VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Mẫu thực vật............................................................................................. 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 22 2.2.1. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất .................................................................................................................. 22 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất ...................................... 22 2.3. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................... 24 2.3.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết ................................................................ 24 2.3.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của hợp chất ................ 24 2.4 Hóa chất .................................................................................................... 24 CHƢƠNG 3 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ........................................ 25 3.1. Phân lập các hợp chất từ lá đu đủ đực...................................................... 25 3.2. Hằng số vật lý và dự kiện phổ các hợp chất ............................................ 27 3.2.1. Hợp chất 1 (Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside) ........................... 27 3.2.2. Hợp chất 2 (Quercetin-3--L-arabinofuranoside) ............................... 28 CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ...................................................... 29 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (Quercetin-3-O-α-Lrhamnopyranoside) .......................................................................................... 29 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2(Quercetin-3--Larabinofuranoside)........................................................................................... 33 KẾT LUẬN .................................................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các dạng sắc ký ............................................................................. 13 Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất 1 ............................................................. 32 Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất 2 ............................................................. 36 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh của cây, hoa, quả cây Đu đủ ............................................. 4 Hình 1.2: Flavan (2-phenyl chromen ) ............................................................. 8 Hình 1.3: Sambunigrin ..................................................................................... 9 Hình 1.4: Prunasin ............................................................................................ 9 Hình 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn dịch chiết metahnol từ lá đu đủ........... 25 Hình 3.2: Sơ đồ phân lập phân đoạn cây Đu đủ ............................................ 27 Hình 4.1.1:Phổ 1H của hợp chất 1 ................................................................... 29 Hình 4.1.2 :Phổ 13C của hợp chất 1 ................................................................ 30 Hình 4.1.3:Phổ 13C và DEPTcủa hợp chất 1 ................................................. 31 Hình 4.1.4: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 ................................................. 34 Hình 4.2.1 :Phổ 1H của hợp chất 2 ................................................................. 33 Hình 4.2.2: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 ................................................. 34 Hình 4.2.3 :Phổ 13C của hợp chất 2 ................................................................ 34 Hình 4.2.4: Phổ 2 chiều HSQC của hợp chất 2 .............................................. 35 Hình 4.2.5: Phổ 2 chiều HMBC của hợp chất 2 ............................................ 35 Hình 4.2.6 : Các tương tác HMBC chính (H C) của hợp chất 2 ................. 36 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TÁT 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 Carbon-13NuclearMagneticResonance Spectroscopy 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1 H-1H COSY 1 2D-NMR Phổcộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional H-1H Chemical Shift Corelation Spectroscopy NMR CC Sắc kí cột Column Chromatography DEPT Distortionless Enhancement By Polarization Transfer EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron Electron Impact Mas Spectroscopy FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombardment MasSpectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivit HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy ME Nhóm metyl MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc kí lớp mỏng Thin Layer Chromatography MỞ ĐẦU Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, có điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau. Thiên nhiên thuận lợi là điều kiện cho sự phát triển đa dạng của hệ thực vật. Từ xưa đến nay, cây cỏ đã xuất hiện trong các bài thuốc dân gian và trong đời sống của con người. Việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên là nhiệm vụ quan trọng đã và đang được các nhà khoa học cả trong nước và thế giới quan tâm với mục đích phục vụ, đáp ứng nhu cầu về y tế, nông nghiệp và các mục đích khác nhau trong sinh hoạt của con người. Thiên nhiên là nguồn cung cấp các “bài thuốc” quý hiếm và là nơi lưu trữ các chất dẫn đường để tổng hợp những bài thuốc mới. Trong quá trình nghiên cứu các chất phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã chế tạo ra những bài thuốc có khả năng phòng, chữa bệnh. Trong đó có cây đu đủ - Loại thực vật được sử dụng phổ biến có tác dụng chống oxi hóa, kích sữa, chữa tiêu chảy, giảm sưng do xuất huyết,… là một dược liệu trong bài thuốc dân gian nên cần được nghiên cứu để giải thích tác dụng chữa bệnh của cây và tạo cơ sở để tìm kiếm phương thuốc điều trị bệnh. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên tôi chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ (Carica papaya)” Với mục đích nghiên cứu thành phần flavonoid glycoside từ lá cây đu đủ và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập. Từ đó tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm các bài thuốc mới cũng như giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền Việt Nam. 1 Nhiệm vụ chính của đề tài là: 1. Thu mẫu lá cây đu đủ (Carica papaya), xử lý mẫu và tạo dịch chiết. 2. Phân lập một số hợp chất từ lá cây đu đủ (Carica papaya). 3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nghiên cứu tổng quan 1.1.1 Thực vật học Giới thiệu về thực vật học Tên thực vật: Carica papaya L. Tên thường gọi: Đu đủ Tên khác: Thù đủ, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô. Phân loại khoa học Chi Carica Họ Caricaceae hay Papayae Mô tả thực vật Đu đủ mọc thuộc loại thân mềm tự nhiên hằng năm. Cây nhỏ hoặc cây nhỡ, cao 2 - 4 m. Thân thẳng không phân nhánh, mang nhiều vết sẹo do cuống lá rụng để lại. Lá: to, mọc so le, tập trung ở ngọn, cướng rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành những thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn. Hoa: màu vàng lục nhạt, mọc ở kẽ lá; hoa đực và hoa cái cùng gốc hoặc khác gốc; cụm hoa đực dài, phân nhánh thành chùy xim, đài hợp có 5 răng ngắn, tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành 2 vòng trên ống tràng, nhụy tiêu giảm; cụm hoa cái có 2 - 3 hoa, đài và tràng gồm những bộ phận hơi dính nhau ở gốc, không có nhị lép, bầu 1 ô, nhiều lá noãn. Quả: mọng to, hình trứng ngược hoặc thuôn dài, khi chín màu vàng đỏ; hạt nhiều màu đen. 3 Hình 1.1: Hình ảnh của cây, hoa, quả cây Đu đủ 1.1.2 Phân bố và sinh thái Chi Đu đủ (Carica) có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới của Châu Mỹ, có lẽ từ vùng Nam Mexico và một số các nước láng giềng ở Trung Mỹ. Ở vùng núi cao (1500 - 3000 m), từ Panama đến Bolivia, có loài đu đủ mọc tự nhiên ( C. pubescens Linné & K. Koch) quả ăn được. Vào thế kỉ 16, người Tây Ba Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribe và một số nước Đông Á. Từ các địa điểm này cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi. Đu đủ cần nhiệt độ ấm áp khoảng 25oC với lượng mưa 100mm/tháng. Cây trồng nơi đủ ánh sáng, không bị ngập úng, đất không nhiễm phèn. Đu đủ có khả năng trổ hoa và đậu trái quanh năm, tuy nhiên hạn chế sâu bệnh, có thể bố trí trồng đu đủ vào đầu mùa mưa (tháng 4- 5). Những vùng chủ động tưới tiêu trồng vào cuối mùa mưa (tháng 10-11). [11] 1.1.3 Tính vị và công dụng của cây đu đủ Tính vị: tính hàn, vị ngọt, mùi hơi hắc. Công dụng: Lá cây đu đủ: có tác dụng chữa tiêu chảy, giảm sưng do xuất huyết, phân hủy protein gluten và tiêu hóa tốt hơn, chống ung thư, loại bỏ cơn nghiện đường, loại bỏ mụn trứng cá, các bệnh liên quan đến tuyến tiền liệt, nhuận tràng, chống lão hóa. 4 Quả cây đu đủ: có vị ngọt ,chống oxi hóa, giảm mỡ máu, tiêu hóa tốt, tăng cường đề kháng chống viêm nhiễm, kích thích sữa, tiêu đờm. Hạt đu đủ: chữa gai cột sống, hỗ trợ tiêu hóa, bảo vệ thận. Rễ đu đủ: chữa hôi chân. Nhựa đu đủ được dùng làm thuốc giun. Hoa đu đủ đực tươi hoặc phơi khô hấp với đường phèn dùng chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng hoặc mất tiếng ở người lớn,nhất là ở trẻ em. [32] 1.1.4. Thành phần hóa học Lá cây đu đủ chứa chứa khá nhiều hợp chất như: * Các enzym (enzymes): nhựa chứa khá nhiều enzym như papain, chymopapain, papaya glutamine cyclotransferase, glutaminyl-peptide-cyclo transferase, chitanase, papaya peptidase A và B, alpha-D-mannosidase và Nacetyl-beta-D-glucosaminidase. Quả chứa beta-galactosidase I, II và III, và1amino cyclopropane-1-carboxylase (ACC) oxidase, phenol-D- glucosyltransferase. *Carotenoid: Trong đu đủ chín có 19 loại carotenoid chủ yếu là cryptoxanthin (48%), beta caroten (30%), và cryptoflavin (13%), violaxanthin và zeanxanthin. * Ankaloid: Lá chứa carpinin và carpain; ruột thân có pseudo carpain. * Monoterpenoid: Quả chứa 4-terpineol, linalool và linalool oxid. * Flavonoid: Chồi non chứa quercetin, mycicetin và kaempferol. * Các khoáng chất và vitamin: calcium,sắt, magiê, phốt pho, kali, natri, kém, đồng, mangan, thiamine (B1), beta caroten ( tiền vitamin A), riboflavine (B2), niacin (B3), pantothenic Acid (B5), ascorbic Acid , vitamin E, riêng chồi còn có alpha tocopherol * Glucositolat: Trong hạt có benzyl isothiocyanat. 5 * Dầu béo của hạt chín chứa 16,97% acid béo bão hòa (gồm 11,38% palmitic, 5,25% stearic, 0,31% arachidic) và 78,63% acid béo chưa bão hòa ( 76,5% oleic và 2,13% linoleic).[28] 1.1.5. Hoạt tính sinh học Các phương pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dược lý của thực vậy được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [2, 3, 16, 27]. Hoạt tính sinh học của các bộ phận của cấy đu đủ như lá, quả, nhựa được các nhà khoa học trên thế giới công bố khá phong phú. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) công bố nghiên cứu cao lá đu đủ có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T. rubrum và Staphylococcus aureus. Cao chiết từ vỏ và hạt có tác dụng kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Shigella flexneri. Benzyl isothiocyanate phân lập từ đu đủ, ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm như Escherichia coli, Penicillium notatum và Shigella. Rễ đu đủ có tác dụng kháng khuẩn yếu [1]. Năm 2014, Hồ Thị Hà đã chứng minh hợp chất pseudocarpaine có khả năng kháng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus với IC50 = 80 µg/ml, không thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm khác ở nồng độ chất thử cao nhất là 128 µg/ml (với IC50 > 128 µg/ml) [5]. Năm 2001, Tác giả Phạm Kim Mãn và cộng sự đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG -180 ở chuột nhắt trắng. Làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [8]. Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/ml, và không có 6 tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7. Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [12]. Năm 2014, Hồ Thị Hà đã xác định được phân đoạn cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/ml), ung thư phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/ml) và ung thư vú MCF-7 (IC50 = 19,16 µg/ml). Đồng thời hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ cặn CH2Cl2 của lá đu đủ lần đầu tiên được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/ml) [5]. Ngoài những hoạt tính sinh học trên, các bộ phận khác nhau của cây đu đủ cũng đã được chứng minh có tác dụng như kháng virus sốt xuất huyết, tác dụng giảm thời gian đông máu, kháng viêm… Năm 2008, Bamidele V và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng viêm của dịch chiết cồn từ lá cây đu đủ [19]. Năm 2014, Hồ Thị Hà lần đầu tiên được chứng minh khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine (tương ứng là 386,5 và 778 RFU) ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (tương ứng 20 và 30 µg/ml) nhưng không mạnh khi so với chất đối chứng là tamoxifen (là 3100 RFU ở nồng độ thử 20 µg/ml) [5]. Lá đu đủ được sử dụng làm mền thịt khi nấu. Nhận xét chung: Như vậy, hoạt tính dược lý và thành phần hóa học của cây đu đủ đã được nghiên cứu. Tuy nhiên các công trình nghiên cứu chủ yếu là lá và quả đu đủ, các công trình nghiên cứu hoa đu đủ đực hầu như chưa công bố. 7 1.1.5.1. Các hợp chất Flavonoids Flavonoid xuất hiện cách đây 280 triệu năm ở hai loại tảo, vòng. Sự tiến hóa của Flavonoid liên quan đến quá trình yiến hóa của thực vật. Từ các loài có gỗ sơ khai đến các laoì cây bụi dẫ phát triển dẫn đến 3 sự thay đổi quan trọng về mặt cấu trức của Flavonoid: - Sự biến mất Proantoxianidin trong lá. - Sự biến mất 3 nhóm OH ở vòng benzen. - Sự thay thế Flavonol (Quercetin) bởi Flavon (Luteonin). Flavonoid là một nhóm hợp chất poliphenol, đa dạng về cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học. Chúng có mặt hầu hết ở các bộ phận của cây, đặc biệt trong các tế bào thực vật, là hợp chất được cấu tạo gồm hai vòng benzen A,B được kết nối bởi một dị vòng C với khung cacbon C6-C3-C6. Tại các vòng có đính một hay nhiều nhóm hydroxy tự do hay đã thay thế một phần. Vì vậy về bản chất chúng là các poliphenol có tính axit. Các polipphenol có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydrõy để tạo thành các phân tử ohức tạp hơn hay có thể liên kết với các hợp chất khác có trong cây như các Oza (dạng glycozit) hay protein. Các flavonoid là các dẫn xuất của 2-phenyl chromen (flavan). 2’ A 3’ B 4’ 1’ 8 9 7 5’ 2 6 3 10 5 6’ 4 C Hình 1.2: Flavan (2-phenyl chromen) 8 1.1.5.2 Hợp chất glycoside Năm 2002, David và cộng sự đã xác định được glycosid là prunasin và sambunigrin trong lá và thân đu đủ [21]. Hình 1.3: Sambunigrin Hình 1.4: Prunasin 1.2 Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật Sau khi tiến hành thu hái và xử lý làm khô mẫu, tùy thuộc vào các chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình,…) để người ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau. 1.2.1 Chọn dung môi chiết Dung môi để chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau: - Không hòa lẫn với dung môi cũ (thường dùng là nước), nghĩa là có tỉ khối khác nhiều so với dung môi cũ. - Dung môi này phải không tương tác hóa học với chất được chiết và có nhiệt độ sôi tương đối thấp. Các dung môi hay được sử dụng - Những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (lá, thân, rễ, hoa, quả, củ…) chủ yếu là clorofoc, metylen clorit và methanol. - Người ta sử dụng dung dịch nước của methanol thay vì dùng nước để chiết dịch thô từ cây. - Dietylete hiếm khi được dùng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ 9 nổ. Peroxit của dietylete dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. - Axeton có thể tạo thành axetonit nếu 1,2- cis- diol có mặt trong môi trường axit. Quá chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit, bazơ để tạo ra những sản phẩm mong muốn. Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30 - 40ºC với một vài hóa chất chịu nhiệt để có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 1.2.2 Quá trình chiết Các quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm - Chiết sử dụng bình chiết Xoclet - Chiết sắc với dung môi nước - Chiết lôi cuốn theo hơi nước Chiết ngâm được sử dụng rộng rãi. Thông thường bình chiết ngâm không sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong bình chiết khoảng 24 giờ sau đó mới lấy chất chiết ra. Cần lưu ý, sau một quá trình chiết 3 lần dung môi, cặn thu được sẽ không chứa những chất giá trị nữa. Việc kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một số cách như sau: Ví dụ: - Với các ankaloit, có thể kiểm tra sự xuất hiện của các loại hợp chất này bằng phản ứng tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như: Dragendorff, Mayer,… - Với các flavonoid thường là những hợp chất màu nên khi dịch chảy ra mà không có màu có nghĩa là đã rửa hết chất này trong quá trình chiết. 10 - Với các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. - Với các lacton của sesquitecpen và các glicozit trợ tim, phản ứng kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc sử dụng phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hidrat cacbon. Từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc. Như vậy, tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi phù hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí để đạt hiệu quả cao. 1.2.3 Các yếu tố ảnh ưởng tới quá trình chiết - Ảnh hưởng của pH - Vai trò của sựu tạo phức. - Ảnh hưởng của sự tạo rhành hợp chất ít tan. 1.3 Các phương pháp sắc kí trong quá trình phân lập các hợp chất hữu cơ Sắc ký là phương pháp phổ biến được sử dụng rất trong việc phân lập các hợp chât hữu cơ nói chung hay hợp chât thiên nhiên nói riêng. 1.3.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc kí Sắc ký là kĩ thuật phân tích chất khai thác sự khác biệt trong phân bố giữa pha động và pha tĩnh để tách các thành phần trong hỗn hợp. Các thành phần của hỗn hợp có thể tương tác với pha tĩnh dựa trên điện tích, độ tan tương đối và tính hấp phụ. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan,…). Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ thống sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. 11 Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký. 1.3.2 Cơ sở phương pháp sắc ký Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký. Ta có định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh có nồng độ n1∞ (nồng độ của dung dịch) khi nhiệt độ không đổi N∞ .b.C n= 1+b.C n: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh. N∞: Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên chất hấp phụ nào đó. b: Hằng số. C: Nồng độ của chất bị hấp phụ. 1.3.3 Phân loại phương pháp sắc ký Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc khí thành hai nhóm lớn: sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia thành các phương pháp sau: 12